劉通，李雁，徐紅日，李雅莉，郝丹丹，劉鳳儀，楊麗娟

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院急診科，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)膿毒癥研究所，北京 100029）

銅綠假單胞菌（PA）是院內(nèi)感染最常見(jiàn)的條件致病菌之一，易引發(fā)醫(yī)院獲得性肺炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎，也是支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病患者繼發(fā)感染的常見(jiàn)致病菌[1]。PA 耐藥形勢(shì)一直不容樂(lè)觀，高耐藥率導(dǎo)致了高多重耐藥（MDR）檢出率，中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)（CARST）研究2019—2020 革蘭氏陰性菌監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示[2]，MDRPA 檢出率為39.7%，且來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病房的菌株耐藥率還要高出近10%。這使得治療藥物的選擇壓力日益增加。國(guó)外研究顯示，PA 肺炎的病死率約為25%～39%，而MDRPA患者的病死率更是高達(dá)40%～70%[3]。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，PA 肺炎患者治療總體有效率為38.3%，而MDRPA治療有效率僅為28.6%[4]。因此，亟需探索更加有效的抗菌藥物，但抗菌藥物研發(fā)周期長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌耐藥的速度。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)且不易耐藥等優(yōu)勢(shì)，已被證實(shí)具有直接體外抑菌/逆轉(zhuǎn)耐藥作用，還能聯(lián)合抗菌藥物發(fā)揮協(xié)同作用。扶正透邪解毒化瘀方是本課題組在周平安、姜良鐸和王成祥教授等呼吸熱病專(zhuān)家指導(dǎo)下，根據(jù)課題組前期臨床總結(jié)的耐藥菌肺炎“正氣虧虛、毒瘀互結(jié)”的基礎(chǔ)病機(jī)[5]，以臨床療效顯著[6]的扶正解毒化瘀方為基礎(chǔ)組方而成。課題組前期研究結(jié)果顯示，該方1 倍和2 倍等效劑量含藥血清聯(lián)合亞胺培南后[7]，使亞胺培南對(duì)MDRPA的最小抑菌濃度（MIC）由16 μg/mL 降至8 μg/mL和4 μg/mL；對(duì)于頭孢他啶[7]，聯(lián)合1 倍和2 倍等效劑量含藥血清后，MIC 由16 μg/mL 降至8 μg/mL 和4 μg/mL；對(duì)于環(huán)丙沙星[8]，聯(lián)合1 倍等效劑量含藥血清后，MIC 由4 μg/mL 降至2 μg/mL。然而，該方體外抑菌/逆轉(zhuǎn)耐藥的藥效學(xué)基礎(chǔ)和直接/協(xié)同機(jī)制尚不清楚。研究擬通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從藥物作用靶點(diǎn)層面對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抑制/逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的中藥新藥提供客觀依據(jù)，這對(duì)減輕抗菌藥物的選擇壓力具有重要的研究意義。

1 材料

1.1 藥物與試劑扶正透邪解毒化瘀方（金銀花、赤芍、瓜蔞、連翹、黃芩、漏蘆、生黃芪、西洋參、當(dāng)歸、生甘草、薏苡仁、敗醬草），采用北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥全成分配方顆粒劑，購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部；試劑：甲醇（質(zhì)譜級(jí)）、乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、甲酸（質(zhì)譜級(jí)）均購(gòu)自美國(guó)Fisher Chemical 公司；超純水由Millipore 純水系統(tǒng)進(jìn)行純化。

1.2 主要儀器高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Scientific，U3000），高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB Sciex，TripleTOF5600+），真空離心濃縮儀（德國(guó)Eppendorf，Concentrator plus），分析天平（瑞士Sartorius，BP211d），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter，Microfuge 22R Centrifuge），掌上離心機(jī)（美國(guó)Scilogex，D1008），渦旋儀（美國(guó)Scilogex，MX-S）。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)、分析平臺(tái)/軟件及作圖工具中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，https：//old．tcmsp -e．com/tcmsp．php）、Cytoscape 3．9．1 軟件、uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www．uniprot．org/）、Stitch 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stitch．embl．de/）String 數(shù)據(jù)庫(kù)https：//cn．string -db．org/）、DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david -d．ncifcrf．Gov）、微生信作圖（ http：//www．bioinformatics．com．cn/）。

2 方法

2.1 定性鑒定扶正透邪解毒化瘀方樣品制備將中藥全方顆粒劑研磨、混勻后，準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg 中藥樣本于2 mL 的離心管中；加入400 μL 冷甲醇（含內(nèi)標(biāo)），渦旋振蕩2 min；加入2 粒鋼珠，4 ℃下50 Hz研磨4 min；使用超聲探頭萃取30 min；渦旋振蕩2 min，4 ℃靜置10 min，14 000 g 離心15 min（離心半徑10 cm）；取上清液離心濃縮后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行上機(jī)分析前，將離心濃縮后的提取液樣本，用100 μL 的20%甲醇/水溶液復(fù)溶，振蕩至完全溶解后離心取上清液，進(jìn)行正、負(fù)離子模式分析。

2.2 色譜條件質(zhì)譜正離子模式色譜條件：色譜柱為美國(guó)Waters 公司BEH C8 柱（1．7 μm，2．1×100 mm）；柱溫：50 ℃；流動(dòng)相A：水（含0．1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈（含0．1%甲酸）；采用梯度洗脫（0～1 min，95% A；1～24 min，0%～95%A；24～27．5 min，0% A；27．5～30 min，0%～95% A），流速：0．35 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜負(fù)離子模式色譜條件：色譜柱為美國(guó)Waters 公司HSS T3 柱（1．8 μm，2．1×100 mm）；柱溫：50 ℃；流動(dòng)相A：水（含6．5 mmol/L 碳酸氫銨）；流動(dòng)相B：95%甲醇水（含6．5 mmol/L 碳酸氫銨）；采用梯度洗脫（0～1 min，95% A；1～18 min，0%～95% A；18～22 min，0% A；22～25 min，0%～95% A），流速：0．35 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件加熱電噴霧（ESI）離子源，在正負(fù)離子下，采用質(zhì)譜一級(jí)全掃描+ DDA 二級(jí)子離子掃描模式。噴霧電壓：3．8 kV（正離子）、-3 kV（負(fù)離子）；離子傳輸管溫度：320 ℃；輔助氣加熱溫度：350 ℃；鞘氣流速：35 Arb；輔助氣流速：8 Arb；離子透鏡射頻電壓：50 V；掃描質(zhì)量范圍（m/z）：70～1 050；全ms分辨率：70 000；MS/MS 分辨率：17 500；最大響應(yīng)離子：5；碰撞能量：20、40 eV。

2.4 LC-MS/MS 數(shù)據(jù)分析和篩選將檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入大連達(dá)碩與中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所聯(lián)合開(kāi)發(fā)的化合物快速鑒定分析系統(tǒng)OSI/SMMS 對(duì)化合物進(jìn)行自動(dòng)鑒定。根據(jù)TCMSP 提供的理化性質(zhì)指標(biāo)和類(lèi)藥性指標(biāo)設(shè)定依據(jù)[9]，將鑒定后的化合物中口服生物利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0．18、Caco-2 滲透率≥-0．4、半衰期（HL）≥4的化合物篩選出來(lái)，作為研究的候選活性分子。

2.5 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中扶正透邪解毒化瘀方化學(xué)成分篩選篩選標(biāo)準(zhǔn)同上：OB≥30%、DL≥0．18、Caco-2≥-0．4、HL≥4。

2.6 扶正透邪解毒化瘀方和抗菌藥物化學(xué)成分作用于銅綠假單胞菌靶點(diǎn)收集將2．4 項(xiàng)與2．5 項(xiàng)中得到的化學(xué)成分進(jìn)行匯總?cè)ブ?，通過(guò)Stitch 數(shù)據(jù)庫(kù)查找上述成分以及亞胺培南、頭孢他啶、環(huán)丙沙星作用于銅綠假單胞菌的蛋白靶點(diǎn)；使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)校正篩選得到靶點(diǎn)的名稱(chēng)；并通過(guò)Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“中藥—化學(xué)成分—作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。

2.7 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI） 將2.6 項(xiàng)中得到的扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Pseudomonas aeruginosa”，“medium confidence=0.4” 為篩選條件，將獲取的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，根據(jù)度值（degree）篩選出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.8 扶正透邪解毒化瘀方與抗菌藥物的協(xié)同作用機(jī)制分析篩選出扶正透邪解毒化瘀方、亞胺培南、頭孢他啶、環(huán)丙沙星聯(lián)合作用于銅綠假單胞菌的蛋白靶點(diǎn)，通過(guò)韋恩圖進(jìn)行可視化分析。

2.9 扶正透邪解毒化瘀方功能富集分析通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）功能富集分析；利用微生信平臺(tái)將結(jié)果進(jìn)行可視化操作。

3 結(jié)果

3.1 扶正透邪解毒化瘀方化學(xué)成分分析及篩選結(jié)果將數(shù)據(jù)導(dǎo)入OSI/SMMS 系統(tǒng)進(jìn)行峰提取、峰匹配等質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，根據(jù)質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間，從該方中共鑒定出108 個(gè)化學(xué)成分，以黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸、甾醇類(lèi)等為主，具體見(jiàn)圖1 和 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）。共有20 個(gè)化學(xué)成分符合篩選條件（OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、HL≥4）。

圖1 扶正透邪解毒化瘀方正/負(fù)離子模式總離子流圖Fig.1 Negative and positive total ion chromatogram of Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

3.2 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中扶正透邪解毒化瘀方化學(xué)成分篩選結(jié)果按照OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、HL≥4 條件，共篩選出155 種化學(xué)成分。

3.3 中藥和抗菌藥物化學(xué)成分作用于銅綠假單胞菌靶點(diǎn)收集結(jié)果將3.1 項(xiàng)與3.2 項(xiàng)中篩選得到的化學(xué)成分進(jìn)行合并、去重，共得到162 個(gè)化學(xué)成分，其中42 個(gè)化學(xué)成分能夠通過(guò)Stitch 數(shù)據(jù)庫(kù)找到直接作用于銅綠假單胞菌的靶蛋白240 個(gè)，根據(jù)度值大小，以度值大于中位數(shù)8 共篩選出17 項(xiàng)，以黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)為主，還包括三萜類(lèi)、生物堿類(lèi)；其中β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素度值顯著高于其它化學(xué)成分，推測(cè)這些可能為扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的核心化學(xué)成分，見(jiàn)圖2 和表1。亞胺培南、頭孢他啶和環(huán)丙沙星對(duì)銅綠假單胞菌分別有22 個(gè)、18 個(gè)和47 個(gè)直接作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

表1 扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌的主要化學(xué)成分Tab.1 The main chemical constituents of Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula acting on Pseudomonas aeruginosa

圖2 中藥—化學(xué)成分—作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Drug-component-traget network

圖3 抗菌藥物作用于銅綠假單胞菌的靶點(diǎn)Fig.3 Targets of antibacterial drugs acting on Pseudomonas aeruginosa

3.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選在String 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入240 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，運(yùn)用“Network Analysis”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，依?jù)“度值”“中介中心性”和“接近中心性”3 個(gè)參數(shù)均大于平均值共篩選出10 個(gè)扶正透邪解毒化瘀方干預(yù)銅綠假單胞菌的潛在核心靶點(diǎn)，見(jiàn)表2。

表2 扶正透邪解毒化瘀方干預(yù)銅綠假單胞菌的潛在核心靶點(diǎn)Tab.2 Potential core targets of Pseudomonas aeruginosa intervention with Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

3.5 中藥與抗菌藥物的協(xié)同作用機(jī)制分析利用韋恩圖對(duì)4 種藥物作用靶點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，扶正透邪解毒化瘀方分別與亞胺培南、頭孢他啶、環(huán)丙沙星有3 個(gè)、3 個(gè)和17 個(gè)共同作用靶點(diǎn)；4 種藥物共同作用靶點(diǎn)2 個(gè)；扶正透邪解毒化瘀方特異性作用靶點(diǎn)222 個(gè)；共同作用靶點(diǎn)主要作用于細(xì)菌能量和生化代謝、DNA 遺傳物質(zhì)復(fù)制、蛋白質(zhì)功能、表面多糖形成等途徑，還可以影響與細(xì)菌多重耐藥性形成密切相關(guān)的AmpC（β-內(nèi)酰胺酶）靶點(diǎn)。見(jiàn)圖4、表3。

表3 中藥與抗菌藥物共同作用靶點(diǎn)信息Tab.3 Information on the common targets of action of Chinese medicines and antibacterial drugs

圖4 中藥與抗菌藥物共同作用靶點(diǎn)數(shù)目Fig.4 Number of targets for intervention with Chinese medicine and antibacterial drugs

3.6 GO 及KEGG 通路富集分析結(jié)果GO 富集分析共得到條目24 個(gè)（P＜0.05），其中生物過(guò)程（BP）條目8 個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目6 個(gè)，分子功能（MF）條目10 個(gè)。BP 中主要涉及ATP 合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA 拓?fù)渥兓⒅|(zhì)代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)折疊、dTDP-鼠李糖生物合成過(guò)程等過(guò)程；CC 中主要涉及膜、染色體、質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)的外在成分等組分；MF中主要涉及氧化還原酶活性、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合酶活性、ATP 結(jié)合、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ型（ATP 水解）活性[DNA topoisomerase typeⅡ（ATP-hydrolyzing）activity]等過(guò)程，見(jiàn)圖5。

圖5 扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌相關(guān)靶點(diǎn)GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of Pseudomonas aeruginosa-related targets by Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

KEGG 富集分析共篩選出8 條信號(hào)通路（P＜0.05）。主要涉及甘油磷脂代謝、代謝途徑、氧化磷酸化、生物素代謝、聚酮糖生物合成、核糖生物合成、O-抗原核糖生物合成、硫代謝等通路。此外，富集結(jié)果還包括脂肪酸代謝、抗生素如鏈霉素生物合成等通路，見(jiàn)圖6。

圖6 扶正透邪解毒化瘀方作用于銅綠假單胞菌相關(guān)靶點(diǎn)KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of Pseudomonas aeruginosa-related targets by Fuzheng Touxie Jiedu Huayu Formula

4 討論

銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制分為天然耐藥、獲得性耐藥和適應(yīng)性耐藥3 類(lèi)[10]。鑒于其較高的檢出率和復(fù)雜的耐藥機(jī)制帶來(lái)的臨床抗感染難題，世衛(wèi)組織于2017 年將其列入新型抗生素研發(fā)重點(diǎn)病原體清單[11]。目前，MDRPA 的抗感染藥物治療原則主要根據(jù)藥敏報(bào)告選擇抗PA 活性強(qiáng)的抗菌藥物進(jìn)行單獨(dú)或聯(lián)合用藥，但MDRPA 對(duì)非限制使用級(jí)和限制使用級(jí)抗菌藥物往往耐藥，特殊使用級(jí)抗菌藥物也存在療效上的不確定性。中藥具有不良反應(yīng)小、不易耐藥、抑制病原體、調(diào)節(jié)宿主免疫等優(yōu)勢(shì)，在作為抗菌藥物的補(bǔ)充和替代品上有重要的潛力[12]。

LC-MS/MS 結(jié)果顯示，扶正透邪解毒化瘀方共鑒定出108 個(gè)化學(xué)成分，以黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸、甾醇類(lèi)等為主，而這幾類(lèi)化學(xué)成分對(duì)多重耐藥菌均具有較好的抑菌作用。黃酮類(lèi)如黃芩苷可直接抑制PA 生物膜生成、減少多糖蛋白復(fù)合物產(chǎn)量及抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)的表達(dá)[13]，與左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用可增強(qiáng)對(duì)生物被膜的破壞作用[14-15]。萜類(lèi)如熊果酸對(duì)多種細(xì)菌具有直接抑菌作用，可與萬(wàn)古霉素、諾氟沙星以及β-內(nèi)酰胺藥物發(fā)揮協(xié)同作用[16]。有機(jī)酸類(lèi)如咖啡酸、綠原酸可以干擾PA 群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，抑制生物被膜形成[17-18]。關(guān)于甾醇類(lèi)抗菌活性的研究報(bào)道較少，云杉樹(shù)皮提取物對(duì)PA 有直接抑菌作用[19]，氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)提取物中含有較高含量的植物甾醇；麥角甾醇可以增加氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的抗真菌活性，但在細(xì)菌中尚未有類(lèi)似報(bào)道，為后續(xù)研究提供了方向[20]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，β-谷甾醇、槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素度值較高，在扶正透邪解毒化瘀方抑制/逆轉(zhuǎn)MDRPA 耐藥性的過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。β-谷甾醇對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌均具有直接抑制作用，是未來(lái)開(kāi)發(fā)抗菌藥物的潛在候選者[21]。槲皮素與阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松等抗菌藥物聯(lián)用具有協(xié)同抗MDRPA 的作用，機(jī)制與抑制生物被膜形成、群體感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)[22]。槲皮素和木犀草素還可以誘導(dǎo)TonB 依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)PA 對(duì)鐵載體藥物的敏感性，而新型抗菌藥物頭孢地爾正是一種鐵載體頭孢菌素類(lèi)藥物[23]。木犀草素還可以有效抑制PA 生物被膜的形成和運(yùn)動(dòng)性，機(jī)制與減弱群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)分子和基因的表達(dá)水平有關(guān)[24]。黃檳榔青的樹(shù)皮提取物可以增強(qiáng)諾氟沙星對(duì)PA 的抗菌活性，而山奈酚和槲皮素是提取物的主要化學(xué)成分[25]。黃芩素在亞抑菌濃度下通過(guò)下調(diào)PA 群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)，抑制了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和生物被膜形成能力[26]。說(shuō)明扶正透邪解毒化瘀方中多種成分不僅可以直接抑制PA，還可以與多種抗菌藥物發(fā)揮協(xié)同作用，干預(yù)生物被膜和群體感應(yīng)系統(tǒng)可能是其主要作用機(jī)制。

通過(guò)分析扶正透邪解毒化瘀方相關(guān)化學(xué)成分和抗菌藥物作用于PA 的共同靶點(diǎn)來(lái)看，該方對(duì)抗菌藥物起協(xié)同作用主要與干預(yù)細(xì)菌生化代謝、DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)功能、表面多糖形成等機(jī)制相關(guān)。IspA（香葉基轉(zhuǎn)移酶）是異戊二烯的催化酶，蛋白質(zhì)在異戊二烯化過(guò)程中被翻譯修飾為功能蛋白，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等活動(dòng)[27]。IspA 突變會(huì)導(dǎo)致PA 對(duì)妥布霉素、慶大霉素和阿米卡星的最小抑菌濃度升高2倍[28]。細(xì)菌DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶和DNA 回旋酶同屬于Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，是喹諾酮類(lèi)藥物抗革蘭氏陰性菌的主要靶標(biāo)。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶IV 在DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中負(fù)責(zé)控制DNA 拓?fù)錉顟B(tài)；DNA 回旋酶由gyrA 和gyrB 亞基組成，前者負(fù)責(zé)DNA 鏈的結(jié)合、斷裂和重新連接，后者負(fù)責(zé)ATP 酶的活性。DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ和gyrA 的突變?cè)黾恿薖A 對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥性[29-30]。PA 3228/0806（ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié)合蛋白/滲透酶）參與包括PA 在內(nèi)的多種革蘭氏陰性菌O 抗原的合成過(guò)程，而O 抗原是脂多糖的主要構(gòu)成部分，可保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體、細(xì)菌素等的殺滅作用[31]。MsbA轉(zhuǎn)運(yùn)體屬于ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，通過(guò)利用ATP 結(jié)合和水解的力量，促進(jìn)脂多糖的合成和細(xì)菌活力，阻斷其轉(zhuǎn)運(yùn)活性或許能夠同時(shí)阻斷ATP 酶活性，在成為新型抗菌藥物靶標(biāo)上具有一定的吸引力[32]。

PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果提示，扶正透邪解毒化瘀方干預(yù)PA 的核心靶點(diǎn)除了上述提到的gyrA 外，還包括dnaK、fabZ 和fabA 等已知的參與PA 耐藥過(guò)程的關(guān)鍵靶點(diǎn)。DnaK 蛋白是由ATP 酶活性介導(dǎo)的分子伴侶，是介導(dǎo)PA 在內(nèi)的革蘭氏陰性菌應(yīng)激反應(yīng)、保持細(xì)菌完整性的重要蛋白，誘導(dǎo)其突變可增強(qiáng)MDR 菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[33]。FabZ 和fabA是參與細(xì)菌Ⅱ型脂肪酸合成途徑的酶，已被用作抗多種病原體的廣譜藥物靶點(diǎn)，黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)抑制fabZ 活性進(jìn)而對(duì)PA 產(chǎn)生直接抑菌作用[34]。

GO 和KEGG 富集分析提示，扶正透邪解毒化瘀方的作用靶點(diǎn)主要與調(diào)節(jié)細(xì)菌能量和生化代謝、調(diào)控DNA/蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、影響細(xì)菌胞質(zhì)胞膜以及干預(yù)對(duì)細(xì)菌起保護(hù)作用的表面多糖和生物被膜合成等密切相關(guān)。ZHOU D P 等[35]通過(guò)基因編輯技術(shù)干預(yù)PA，并用高通量測(cè)序（RNA-Seq）發(fā)現(xiàn)，857 個(gè)上調(diào)基因與氧化還原過(guò)程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)代謝、甘油磷脂代謝、氧化還原酶活性等途徑密切相關(guān)，本研究也得到了類(lèi)似的結(jié)果。細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)之一，具有DNA 復(fù)制、酶分泌、生物成分合成和能量生產(chǎn)等功能[19]。Ⅱ型DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶相關(guān)功能在上文中已經(jīng)論述，以其為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的二堿四氫吡喃化合物對(duì)PA 顯示出直接抑制作用[36]。Rha（鼠李糖脂）是細(xì)菌多糖的常見(jiàn)成分，例如脂多糖、胞外多糖、莢膜多糖和細(xì)胞壁多糖。dTDP-Rha 是最重要的糖前體之一，在許多生物過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[37]。

綜上，研究通過(guò)LC-MS/MS 技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了扶正透邪解毒化瘀方單獨(dú)及與抗菌藥物聯(lián)用干預(yù)銅綠假單胞菌耐藥性的藥效物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)和機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的干預(yù)特點(diǎn)。潛在的起主要干預(yù)作用的化學(xué)成分以黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)、萜類(lèi)為主，主要干預(yù)機(jī)制包括抑制生物被膜和群體感應(yīng)系統(tǒng)以及影響銅綠假單胞菌能量和生化代謝、DNA 復(fù)制、蛋白質(zhì)功能、表面多糖生成等相關(guān)。目前，關(guān)于中藥抗細(xì)菌耐藥性的研究大多停留在宏觀層面，較少細(xì)化到化學(xué)成分層面；而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)既往常用于探索藥物和疾病之間的潛在聯(lián)系，研究綜合LC-MS/MS 和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)探索藥物具體化學(xué)成分對(duì)病原體的直接作用，為從天然藥物中開(kāi)發(fā)抗菌藥物提供了一定的思路和借鑒。同時(shí)，從藥物作用靶點(diǎn)層面為日后深入研究該方做出了積極的探索。