張富生王宇宸盧禮生鄧家軍陳俊松楊琳芬郭 靜吳仁偉賴衛(wèi)華

(1. 江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,江西 南昌 330077;2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室,江西 南昌 330047;3. 九江市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,江西 九江 332000)

恩諾沙星屬于喹諾酮類廣譜抗菌藥,對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有良好的抗菌作用,在降低畜禽動物的發(fā)病率和死亡率等方面起到十分顯著的作用,已成為現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)中不可缺少的藥物之一[1]。但是,畜牧業(yè)中濫用恩諾沙星和超標(biāo)使用恩諾沙星的現(xiàn)象普遍存在[2-3],其后果一方面是導(dǎo)致動物性食品中存在獸藥殘留,影響人類的健康;另一方面,各種養(yǎng)殖場大量排泄物向周圍環(huán)境排放,獸藥又成為環(huán)境污染物,給生態(tài)環(huán)境帶來不利影響[4]。

中國對獸藥使用和殘留污染防控非常重視,GB 31650—2019和GB 31650.1—2022對各種食品中的獸藥殘留有明確限量規(guī)定,其中恩諾沙星在魚、家禽、豬、牛、羊和其他動物組織中不得超過100 μg/kg,在禽蛋中不得超過10 μg/kg。

目前,恩諾沙星的主要檢測方法有高效液相色譜法[5-6]、質(zhì)譜聯(lián)用法[7-10]、表面增強拉曼散射法[11-14]、酶聯(lián)免疫吸附法[15-16]和免疫層析檢測方法[17-21]等。其中, GB/T 21312—2007是確證方法,可以對恩諾沙星進行精確定量檢測,但其設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、檢測成本高、周期長等,因而無法滿足大批量樣本快速篩查的需要。目前,國家對食品安全的重視程度不斷提高,對快速檢測產(chǎn)品的需求越來越大,對食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)的要求越來越嚴(yán)格,對食品安全快速檢測方法靈敏度的要求也隨之提高。靈敏度要求非常高的情況下,傳統(tǒng)的快檢方法通過肉眼進行顏色深淺的判斷,主觀性強,容易造成誤差,出現(xiàn)較多的假陽性和假陰性結(jié)果,也無法提供數(shù)字化結(jié)果[22-24]。

量子點微球熒光免疫層析法是一種新型快速檢測技術(shù)[25]。使用結(jié)構(gòu)性能和光學(xué)性能優(yōu)異的量子點熒光微球作為標(biāo)記物,基于競爭抑制免疫層析技術(shù)原理,通過便攜式熒光讀取儀進行數(shù)據(jù)讀取和分析,根據(jù)已設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中待測物質(zhì)含量,對動物源性食品中金剛烷胺進行定量檢測,提高了檢測靈敏度,實現(xiàn)了對目標(biāo)物的數(shù)字化檢測,減少了人為因素導(dǎo)致的假陽性或假陰性結(jié)果。國家市場監(jiān)督管理總局2023年1月發(fā)布了《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測使用的意見》[26],研究擬參照其附件4《食品快速檢測產(chǎn)品符合性評價技術(shù)要求》,對恩諾沙星(雞蛋)量子點微球免疫層析試紙條快檢產(chǎn)品進行符合性評價,以期為雞蛋中恩諾沙星的現(xiàn)場快速篩查提供產(chǎn)品選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

干式熒光免疫分析儀:AF-100型,激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為365,610 nm,江西維邦生物科技有限公司;

恒溫孵育器:DH-200型,武漢鐘瑞生物科技有限公司;

天平:ZT-2型,0.01 g,上海贊維衡器有限公司;

振蕩器:JC-25型,金壇區(qū)白塔金昌實驗儀器廠;

掌上離心機:Meteor 7.2k型,寧波拓普森科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 主要材料

150個經(jīng)參比方法檢測為陰性的雞蛋樣本:市售;

50個與確證方法比較的實際雞蛋樣本:江西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專項監(jiān)測的50批次雞蛋樣品,編號為1～50;

恩諾沙星(雞蛋)量子點微球免疫層析試紙條:定量檢測范圍為2.5～40.0 μg/kg,江西維邦生物科技有限公司;

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、馬坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、達氟沙星、二氟沙星、氟甲喹、噁喹酸和沙拉沙星等標(biāo)準(zhǔn)品:德國DR.E公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 盲樣樣本制備 按照GB 31650.1—2022要求,雞蛋中恩諾沙星的最大殘留限量為10 μg/kg。依據(jù)《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測使用的意見》中附件4《食品快速檢測產(chǎn)品符合性評價技術(shù)要求》制備加標(biāo)樣本。使用經(jīng)參比方法檢測為陰性的雞蛋樣本進行加標(biāo),因恩諾沙星屬于有國家限量要求的物質(zhì),制備3個濃度水平的加標(biāo)樣本。空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)限量要求的0.5倍濃度水平加標(biāo)樣本用以評價快檢方法的假陽性率,每個濃度水平的樣本50份,標(biāo)準(zhǔn)限量要求1倍濃度水平的加標(biāo)樣本50份,用以考察快檢方法的假陰性率。

1.2.2 量子點微球免疫層析試紙條的樣本前處理和檢測方法

(1) 樣本前處理:取樣部分按GB 31650 執(zhí)行(將雞蛋去殼后攪勻),準(zhǔn)確稱取4 g樣本于50 mL離心管中,加入3 mL恩諾沙星樣本提取劑,漩渦振蕩混勻2 min,4 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取100 μL上清于離心管中,加入500 μL恩諾沙星樣本稀釋液混勻,離心2 min,上層溶液即為備用待測液。

(2) 檢測方法:測試前打開干式熒光免疫分析儀,將產(chǎn)品ID卡插入儀器讀取產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線,將恒溫孵育器設(shè)置反應(yīng)溫度為37 ℃,反應(yīng)時間為10 min。檢測時將恩諾沙星量子點微球熒光免疫層析快速檢測卡平放至恒溫孵育器上,用移液器吸取90 μL備用待測液加入檢測卡加樣孔中,37 ℃孵育10 min,反應(yīng)結(jié)束后將檢測卡插入干式熒光免疫分析儀檢測卡槽中進行數(shù)據(jù)讀取,儀器會自動給出測試結(jié)果。

1.2.3 靈敏度評價 檢測恩諾沙星加標(biāo)濃度為10 μg/kg的樣本50份,并按式(1)計算靈敏度。

(1)

式中:

P+——靈敏度,%;

N11——檢出陽性結(jié)果的陽性樣品數(shù);

N1——總陽性樣品數(shù)。

1.2.4 交叉反應(yīng)率評價 在空白樣本中添加環(huán)丙沙星、馬坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星和諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品,使其終質(zhì)量濃度為1 000 μg/L,用恩諾沙星量子點微球熒光免疫層析快速檢測試劑盒檢測,記錄檢測結(jié)果為陽性的最小濃度,并按式(2)計算交叉反應(yīng)率。

(2)

式中:

CR——交叉反應(yīng)率,%;

C1——目標(biāo)物質(zhì)檢出限,μg/L;

C2——干擾物質(zhì)檢出陽性時的最小質(zhì)量濃度,μg/L。

1.2.5 假陰性率和假陽性率評價 依據(jù)《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測使用的意見》中附件4《食品快速檢測產(chǎn)品符合性評價技術(shù)要求》,分別按式(3)、式(4)計算所有檢測結(jié)果中的假陰性率和假陽性率。

(3)

(4)

式中:

N12——陽性樣品的陰性結(jié)果數(shù);

N1——總陽性樣品數(shù);

N21——陰性樣品的陽性結(jié)果數(shù);

N2——總陰性樣品數(shù)。

1.2.6 實際雞蛋樣本的檢測比較 50個實際雞蛋樣本分別用GB/T 21312—2007和量子點微球免疫層析試紙條快檢方法進行檢測,并比較結(jié)果符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度

由表1可知,檢出陽性結(jié)果的陽性樣品數(shù)占總陽性樣品數(shù)的百分比為100%,即靈敏度為100%。

表1 標(biāo)準(zhǔn)限量要求1倍濃度水平雞蛋(10 μg/kg)的量子點微球免疫層析試紙條檢測結(jié)果

2.2 交叉反應(yīng)率

由表2可知,恩諾沙星(雞蛋)量子點微球免疫層析試紙條在檢測氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、馬坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、達氟沙星、二氟沙星、氟甲喹、噁喹酸和沙拉沙星時,交叉反應(yīng)率均<0.1%。

表2 量子點微球免疫層析試紙條的交叉反應(yīng)率

2.3 假陰性率和假陽性率

由表3、表4可知,恩諾沙星量子點微球免疫層析試紙條在檢測雞蛋中恩諾沙星時,50個空白樣品的檢測結(jié)果均為陰性,50個標(biāo)準(zhǔn)限量要求的0.5倍濃度水平盲樣的檢測結(jié)果出現(xiàn)50個陰性,100個陰性盲樣雞蛋的整體假陽性率為0%。50個標(biāo)準(zhǔn)限量要求的1倍濃度水平盲樣的檢測結(jié)果均為陽性,即量子點微球免疫層析試紙條的假陰性率為0%。

表3 空白樣品雞蛋量子點微球免疫層析試紙條檢測結(jié)果?

表4 標(biāo)準(zhǔn)限量要求的0.5倍濃度水平雞蛋(5 μg/kg)量子點微球免疫層析試紙條檢測結(jié)果

2.4 實際雞蛋樣本檢測方法比較

由表5可知,采用液質(zhì)聯(lián)用法檢測時,5、36、40、42號樣品的檢測結(jié)果分別為0.73,0.57,5.57,21.90 μg/kg,其他樣品均未檢出。采用量子點微球免疫層析試紙條檢測時,40、42號樣品檢測結(jié)果分別為5.34,22.02 μg/kg,其他樣品均未檢出(量子點微球免疫層析試紙條的定量檢測限為2.5 μg/kg),說明液質(zhì)聯(lián)用法和量子點微球免疫層析試紙條檢測結(jié)果的符合率較高。

表5 實際雞蛋樣本檢測方法的比較?

3 結(jié)論

通過對恩諾沙星量子點微球熒光免疫層析產(chǎn)品評價,結(jié)果顯示該方法可以滿足GB 31650.1—2022雞蛋中恩諾沙星殘留的國家限量要求,其靈敏度為100%,假陰性率為0%,假陽性率為0%,實際雞蛋樣本檢測時,與國家參比方法符合率高(GB/T 21312—2007)。量子點微球熒光免疫層析法檢測準(zhǔn)確度高、特異性好,產(chǎn)品操作簡便、快速且可以同時出具定性結(jié)果和數(shù)字化檢測結(jié)果,適合雞蛋中高風(fēng)險因子的大批量樣本現(xiàn)場篩查。后續(xù)可以基于量子點微球熒光免疫層析平臺,建立更多的雞蛋中獸藥殘留的快速檢測方法。