董文靜 戴盡波 聶榮榮 沈 潔 葉彩平 蔡智濤

(梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所,廣東 梅州 514071)

丙烯酰胺(acrylamide)為不飽和酰胺[1],其單體具有多種毒性及潛在致癌性[2-3]。丙烯酰胺暴露量0.000 5 mg/kg為常人每天允許的最大暴露量。世界衛(wèi)生組織(WHO)指出,丙烯酰胺對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的損傷作用[4],具有神經(jīng)毒性[5]。國(guó)際腫瘤機(jī)構(gòu)(IARC)將其認(rèn)定為2A類致癌物[6]。

丙烯酰胺廣泛存在于各種食品中,尤其是經(jīng)高溫加工的富含淀粉類食品,其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過飲用水中規(guī)定的限量(0.5 μg/kg)[7]。2002年瑞典國(guó)家食品管理局與斯德哥爾摩大學(xué)研究人員[8]在一些油炸和燒烤的淀粉類食品中檢測(cè)到丙烯酰胺, 之后英國(guó)、挪威、美國(guó)、澳大利亞、新西蘭、加拿大等國(guó)家也報(bào)道了類似檢測(cè)結(jié)果[9-10]。2019年5月,國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心將丙烯酰胺的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)納入2020年食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃之中[11]。油炸食品中丙烯酰胺含量最高[12],一般在加工溫度高于100 ℃時(shí)才會(huì)產(chǎn)生丙烯酰胺,且隨著高溫烹飪時(shí)間的延長(zhǎng)丙烯酰胺的生成量逐漸增多[13]。

食品中丙烯酰胺的檢測(cè)方法通常有液相色譜法、液相色譜—質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜法、光譜法等。氣相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)需對(duì)分析物進(jìn)行衍生化處理,前處理操作復(fù)雜,相對(duì)費(fèi)時(shí),不適宜大批量的處理分析。液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法可有效排除檢測(cè)物中雜質(zhì)的影響,回收率較高,但對(duì)儀器要求高。液相色譜在傳統(tǒng)反相吸附柱中選擇性略低,適用于油炸、烘烤等丙烯酰胺含量高的食品檢測(cè)[14-21]。QuEChERS法是一種快速、簡(jiǎn)便,對(duì)試驗(yàn)器材和試劑要求不高的前處理方法。林濤等[22]使用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了咖啡中丙烯酰胺含量;歐陽小艷等[23]使用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測(cè)定了焙烤蛋糕中的丙烯酰胺含量。研究擬將新型材料碳十八碳鍵合鋯膠(Z-Sep+)與C18應(yīng)用于油炸食品中丙烯酰胺測(cè)定的前處理中,建立一種采用QuEChERS方法進(jìn)行前處理,高效液相色譜和二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定的檢測(cè)方法,以期為油炸食品中丙烯酰胺的篩查監(jiān)測(cè)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、丙酮、甲醇:色譜純,美國(guó)ACS恩科化學(xué);

C18:40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司;

PSA:天津博納艾杰爾科技有限公司;

Z-Sep+:美國(guó)Supelco公司;

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品:1 000 μg/mL,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;

餅干中丙烯酰胺分析質(zhì)控樣品:MRM0276,北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司;

炸薯片:樂事薯片有限公司;

炸芋圓、炸馓子、炸南瓜圓:市售。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀:LC-20AT型,配備SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器,日本島津公司;

電子分析天平:AUW220型,日本島津公司;

全自動(dòng)平行濃縮儀:AutoEVA-60型,?？萍瘓F(tuán)股份有限公司;

高速冷凍離心機(jī):ST16R型,美國(guó)Thermo Fisher公司;

調(diào)速多用振蕩器:HY-4型,金壇市宏華儀器廠;

超純水系統(tǒng):Milli Q型,美國(guó)Millipore公司。

1.3 樣品前處理

油炸食品經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過40目篩,于-18 ℃貯藏備用。稱取2 g經(jīng)粉碎后的油炸食品,加入10 mL正己烷脫脂,7 000 r/min離心5 min,棄去上層清液,待樣品中殘余正己烷完全揮發(fā)后加入10 mL甲醇,振搖30 min,7 000 r/min離心5 min,吸取8 mL上清液,加入150 mg Z-Sep+及200 mg C18,渦旋凈化1 min,7 000 r/min離心5 min,吸取7 mL上清液,室溫氮吹至干,用1 mL超純水復(fù)溶,過0.45 μm尼龍66濾膜,上機(jī)待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱為Capcell PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為超純水;柱溫25 ℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)197 nm;等度洗脫比例:5% A+95% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化材料的選擇

采用Plackett-Burman試驗(yàn)(n=12),考察PSA用量、C18用量、Z-Sep+用量 3個(gè)因素在QuEChERS前處理方法中的凈化效果,試驗(yàn)因素水平見表1,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

由表2可知,單獨(dú)使用PSA凈化時(shí),回收率最低,甚至低于未使用凈化材料的對(duì)照組,隨著Z-Sep+和C18的加入,回收率有不同程度的上升,Z-Sep+和C18配合使用的回收率高于單獨(dú)使用時(shí)的。為了更直觀地體現(xiàn)3種凈化材料的使用對(duì)回收率的影響,運(yùn)用Minitab 18軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,以回收率作為響應(yīng)值,結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)化帕累托圖表示(見圖1)。

基準(zhǔn)參照線表示99%置信區(qū)間(P<0.01)

由圖1可知,C18和Z-Sep+的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)值超過了基準(zhǔn)參照線,表明這兩個(gè)因素對(duì)回收率影響顯著,影響丙烯酰胺回收率因素顯著性為C18> Z-Sep+。與未使用Z-Sep+的處理組相比,使用Z-Sep+處理后的色譜圖雜質(zhì)峰更小;而使用PSA處理后,在緊挨著丙烯酰胺色譜峰的位置之后出現(xiàn)了一個(gè)巨大的雜質(zhì)峰,可能是PSA本身引入的雜質(zhì),導(dǎo)致信噪比與回收率降低。后續(xù)試驗(yàn)以C18和Z-Sep+兩種因素作為主要因素進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 凈化材料比例與提取溶劑的選擇

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)C18用量、Z-Sep+用量、提取溶劑的選擇進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。由于丙烯酰胺屬于食品中內(nèi)源性污染物[24],為充分考察待優(yōu)化因素的真實(shí)提取效率和凈化效果,使用丙烯酰胺分析質(zhì)控樣品作為試驗(yàn)樣品,以測(cè)量值與質(zhì)控樣品真實(shí)值間的誤差準(zhǔn)確度,誤差越小,代表準(zhǔn)確度越高。試驗(yàn)因素水平見表3,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表4可知,以乙腈作為提取溶劑時(shí)誤差普遍偏高,說明以丙酮或甲醇作為提取溶劑更合適。當(dāng)C18用量提高時(shí),誤差的變化趨勢(shì)逐漸減小;當(dāng)Z-Sep+用量變化時(shí),誤差的變化趨勢(shì)不易直觀看出。為了更直觀地體現(xiàn)兩種凈化材料在不同用量時(shí)對(duì)誤差的影響,以及不同提取溶劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的優(yōu)劣程度,使用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,以準(zhǔn)確度的估算邊際均值為縱坐標(biāo),單因素變量為橫坐標(biāo),繪制方差的單變量分析圖如圖2所示。

圖2 準(zhǔn)確度與提取溶劑、C18用量、Z-Sep+用量的方差分析圖

由圖2可知,當(dāng)Z-Sep+用量增大時(shí),誤差反而升高,可能是由于過量Z-Sep+吸附了部分待測(cè)物使結(jié)果偏離真值。當(dāng)C18用量為50～200 mg時(shí),誤差隨C18用量的增加而減小,說明C18對(duì)油炸食品中雜質(zhì)的吸附效果較好,在此范圍內(nèi)增加C18用量可以有效減少結(jié)果誤差。C18和Z-Sep+吸附的雜質(zhì)種類不同,配合使用時(shí)可凈化樣品中大部分雜質(zhì),凈化效果優(yōu)于單獨(dú)使用。使用甲醇作為提取溶劑時(shí),提取效率最高,誤差最小,丙酮其次,乙腈的提取效率最低。因此,最佳提取條件為甲醇為提取溶劑,Z-Sep+用量75 mg, C18用量200 mg。

2.3 流動(dòng)相比例的選擇

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),甲醇—水、乙腈—水均有較好的分離效果,試驗(yàn)選擇甲醇—水為流動(dòng)相,通過考察不同體積比(V甲醇∶V水為30∶70,20∶80,10∶90,5∶95,2∶98)下甲醇—水的分離效果來確定最佳的流動(dòng)相比例。

由圖3可知,隨著流動(dòng)相中水所占比例的升高,丙烯酰胺的保留時(shí)間也逐漸后移,當(dāng)V甲醇∶V水為30∶70～10∶90時(shí),丙烯酰胺的保留時(shí)間為2～4 min;當(dāng)V甲醇∶V水上升至5∶95時(shí),丙烯酰胺的保留時(shí)間為4.302 min;當(dāng)V甲醇∶V水為2∶98時(shí),丙烯酰胺的保留時(shí)間為4.928 min。由圖4可知,樣品中的雜質(zhì)峰主要集中在2～4 min,丙烯酰胺保留時(shí)間若晚于4 min有利于待測(cè)物與雜質(zhì)更好的分離。當(dāng)V甲醇∶V水為5∶95時(shí),丙烯酰胺峰面積最大,響應(yīng)值最高。常立偉等[25]采用高效液相色譜法測(cè)定薯?xiàng)l中的丙烯酰胺,所用流動(dòng)相V甲醇∶V水為0.5∶99.5,與試驗(yàn)結(jié)果接近。但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水的比例并非越高越好,結(jié)合保留時(shí)間與響應(yīng)值,選擇V甲醇∶V水為5∶95作為丙烯酰胺檢測(cè)的流動(dòng)相。

圖3 不同流動(dòng)相比例下液相色譜圖

圖4 QuEChERS法提取炸芋圓中丙烯酰胺的高效液相色譜圖

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由圖5可知,丙烯酰胺在190～250 nm處均有吸收,最大吸收波長(zhǎng)為197.56 nm。通過不同波長(zhǎng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的響應(yīng)值與信噪比也可看出,197 nm下丙烯酰胺的峰面積與信噪比最大。因此,選用197 nm作為丙烯酰胺的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖5 丙烯酰胺在190～300 nm的吸收光譜圖

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 配制質(zhì)量濃度為0.1～2.0 mg/L的一系列丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.4的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以丙烯酰胺峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=92 039.8X+1 068.39,R2=0.999 4,檢出限為0.007 mg/kg,定量限為0.02 mg/kg,與GB 5009.204—2014中規(guī)定的定量限(0.01 mg/kg)接近,且大大簡(jiǎn)化了使用儀器和前處理過程,可以滿足日常油炸食品中丙烯酰胺含量的篩查與監(jiān)測(cè)。

2.5.2 精密度和穩(wěn)定性 稱取6份丙烯酰胺質(zhì)控樣,按1.3的方法進(jìn)行前處理,結(jié)果表明,該方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.66%,重復(fù)性良好。

選取一份待測(cè)樣品,分別在制備后的0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果顯示丙烯酰胺的日內(nèi)精密度為1.00%,表示樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。選取一份待測(cè)樣品,分別在制備后的0,1,2 d進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果顯示丙烯酰胺的日間精密度為0.14%,表示樣品溶液可在3 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5.3 回收率 在丙烯酰胺質(zhì)控樣中添加丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心發(fā)布的《食品中丙烯酰胺的危險(xiǎn)性評(píng)估》中列出的不同食品的丙烯酰胺含量可知,大部分油炸食品的丙烯酰胺含量為0.2～1.0 mg/L。試驗(yàn)在0.2,0.5,1.0 mg/L 3個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表5。

表5 丙烯酰胺的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表5可知,當(dāng)加標(biāo)量為0.2～1.0 mg/L時(shí),樣品回收率均>90%,RSD均<2%,說明試驗(yàn)方法回收率良好,精密度高,結(jié)果穩(wěn)定。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

由表6可知,4種不同食品基質(zhì)的油炸食品中,以土豆片為基質(zhì)的炸薯片中的丙烯酰胺含量最高,其次是以南瓜絲為基質(zhì)的炸南瓜圓,兩種炸品的丙烯酰胺含量均>0.5 mg/kg。以芋頭絲為基質(zhì)的炸芋圓中的丙烯酰胺含量相對(duì)較低,含量最低的為以小麥粉面團(tuán)為基質(zhì)的炸馓子。食品原料對(duì)油炸食品中丙烯酰胺含量的影響為土豆片>芋絲>南瓜絲>面團(tuán)。由于南瓜含有天然色素,導(dǎo)致炸南瓜圓的樣品提取液顏色較黃,經(jīng)凈化后顏色變淺,并未影響試驗(yàn)結(jié)果,說明試驗(yàn)方法對(duì)含有一定量色素的樣品同樣具備較好的檢測(cè)能力,可以適應(yīng)多種不同油炸食品中丙烯酰胺含量的檢測(cè)。

表6 不同油炸食品中丙烯酰胺含量

3 結(jié)論

研究采用新型材料碳十八鍵合鋯膠(Z-Sep+)結(jié)合C18作為凈化材料應(yīng)用于油炸食品中丙烯酰胺含量的測(cè)定,建立了一種簡(jiǎn)便、高效的QuEChERS前處理方法。與傳統(tǒng)方法相比,試驗(yàn)方法打破了丙烯酰胺檢測(cè)中使用QuEChERS前處理必須配備質(zhì)譜檢測(cè)器的固定模式,在簡(jiǎn)化前處理過程的同時(shí),降低了對(duì)儀器的要求,可以滿足日常對(duì)油炸食品中丙烯酰胺的篩查監(jiān)測(cè)工作,尤其適合儀器條件有限的基層檢測(cè)單位和一些經(jīng)費(fèi)有限的研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行油炸食品中丙烯酰胺含量的科研監(jiān)測(cè)工作。后續(xù)可以此為延伸,對(duì)凈化材料進(jìn)行更多的調(diào)整,為其他食品中丙烯酰胺含量的測(cè)定提供依據(jù)。