陳 華,覃君霞,譚必穗,王 孜

(1.廣西師范大學化學與藥學學院,廣西桂林 541004;2.安康市中心醫(yī)院,陜西安康 725000)

隨著腫瘤的急劇生長,其內部血液供應嚴重不足,導致氧氣的輸送受到很大程度的抑制,最終使得腫瘤內微環(huán)境明顯乏氧。因此,乏氧是所有實體瘤的共同特征,它的存在也是引起腫瘤局部復發(fā)和遠處轉移的根源,并最終導致治療失敗[1]。實體瘤乏氧與腫瘤細胞內生物還原酶的活性密切相關,多種生物還原酶通常會過度表達[2,3]。此外,乏氧通常也會導致腫瘤其他微環(huán)境參數(shù)發(fā)生變化,如pH值降低、間質流體壓力升高、糖酵解和還原能力增強等[4]。因此,探索腫瘤演進過程中乏氧的發(fā)生發(fā)展規(guī)律,實現(xiàn)乏氧腫瘤的準確可視化,對惡性腫瘤的早期診斷與篩查具有重要的指導意義。

準確的乏氧成像不僅可以幫助臨床醫(yī)生盡早發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤患者,還能幫助臨床醫(yī)生制定合適的治療策略,從而改善治療效果。臨床上,將氧微電極插入易于接近的腫瘤部位以評估其乏氧水平被認為是一種“金標準”,然而該方法是一種侵入性技術,具有較大創(chuàng)傷性,不利于實時原位成像。作為識別乏氧腫瘤組織的主要手段,磁共振成像和核醫(yī)學檢測技術具有無創(chuàng)性,但這些技術存在乏氧水平誤報、對比度差、費用昂貴以及輻射污染等缺點。非侵入性分子成像正成為生命科學,以及臨床診斷和指導治療必不可少的工具,而實現(xiàn)精準成像的關鍵因素是新型探針化學的創(chuàng)新。乏氧分子探針能夠對腫瘤細胞內的乏氧環(huán)境進行特異性實時監(jiān)測,分析相關腫瘤細胞的乏氧情況,具有高選擇性、可重復性和快速響應等優(yōu)點[5,6],在腫瘤乏氧可視化研究領域得到廣泛應用[7,8]。本文系統(tǒng)總結和評述了可激活腫瘤乏氧分子探針的最新進展,包括基于硝基還原酶(Nitroreductase,NTR)、基于偶氮還原酶和基于氫醌還原酶(Quinone Oxidoreductase,hNQO1)的乏氧分子探針(圖1),并分析了各種成像探針在乏氧腫瘤精確檢測中的優(yōu)缺點。同時,總結了目前腫瘤乏氧分子探針應用過程中存在的問題,并對其未來發(fā)展趨勢進行了展望,以期進一步促進乏氧分子探針在腫瘤診療方面的應用。

圖1 腫瘤乏氧相關標志物

1 基于硝基還原酶的乏氧分子探針

NTR大量存在于腫瘤細胞、組織及實體腫瘤中,因此NTR的濃度可以很好地反映腫瘤的乏氧程度,進而作為判斷是否發(fā)生癌變的依據(jù)之一,這在臨床上有著十分重要的意義[9-11]。近年來,研究人員利用芳香硝基基團作為乏氧敏感單元,已經設計開發(fā)了多種乏氧分子探針,因此基于NTR的腫瘤乏氧分子探針逐漸成為研究熱門。在乏氧微環(huán)境下,NTR通過將芳香硝基還原為氨基,繼而引發(fā)探針波長或發(fā)光強度的變化[12-17]。

早在2015年,Sha課題組開發(fā)了一種具有高靈敏度和高選擇性的新型“開啟型”乏氧分子探針1[18],該探針由受保護的酚羥基基團和對硝基芐基部分組成(圖2),苯酚部分作為潛在供體與兩個苯并吲哚受體偶聯(lián)。研究人員發(fā)現(xiàn)探針1分子中的硝基單元在NTR作用下可快速轉化為氨基,隨后進行裂解反應并釋放出游離苯酚部分,探針1檢測過程中表現(xiàn)出獨特的顏色變化和熒光強度的增強。該檢測方法簡單快速,已成功應用于乏氧HeLa腫瘤細胞中NTR的成像,展示出對腫瘤乏氧的潛在診斷能力。

圖2 探針1-4的結構[18-21]

隨后,Yang等[19]設計合成了新型乏氧分子探針2(圖2),用于體外和體內NTR的有效光學檢測。在NTR的催化下,探針2分子中的吸電子硝基轉變?yōu)楣╇娮影被４送?探針2具有出色的靈敏度和選擇性,其中探針分子中O-C鍵斷裂確保了其選擇性的熒光增強。探針2已成功用于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、Hi5細胞以及活體腫瘤模型的乏氧檢測,證明探針2在腫瘤乏氧可視化中具有較好的應用潛力。該研究有利于揭示腫瘤乏氧與NTR之間的相互關系。

黃微等[20]利用親水性穿膜肽構建了新型腫瘤乏氧分子探針3(圖2),環(huán)狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD肽)的引入能使探針被整合素過表達的肺癌細胞高選擇性大量攝取,為其他腫瘤靶向分子探針的設計開發(fā)提供了新的思路,為腫瘤早期診斷提供了新的策略。最近,Wang等[21]開發(fā)了一種小分子NTR探針4(圖2)。探針4的合成步驟簡單,合成產率較高,可用于A549細胞中NTR的定性和定量檢測。此外,探針4還可以解析NTR濃度與乏氧程度之間的關系,Wang等[21]研究表明高壓氧輔助化療可顯著降低NTR濃度,是目前第一個用于高壓氧輔助化療期間的熒光分子探針工具。

Liu課題組設計合成了一種多功能熒光團,它具有更大的π偶聯(lián)結構,這使得其吸收和熒光發(fā)射波長紅移[22]。該熒光團可以通過在母體中引入硝基芐基吸電子基團進一步構筑乏氧分子探針5(圖3),探針5可以通過電子轉移過程淬滅其熒光發(fā)射。在與NTR反應后,探針5中的硝基被還原,然后通過重排和消除反應釋放熒光團,從而增強探針的熒光信號。因此,探針5可用于細胞和活體水平的乏氧可視化成像研究。

圖3 探針5-8的結構[22-25]

王海艷[23]以硝基為熒光猝滅團,以半花菁染料為母體,設計合成了乏氧分子探針6(圖3),探針6擁有寬線性響應范圍(0.002-1.000 μg/mL)、低檢出限(1.0 ng/mL)和高選擇性,但探針6以半花菁染料為母體,其合成產率相對偏低,對后續(xù)推廣應用限制較大。下一步的工作將以提高半花菁染料產率為核心來進一步實現(xiàn)探針6的實際轉化應用。

Ji課題組合成了用于NTR 檢測的四環(huán)喹喔啉骨架探針7(圖3)[24]。探針7對NTR表現(xiàn)出很好的敏感性和選擇性。與NTR一起孵育后,探針7可以發(fā)生硝基還原反應,然后生成氨基化合物,實現(xiàn)顯著的熒光增強和較大的斯托克斯位移。此外,探針7還能對乏氧條件下Hela細胞內的NTR酶活性進行實時監(jiān)測,是一種非常有潛力的NTR酶活性監(jiān)測分子工具。

2021年,Hong課題組基于量子化學計算設計了一種癌細胞選擇性和乏氧響應探針8(圖3)[25]。相對于缺乏葉酸或硝基芐基部分的對照物,探針8能對乏氧提供快速熒光“關閉-開啟”反應。體外共聚焦成像、流式分析以及CT26實體瘤小鼠的體內近紅外光學成像,為探針更容易被葉酸受體陽性CT26癌細胞攝取的論點提供了支持,并且在乏氧條件下能提供優(yōu)于對照的熒光“關閉-開啟”信號?；谶@些研究結果,Hong課題組認為探針8可以作為一種腫瘤靶向型乏氧激活探針,在體外和活體內直接監(jiān)測癌癥的發(fā)生和發(fā)展[25]。

本課題組在經典的含氧半花菁染料分子中,基于能量平衡策略巧妙地調控了輻射躍遷和非輻射躍遷之間的能量分布,構建了近紅外熒光/光聲雙比率型半花菁染料分子骨架[26]。硫原子的引入使得該半花菁類染料展現(xiàn)出近紅外熒光/光聲雙比率性能?；谶@種新型含硫半花菁染料分子骨架,本課題組設計合成了第一例近紅外熒光/光聲雙比率型NTR探針9(圖4),這使得腫瘤的乏氧深度精準定量可視化成為可能。

圖4 探針9的結構和響應示意圖[26]

2 基于偶氮還原酶的乏氧分子探針

偶氮還原酶是在一系列原核生物和真核生物中表達的還原型黃素酶,常指黃素單核苷酶[27]。偶氮還原酶可以還原偶氮化合物,這種還原過程高度依賴于乏氧的程度。因此,除了芳香族硝基化合物之外,偶氮衍生物也可以是另一種潛在的乏氧感應單元。偶氮衍生物對光具有明顯的敏感性,在藥物遞送和生物檢測中可以作為酶的獨特響應候選物[28]。在光激發(fā)后,偶氮衍生物中偶氮鍵超快的構象變化使其本身熒光猝滅[29]。因此大多數(shù)偶氮衍生物通常是非熒光的,常用作熒光團的猝滅劑,但可以通過偶氮還原酶還原裂解偶氮鍵為氨基[30],使其熒光恢復。

2010年,日本科學家Kiyose等[31]報道了近紅外乏氧分子探針10(圖5)。在常氧狀態(tài)下,探針10的偶氮鍵不會被還原,其熒光被淬滅;在乏氧環(huán)境下,偶氮被還原后吸收減弱,熒光共振能量轉移效率下降,引發(fā)探針較大的熒光增強。探針10可用于乏氧細胞的熒光成像、活小鼠肝臟和腎臟缺血實時監(jiān)測。但該淬滅劑不易進行進一步的化學修飾,限制了探針10的生物應用。

圖5 探針10-13的結構[31-34]

Qian課題組報道了一種“開啟”型乏氧熒光探針11(圖5)[32]。由于羅丹明B對偶氮-萘二甲酰亞胺單元具有熒光共振能量轉移效應,所以探針11本身的熒光非常微弱。在乏氧條件下,由于淬滅結構的崩解,偶氮鍵消失,探針11在581 nm處的熒光逐漸增強。循環(huán)伏安還原電位和產物質譜驗證結果表明,探針11可以快速被還原。共聚焦熒光成像顯示,探針11在乏氧細胞和常氧細胞之間的熒光強度差異可達9倍,表明該探針在乏氧腫瘤細胞檢測中有很大的應用價值。

2019年,Tan課題組合成了含有偶氮的乏氧激活型熒光探針12(圖5)[33]。探針12在乏氧狀態(tài)下的熒光強度較常氧狀態(tài)下增加了約11倍。進一步的抑制劑實驗結果表明,偶氮還原酶并不是唯一可以參與偶氮鍵還原過程的生物還原酶。探針12在腫瘤細胞的不同乏氧狀態(tài)中表現(xiàn)出較高的氧敏感性,可作為體內乏氧檢測的潛在分子工具。

Wu課題組開發(fā)了一種可以特異性響應腫瘤乏氧的熒光和光聲雙模態(tài)探針13(圖5)[34]。偶氮基團在乏氧條件下被裂解,釋放出活性藥物,同時探針13在710 nm附近顯示出強烈的熒光?；罨臒晒鈭F可用于熒光和光聲雙模態(tài)檢測、腫瘤乏氧成像,釋放的藥物可以高效抑制荷瘤小鼠模型中的腫瘤。這項工作不僅可以為腫瘤乏氧提供熒光和光聲雙模態(tài)成像,還可以實現(xiàn)腫瘤的有效抑制。因此,該診療一體化探針的構建可以為發(fā)展其他腫瘤生物標志物探針和腫瘤治療提供一定的參考。

Zhou課題組基于偶氮鍵設計開發(fā)了新型腫瘤診療探針14(圖6)[35]。在偶氮還原酶的作用下, 探針14在620 nm處呈現(xiàn)紅色熒光發(fā)射,同時釋放抗腫瘤藥物,從而達到乏氧成像和腫瘤治療的綜合效果。此外,探針14在裸鼠腫瘤抑制實驗中成功地抑制了實體瘤的生長。探針14作為一種新的熒光工具,可以快速確定腫瘤的位置和邊緣,在臨床癌癥治療中顯示出較大的潛力。

圖6 探針14和15的結構[35,36]

Ribagorda課題組報道了基于BODIPY熒光團與偶氮基團結合的乏氧分子探針15(圖6)[36]。探針15可以在還原條件下(包括細菌和人源偶氮還原酶)逐漸開啟其熒光發(fā)射特性。使用固定化的細菌偶氮還原酶可以有效評估偶氮乏氧分子探針15的傳感性能。熒光顯微鏡成像實驗結果表明,偶氮乏氧分子探針15可用于可視化活細胞內的乏氧微環(huán)境。

3 基于氫醌還原酶的乏氧分子探針

hNQO1是一種同源二聚體黃素酶,可促進各種醌衍生物還原為對苯二酚形式。目前已知hNQO1對細胞氧化損傷具有一定的抗氧化修復作用,但是hNQO1過表達也會導致代謝紊亂和癌癥發(fā)生。與正常組織相比,在許多癌癥組織中可以觀察到更高水平的hNQO1。醌基是乏氧敏感基團,作為有效的乏氧識別單元之一,近幾年來逐漸被引入乏氧分子探針的構建和設計當中。

2013年,McCarley課題組基于萘酰亞胺衍生物與醌基底物共價結合合成了一種乏氧分子探針16(圖7)[37]。熒光發(fā)光抑制是通過萘酰亞胺報告基團和共價連接的醌基酶底物之間獨特的光誘導電子轉移來實現(xiàn)的,通過快速去除醌淬滅劑可以恢復染料的熒光。該探針可通過肉眼、流式、光學成像快速區(qū)分hNQO1陰性和陽性細胞系,也能夠快速識別不同類型的腫瘤細胞,展示了其靈敏度和選擇性都較高的突出特點。2015年,該課題組在上述熒光探針16的基礎上,又發(fā)展了一種用于檢測hNQO1的探針17(圖7)[38]。探針17與hNQO1響應后的熒光亮度提高了136倍。此外,探針17在10 min內即可將hNQO1陽性細胞與陰性細胞區(qū)分開,展示了探針17可用于快速和實時分析的潛力。2016年,McCarley課題組基于半萘酚羅丹明熒光團繼續(xù)開發(fā)了一種能夠檢測hNQO1的探針18(圖7)[39]。將探針18分別與hNQO1陽性和hNQO1陰性肺癌細胞系(HT29)共孵育,結果僅在hNQO1陽性HT29細胞系中呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光。可見,該探針及其衍生物在熒光引導手術成像和癌組織切除術等方面具有一定的應用前景。

圖7 探針16-19的結構[37-40]

大多數(shù)報道的熒光探針容易受到內源性熒光物質干擾,且穿透深度不足。針對這些問題,Jiang課題組最近設計了雙光子hNQO1探針19(圖7)[40]。在hNQO1作用下,探針19底物部分被催化還原,熒光團釋放出來,502 nm處的綠色熒光逐漸增強。探針19在單雙光子激發(fā)下與hNQO1反應前后熒光增強均超過25倍,斯托克斯位移增加超過100 nm。同時,細胞和組織實驗結果表明,探針19可對內源性hNQO1進行成像,且選擇性和靈敏度高,具有極好的組織穿透和染色能力。因此,該探針在癌癥診斷和成像引導手術中具有很大的應用潛力。

Son等[41]設計了新型乏氧化學發(fā)光分子探針20(圖8),該探針可以區(qū)分不同癌癥亞型。探針20包含二氧雜環(huán)丁烷部分和醌基響應部分。將醌基部分還原為相應的對苯二酚形式會產生化學發(fā)光信號。從體外細胞培養(yǎng)分析和體內小鼠成像研究的組合推斷,該探針是安全的,幾乎沒有毒性,并且能夠在hNQO1陽性A549肺癌模型中產生“開啟”化學發(fā)光反應,可用于識別以hNQO1水平升高為特征的癌細胞和腫瘤組織。

圖8 探針20-23的結構[41-44]

Kobayashi課題組報道了一種檢測腹膜卵巢癌轉移(Peritoneal Ovarian Cancer Metastases,POCM)的乏氧分子探針21(圖8)[42]。探針21在hNQO1作用下展示出強烈的近紅外熒光信號,且對腹膜卵巢癌轉移表現(xiàn)出非常高的靈敏度和特異性。同時,研究表明SHIN3腫瘤組織在噴灑探針21后熒光強度顯著增加。由于近紅外光具有更深的組織穿透能力和更小的自發(fā)熒光背景干擾能力,這種新方法有可能識別組織深處的微小病變,表明該探針在POCM的研究上具有潛在的應用價值。

Best等[43]報道了一種用于檢測癌癥相關酶 hNQO1的探針22(圖8)。細胞熒光成像實驗表明,該探針在hNQO1陽性細胞系和hNQO1陰性細胞系中熒光差異明顯,在hNQO1陽性細胞系中熒光強度隨著hNQO1活性水平的增加而逐漸增加,而在hNQO1陰性細胞系中熒光很微弱,幾乎沒有變化。該探針具有極高的熒光開啟能力,被用于hNQO1高表達的結直腸癌細胞和卵巢癌細胞的熒光成像,在成像引導手術切除病變組織中具有較好的應用價值。

最近,Beharry課題組通過酰胺鍵將醌基底物共價連接到熒光母體合成了乏氧熒光探針23(圖8)[44]。通過熒光監(jiān)測反應證明,在hNQO1作用下探針23在500 nm處的熒光強度增加了5.5倍。在A549細胞和H596細胞的熒光共聚焦實驗中,hNQO1高表達的A549細胞中綠色熒光明顯更亮。另外探針23的熒光團可以產生單線態(tài)氧,可見該探針在癌癥診療方面具有很大的應用前景。

Punganuru等[45]將二氰基異佛爾酮與醌丙酸偶聯(lián)制備得到hNQO1探針24(圖9),該探針能夠在體外和體內的模型中監(jiān)測hNQO1活性。在被腫瘤特異性hNQO1激活之前探針保持非熒光狀態(tài)。探針24在響應后展示出較大的斯托克斯位移、良好的生物相容性和對hNQO1的高選擇性,可以有效區(qū)分癌細胞和健康細胞。研究人員也成功地利用該探針在體外監(jiān)測腦腫瘤細胞和裸鼠異種移植腫瘤中的內源性hNQO1活性。

圖9 探針24-27的結構[45-48]

Tang課題組基于共價組裝策略,通過在單個分子中引入對硝基苯和三甲基鎖醌丙酸基團,構建了雙酶響應型探針25(圖9)[46]。該探針僅在NTR和hNQO1共同存在的情況下才能被激活,原位生成熒光染料,產生較大的熒光響應,從而達到檢測活細胞中的內源性NTR和hNQO1活性的目的。共聚焦成像實驗表明,探針25能將癌細胞與正常肝HL-7702細胞區(qū)分開來,因為癌細胞中存在相對較高水平的內源性生物還原酶。然而探針25相對較短的發(fā)射波長限制了其進一步的臨床應用。

2022年,Zhao課題組報道了一種用于檢測hNQO1的雙光子探針26(圖9)[47]。將探針26與HeLa、LoVo兩種細胞進行孵育,均顯示出顯著的熒光信號增強現(xiàn)象。將探針26注射到HeLa異種移植荷瘤裸鼠的腫瘤組織中,通過體內熒光成像檢測hNQO1活性,0.5 h后腫瘤組織內能檢測到強的熒光信號,表明探針26可用于腫瘤內源性hNQO1活性測定。

近期,Song課題組報道了一種用于檢測異種移植A549腫瘤中異常表達的 hNQO1化學發(fā)光探針27(圖9)[48]。探針27不僅能在雞胸肉組織中(15 mm深度)實現(xiàn)高信噪比成像檢測,而且還能靈敏地檢測到A549細胞中過表達的hNQO1。研究表明探針27已成功用于可視化皮下異種移植腫瘤中異常表達的 hNQO1。這是第一例報道的通過近紅外區(qū)域化學發(fā)光模式檢測hNQO1活性的工作。

4 展望

本文系統(tǒng)總結了酶反應型腫瘤乏氧分子探針的設計策略、開發(fā)及腫瘤診療應用。值得欣慰的是,在這個研究領域目前已經取得了許多實質性的進展,使得使用現(xiàn)代光學成像技術對腫瘤乏氧微環(huán)境進行無創(chuàng)成像成為可能。例如,為了提高腫瘤識別的準確性,研究人員巧妙地構建了具有多模式信號輸出或多靶點級聯(lián)響應的乏氧分子探針?；谔囟ǖ纳镞€原酶,使用分子探針可以點亮轉移性腫瘤的小病變,為準確手術切除提供導航,有效降低復發(fā)風險。

雖然近年來用于腫瘤乏氧酶反應型分子探針有了長足的發(fā)展,然而大多數(shù)嘗試仍處于概念驗證階段。在將這些概念從實驗室成功轉化為臨床技術之前,該領域的研究人員仍面臨著巨大的挑戰(zhàn),未來仍有許多問題需要解決。(1)近紅外熒光團主要集中在近紅外一區(qū)(650-900 nm)。相比之下,近紅外二區(qū)(1 000-1 700 nm)的熒光團具有更優(yōu)異的光學特性,如更深的組織穿透性和更高的信噪比,這將更好地服務于診斷和醫(yī)療領域。然而,使用近紅外二區(qū)熒光團構建腫瘤乏氧分子探針的報道很少,這在很大程度上限制了腫瘤發(fā)生、進展和增殖的原位研究。(2)在分子水平上腫瘤發(fā)生是由復雜的分子調控和多種酶的過表達引起的。不幸的是,迄今為止開發(fā)的大多數(shù)腫瘤乏氧分子探針都無法區(qū)分腫瘤細胞類型。因此,基于級聯(lián)反應的多靶點酶激活熒光探針將為體內特定癌細胞和腫瘤的鑒定提供策略。(3)針對特定酶的反應基團和相關傳感機制的類型有限。特別的是,分子探針很難選擇性地識別同一還原酶家族的不同亞型。研究表明,通過分子對接開發(fā)新的識別位點將有利于構建高選擇性的腫瘤乏氧分子探針。(4)由于組織穿透深度不足,使用單一成像模式從體內獲得的有效信息受到限制。酶響應型多模式探針具有成像模式互補的優(yōu)勢,將成為腫瘤診斷和治療的強有力的分子工具。(5)腫瘤乏氧反應型分子探針的應用比較簡單,大多僅用于細胞和小鼠成像。雖然一些探針已經用于腫瘤切除,但這只是冰山一角。因此,為了使更多的分子探針獲得批準并在臨床使用,生物學家、化學家和外科醫(yī)生需要跨學科密切合作,以加速這些探針在醫(yī)學診斷和癌癥治療中的實際應用。希望本文總結的原理和展望可為腫瘤乏氧分子探針的未來發(fā)展提供有益的見解,并為腫瘤的臨床診斷和治療提供新的應用方向。