李賀，姬寒蕊，杜雅薇，吳圣賢

（1．山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250355；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性多因素血管性疾病，是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)[1]。頸動脈粥樣硬化與冠狀動脈粥樣硬化分別是AS 在頸動脈和冠狀動脈的體現(xiàn)，與缺血性腦卒中、急性冠脈綜合征的風(fēng)險和嚴(yán)重程度直接相關(guān)[1-3]，大幅增加了居民病死率，已成為影響居民身體健康的主要因素，消退AS 斑塊對維護(hù)居民的健康和減輕社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)具有重要意義。高脂血癥是AS 的主要危險因素，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）是改善AS，預(yù)防心腦血管疾病并發(fā)癥的關(guān)鍵手段[4-5]。中藥有著多靶點、副作用小的優(yōu)勢，或能成為改善AS 的重要替代或補(bǔ)充方案。內(nèi)消軟脈湯2 號是在課題組“脈生痰核”理論[6-7]指導(dǎo)下，以化痰散結(jié)為主要治法，選用大量的化痰散結(jié)藥化裁而來的自擬方劑，內(nèi)消軟脈湯2 號在臨床上治療頸動脈粥樣硬化及高脂血癥獲得了良好療效。前期實用性隨機(jī)對照試驗發(fā)現(xiàn)，該方可使頸動脈橫切斑塊厚度平均下降11．48%[8]，但其內(nèi)在機(jī)制尚不明確。故研究以內(nèi)消軟脈湯2 號為基礎(chǔ)治療方案，通過建立ApoE-/-小鼠的AS 模型，探究內(nèi)消軟脈湯2 號對AS、高脂血癥的改善效果，并初步探究其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 動物6 周齡雄性ApoE-/-小鼠30 只，基因背景為C57BL/6J，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2020-0004。實驗動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院SPF 級標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物室，環(huán)境溫度為22 ℃，相對濕度45%～55%，12 h 光照與12 h 黑夜循環(huán)，動物自由進(jìn)食水。

1.2 藥劑與試劑內(nèi)消軟脈湯2 號顆粒劑組成：靈芝30 g、玄參15 g、丹參15 g、黃連9 g、浙貝母9 g、生牡蠣9 g、當(dāng)歸9 g、制乳香9 g、制沒藥9 g，本次實驗所需顆粒劑由東直門醫(yī)院顆粒劑藥房全成分提取制作。磷酸鹽緩沖液粉末（pH 7．3，中杉金橋公司）；4%多聚甲醛溶液（東都凱源有限公司）；中性快干膠；油紅O 染液；蛋白酶抑制劑；二奎啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒；丙烯酰胺；三羥基氨基甲烷Tris 堿；甘氨酸；1 mol/L Tris-HCl（pH 7．4）緩沖液；1．5 mol/L Tris- HCl（pH 8．8）緩沖液；1 mol/L Tris-HCl（pH 6．8）緩沖液；吐溫-20；SDS；過硫酸銨（普利萊公司）；TEMED（Sigma 公司）；預(yù)染蛋白Maker（普利萊公司）；麗春紅染色液（普利萊公司）；硝酸纖維素膜（NC 膜）（普利萊公司）；封閉專用脫脂奶粉（普利萊公司）；蛋白免疫印跡法（Western Blot）專用雜交袋（普利萊公司）；發(fā)光液（碧云天公司）；EASYBIO 易杰膜（易杰公司）；GADPH 抗體（Abcam 公司）；解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）抗體（Abcam 公司）；LDLR 抗體（Abcam 公司）；戊巴比妥鈉（北京東都凱源生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器動物恒溫飼養(yǎng)箱（北京福意聯(lián)公司）；制冰機(jī)（型號：MV600，Scotsman 公司）；多功能酶標(biāo)儀（BIO-RAD 公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus BX60，Olympus 公司）；-20 ℃冰箱（德國Siemens 公司）；精密電子稱（JA1003N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電泳槽及電泳儀（北京六一儀器廠）；塑料薄膜封口機(jī)（SF-200/250 型，溫州市興業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司）；低溫離心機(jī)[5424/5424R（FA-45-24-11，Eppendorf 公司]。

1.4 模型制備、分組和干預(yù)30 只ApoE-/-小鼠常溫適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)將小鼠平均分為3 組，每組10 只，分別為對照組、內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量組、高劑量組。每組均給予高脂飲食（配方：21%脂肪+0．15%膽固醇，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司）喂養(yǎng)16 周，以建立AS 模型[9]。各組在造模之初分別給予蒸餾水灌胃、內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量[2．1 g/（kg·d）]灌胃、內(nèi)消軟脈湯2 號高劑量[4．2 g/（kg·d）]灌胃，以蒸餾水灌胃組作為對照，干預(yù)16 周后取材，取材前禁食水12 h。干預(yù)期間各組小鼠繼續(xù)接受高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)。鑒于環(huán)境溫度對脂解作用有明顯影響，本研究將采用環(huán)境動物飼養(yǎng)箱，全程控制并恒定飼養(yǎng)溫度。

實驗中所有動物飼養(yǎng)條件以及動物實驗操作均嚴(yán)格遵守北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院重點學(xué)科實驗室動物實驗倫理委員會制定的制度規(guī)定。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 主動脈AS 斑塊采用油紅O 染色及改良Movat 五色套染的方法進(jìn)行觀察。小鼠在處死前保持空腹8 h。使用生理鹽水配制好6．7 mg/mL 的戊巴比妥鈉，以0．01 mL/g 小鼠體重的劑量進(jìn)行腹腔注射，待麻醉成功后進(jìn)行手術(shù)處理，自心臟開始，小心地將主動脈于脊柱進(jìn)行剝離，將小鼠主動脈與心臟一起取下，放于4%的多聚甲醛固定液中加以固定。根據(jù)油紅O 染液試劑盒說明書步驟進(jìn)行整根動脈染色。在主動脈根部切下大約5 mm 的長度并將其與心臟組織分離并置于石蠟組織的包埋盒中，通過自動脫水石蠟組織制作儀、石蠟切片器進(jìn)行血管的石蠟切片制備，后按照改良Movat 五色套染的試劑盒說明書進(jìn)行染色。

1.5.2 血脂4 項采用摘眼球取血法采集小鼠血液，室溫靜置1 h，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8．4 cm，收集上層血清。每只小鼠取200～300 μL 血清，采用生化法檢測TG、LDL-C、HDL-C及總膽固醇（TC）。

1.5.3 肝臟脂肪變性程度采用油紅O 染色的方法進(jìn)行觀察。取小鼠新鮮肝臟置于軟塑瓶蓋中，并添加適當(dāng)?shù)腛CT 包埋劑，之后再把小盒慢慢地放入液態(tài)氮里，當(dāng)組織結(jié)冰成小塊狀，將已結(jié)冰的組織置入恒冷箱切片機(jī)中進(jìn)行冷凍切片制備。按照油紅O 染液試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色。

1.5.4 肩胛脂肪組織活化情況采用蘇木素-伊紅（HE）染色的方法進(jìn)行觀察。將小鼠肩胛脂肪組織取出，置于石蠟組織的包埋盒中，通過自動脫水石蠟組織制作儀、石蠟切片器進(jìn)行血管的石蠟切片制備，進(jìn)行HE 染色。

1.5.5 組織病理學(xué)圖片采集通過對各樣品的病理染色，得到了血管斑塊區(qū)域的切片、肝臟切片、脂肪組織切片等。采用高倍顯微鏡對切片進(jìn)行拍照，在每張切片上觀察到多個區(qū)域后，確定最接近平均水平的區(qū)域進(jìn)行拍照并保存圖像，各個圖像的全部參數(shù)都經(jīng)過均一化處理。

1.5.6 肩胛脂肪組織UCP1 及肝臟低密度脂蛋白受體（LDLR）的表達(dá)采用Western Blot 法檢測小鼠肩胛脂肪組織UCP1 及LDLR 的表達(dá)。將組織蛋白裂解液加入各組小鼠的肝臟及肩胛脂肪組織中，快速研磨，置冰上20 min，然后置于4 ℃低溫離心機(jī)中、12 000 r/min 離心10 min，離心半徑8．4 cm，取上清，采用BCA 法測定組織蛋白含量后加上樣緩沖液，置于沸水中煮5 min；分別取40 μg 蛋白量的組織總蛋白樣品上樣，80 V 濃縮膠電泳，100 V 分離膠電泳；采用半干電轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，恒流30 mA，90 min，5%TBS-T 脫脂奶粉封閉1 h，用UCP1 和LDLR 一抗稀釋后孵育過夜（UCP1 抗體稀釋倍數(shù)：1∶500；LDLR 抗體稀釋倍數(shù)：1∶500），二抗稀釋后孵育1 h（稀釋倍數(shù)：1∶5 000），洗膜后加入ECL 混合液中5 min 溫育，置于X 光片盒中；將已曝光的膠片放入顯影液中顯影，直至出現(xiàn)清晰影像，再將膠片放入定影液中定影，清水沖洗，晾干保存，掃描。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件系統(tǒng)對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入并進(jìn)行分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠AS 的影響為探究內(nèi)消軟脈湯2 號是否可以改善ApoE-/-小鼠的AS，本研究通過油紅O 染色的方法對小鼠整個主動脈進(jìn)行觀察，同時通過改良Movat 五色套染的方法對小鼠主動脈根部進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，與高脂飲食+蒸餾水對照組（HFD 組）比較，內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量組及高劑量組小鼠整個主動脈斑塊改善，見圖1、圖2、圖3。

圖1 各組小鼠主動脈的油紅O 染色結(jié)果Fig.1 Oil Red O staining results of mouse aorta in each group

圖2 各組小鼠的主動脈HE 染色（×50）Fig.2 HE staining of the aorta in each group of mice（×50）

圖3 各組小鼠的主動脈改良Movat 五色套染（×50）Fig.3 Modified Movat five color staining of the aorta in each group of mice（×50）

2.2 內(nèi)消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠血脂4 項的影響為探究內(nèi)消軟脈湯2 號是否可以改善ApoE-/-小鼠的高脂血癥，研究通過生化法對小鼠血中LDL-C、TC、TG、HDL-C 的水平進(jìn)行檢測。與HFD組相比，內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量組的血清LDL 下降31.61%（P<0.05）、TC 下降23.9%（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。綜合來看，內(nèi)消軟脈湯2 號具有降低LDL-C 及TC 的功效。

圖4 各組小鼠的血脂4 項水平（±s，n=10）Fig.4 Four levels of blood lipids in each group of mice（±s，n=10）

2.3 內(nèi)消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠肝脂肪變性的影響為探究內(nèi)消軟脈湯2 號是否可以改善ApoE-/-小鼠的肝脂肪變性，研究通過油紅O 染色觀察小鼠肝臟。結(jié)果表明，與對照組比較，內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量組及高劑量組小鼠肝臟脂滴明顯減少，提示內(nèi)消軟脈湯2 號具有改善小鼠肝脂肪變性的功效，見圖5。

圖5 各組小鼠的肝臟油紅O 染色（×200）Fig.5 Liver oil red O staining of mice in each group（×200）

2.4 內(nèi)消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠脂肪組織的影響為探究內(nèi)消軟脈湯2 號是否可以激活A(yù)poE-/-小鼠的肩胛脂肪組織，研究通過HE 染色觀察小鼠肩胛處的脂肪組織。結(jié)果表明，HFD 組小鼠的脂肪細(xì)胞表現(xiàn)較為飽滿、體積較大、單房結(jié)構(gòu)脂滴染色較淺。與之形成對比的是，低劑量組及高劑量組脂肪細(xì)胞體積較小、多房室結(jié)構(gòu)脂泡分隔增多，HE 染色變深，細(xì)胞核著色增多，其中以低劑量組改變最為明顯。提示服用內(nèi)消軟脈湯2 號后，小鼠肩胛脂肪組織可被活化，見圖6。

圖6 各組小鼠的肩胛脂肪組織HE 染色（×200）Fig.6 HE staining of scapular adipose tissue in each group of mice（×200）

2.5 內(nèi)消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠肩胛脂肪組織UCP1 表達(dá)的影響由于脂肪組織活化是脂肪分解的重要途徑，UCP1 表達(dá)的升高是體內(nèi)棕色脂肪組織活化的重要標(biāo)志，研究通過Western blot 的方法探究內(nèi)消軟脈湯2 號對肩胛棕色脂肪組織表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與HFD 組比較，內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量及高劑量組肩胛脂肪組織UCP1 的表達(dá)水平顯升高（P<0.05），其中高劑量組升高（P<0.01）最為顯著，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖7。

圖7 內(nèi)消軟脈湯2 號對肩胛脂肪組織UCP1 表達(dá)的影響（±s，n=3）Fig.7 Effect of Neixiao Ruanmai Decoction No.2 on the expression of UCP1 in scapular adipose tissue（±s，n=3）

2.6 內(nèi)消軟脈湯2 號對ApoE-/-小鼠肝臟LDLR 表達(dá)的影響內(nèi)消軟脈湯2 號具有降低LDL-C 的效果，由于肝臟中LDLR 是促進(jìn)體內(nèi)LDL-C 代謝的關(guān)鍵蛋白，是LDL-C 內(nèi)源性清除的關(guān)鍵途徑，故本研究通過Western Blot 的方法探究內(nèi)消軟脈湯2 號對肝臟LDLR 表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與HFD 組比較，內(nèi)消軟脈湯2 號低劑量及高劑量組肝臟LDLR 的表達(dá)水平均升高（P<0.05），其中低劑量組升高顯著（P<0.01），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖8。

圖8 內(nèi)消軟脈湯2 號對肝臟LDLR 表達(dá)的影響（±s，n=3）Fig.8 Effect of Neixiao Ruanmai Decoction No.2 on the expression of LDLR in the liver（±s，n=3）

3 討論

AS 是一種由慢性炎癥引發(fā)的動脈壁脂肪病變，已成為老年人的關(guān)鍵死亡原因之一[10]。脂質(zhì)代謝紊亂與AS 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是AS 主要的獨立危險因素。當(dāng)血脂水平過高時，可導(dǎo)致動脈內(nèi)皮損傷及脂質(zhì)分子大量沉積，這些脂質(zhì)分子會受到多種炎癥細(xì)胞的浸潤和吞噬，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞并引發(fā)一系列炎癥和氧化反應(yīng)，導(dǎo)致AS 的發(fā)生[11]。大量研究表明[12]，血漿膽固醇水平的升高與AS 的發(fā)生率及病死率呈正相關(guān)。目前他汀類等降脂藥物雖已廣泛應(yīng)用，但中國高脂血癥發(fā)病率仍然較高?！吨袊用駹I養(yǎng)與慢性病狀況報告（2020 年）》[13]顯示，中國18 歲及以上居民高脂血癥總體患病率高達(dá)35.6%，造成了嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。中醫(yī)藥是一個偉大的寶庫，進(jìn)一步挖掘治療高脂血癥及AS 的中醫(yī)方劑從而改善高脂血癥、減少心腦血管疾病的發(fā)生，既是深入貫徹《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》的重要一環(huán)，也是高脂血癥領(lǐng)域的重點研究方向，對維護(hù)人類健康具有重要意義。

在中醫(yī)中，AS 為“痰核”結(jié)于血脈所致。津液與血液皆由水谷所化，運行于脈中，津液壅滯則血運亦不通暢，痰為津液壅滯，故“痰核”一旦形成，易影響血液運行而又夾雜瘀血等病理產(chǎn)物，最終形成斑塊[4-5]。高脂血癥作為AS 的基礎(chǔ)，屬于“痰濕”“脂膏”的范疇，為本虛標(biāo)實之證，肝、脾、腎三臟功能失調(diào)是導(dǎo)致血脂異常的內(nèi)因。飲食不節(jié)、嗜食肥甘厚味、情志失調(diào)、過逸少勞、先天不足等原因可造成臟腑功能失調(diào)，肝、脾、腎三臟功能失常，導(dǎo)致水谷不能正常運化、津液代謝失常，進(jìn)而形成濕濁、痰濕等病理產(chǎn)物，即血脂代謝紊亂[14]。故在AS 及高脂血癥的治療上，總以化痰為主，兼顧扶正。

內(nèi)消軟脈湯2 號以“脈生痰核”理論為指導(dǎo)，以化痰散結(jié)為主要治法，在臨床上運用其治療頸動脈斑塊獲得了良好療效，顯示出逆轉(zhuǎn)頸動脈斑塊的潛力。全方以靈芝為君藥，可健脾化痰，助脾胃運化，以絕生痰之源，是本方中改善AS 和脂代謝紊亂的關(guān)鍵藥物。大量研究證明，靈芝可安全有效地改善脂代謝紊亂、肥胖、胰島素抵抗等代謝紊亂性疾病，進(jìn)而達(dá)到抑制AS 發(fā)展的作用[15-21]。痰濁之邪日久易化熱生毒，故輔黃連、玄參以清熱解毒。此外，方中牡蠣、貝母化痰散結(jié)，乳香、沒藥、丹參、當(dāng)歸活血化瘀，起到消退病理產(chǎn)物以調(diào)節(jié)氣機(jī)、改善AS 的作用。整體來看，內(nèi)消軟脈湯2 號配伍有序、寒溫并用、加減靈活，用于治療AS 與高脂血癥，確有其效。前期臨床試驗與本次實驗結(jié)果均表明，內(nèi)消軟脈湯2 號可以減輕AS 斑塊的發(fā)展，實驗組小鼠的LDL-C和TC 水平降低。由此可見，內(nèi)消軟脈湯2 號降低血脂水平是其改善AS 的重要原因。由于內(nèi)消軟脈湯2 號可改善AS 并降低血脂，故可為他汀類藥物不耐受及他汀抵抗的AS 斑塊患者提供較好的備選方案，也為配合他汀類藥物產(chǎn)生更好的臨床療效提供了可能。

根據(jù)實驗結(jié)果，內(nèi)消軟脈湯2 號灌胃后，小鼠肩胛區(qū)脂肪組織的活化程度及UCP1 的表達(dá)均增加，同時肝臟LDLR 的表達(dá)增加。研究表明，UCP1是介導(dǎo)棕色脂肪組織活化產(chǎn)熱的關(guān)鍵蛋白[22-23]。當(dāng)脂肪組織活化時，細(xì)胞質(zhì)中脂滴包被蛋白1 的磷酸化得到激活，在脂肪組織內(nèi)三酰甘油脂肪酶（ATGL）等酶的介導(dǎo)下使TG 分解為甘油及脂肪酸[23-24]，UCP1被激活[24-25]后可介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜形成質(zhì)子通道，使得氧化與磷酸化解偶聯(lián)，最終不產(chǎn)生ATP 而由熱能直接釋放[26]，同時還可增加膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的效率及機(jī)體對膽固醇的利用等，以減少TC、TG 等脂類物質(zhì)的儲存。由于脂肪組織活化產(chǎn)熱嚴(yán)格依賴于UCP1 的激活[22]，是控制肥胖的重要靶點，故推測內(nèi)消軟脈湯2 號使脂肪組織活化與UCP1 密切相關(guān)。激活UCP1 依賴性脂肪組織活化可能是藥物改善AS 及脂代謝紊亂的潛在機(jī)制。LDLR 是體內(nèi)LDL-C代謝調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過內(nèi)吞作用將LDL清除，在膽固醇從血漿到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運和清除中起到重要作用。LDLR 的功能不全或LDLR 基因突變將導(dǎo)致高膽固醇血癥的發(fā)生，并明顯加速AS 的發(fā)展[27]。故增加LDLR 的表達(dá)及功能是抑制高膽固醇血癥及AS 的重要手段。根據(jù)實驗結(jié)果，內(nèi)消軟脈湯2 號可使小鼠肝臟中LDLR 表達(dá)顯著增加，提示內(nèi)消軟脈湯2 號改善小鼠AS、降低LDL-C 與LDLR 相關(guān)，鑒于LDLR 對LDL-C 代謝的重要作用，我們推測內(nèi)消軟脈湯2 號通過增加LDLR 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)其對LDL 的代謝，以達(dá)到降低膽固醇并改善動脈粥樣硬化的作用。故LDLR 表達(dá)升高亦是內(nèi)消軟脈湯2 號改善高脂血癥并抑制AS 的潛在機(jī)制之一。

綜上所述，AS 與高脂血癥皆因痰邪而起，內(nèi)消軟脈湯2 號可通過化痰散結(jié)來清除痰邪這一宿根，其內(nèi)在機(jī)制可能與激活UCP1 及LDLR 有關(guān)，若能深入挖掘方中的有效成分，進(jìn)一步提高其療效，對未來高脂血癥及AS 的防治、開拓中醫(yī)藥治療心腦血管疾病的新思路具有重要意義。