季春蓮,占靚卉,鄭靜茹,孟建標,劉昊,富丹婷,龐麗莎

(1.浙江省立同德醫(yī)院,杭州 310012;2.浙江省中醫(yī)藥研究院,杭州 310012;3.浙江中醫(yī)藥大學,杭州 310051)

足三里穴治療胃腸病已有數(shù)千年歷史,其穴名解釋為“三理”即理上、理中及理下,意思是可治療腹上部、中部和下部疾病,取足三里穴以通降胃之腑氣以達通則不痛的目的[8]。課題組前期臨床數(shù)據(jù)表明電針足三里穴可顯著減輕膿毒癥腸功能障礙患者的炎癥反應并恢復腸黏膜屏障功能[9]。關于電針足三里穴是如何改善膿毒癥誘發(fā)的腸黏膜屏障損傷仍需要進一步探究。故本研究旨在探討電針足三里穴預處理對膿毒癥腸黏膜損傷的保護作用,希望為膿毒癥的治療提供新的思路與選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只SPF級雄性美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠,體質量(20±2)g,購于浙江實驗動物中心[許可證號為SYXK(浙)2016-0022],動物合格證號為20210510Abzz0100018953。小鼠飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院動物房,環(huán)境溫度23～25 ℃,濕度70%～80%,自由攝食飲水,12 h晝夜間斷照明。實驗由浙江省中醫(yī)藥研究院倫理專業(yè)委員會批準進行(倫理號2019-059)。

1.2 主要試劑

脂多糖(Sigma,12181202);白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司,m11063132-C)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司,m1002293-C);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司,m1002095-C)、降鈣素原(procalcitonin,PCT)(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司,m1002192-C);C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)(上海酶聯(lián)免疫生物有限公司,1038364-C);連接蛋白-5(claudin-5)抗體(Affinity Bioscience,AF5216);山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(H+L)(Proteintech,SA00001-2);山羊抗小鼠IgG(H+L) (Affinity Bioscience,SA00001-1);β-actin抗體(Proteintech,660009-1-Ig);IL-6抗體(Proteintech,66146-1-Ig);TNF-α抗體(Proteintech,17590-1-AP);胞質緊密粘連蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)抗體(Proteintech,21773-1-AP);閉合蛋白(occludin)抗體(Proteintech,27260-1-AP);Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)(Beyotime,P1076);BCA蛋白測定試劑盒(Beyotime,Lot No.082820210119);總RNA提取試劑(total RNA extraction reagent,TRIZOL) (Invitrogen,15596026);抗體染料法定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)預混液(Monad,MQ10601S);去基因組與逆轉錄組一管化三代預混液(Monad,MR05101)。

1.3 分組與干預

ICR小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為4組:正常組、模型組、電針組和非經(jīng)非穴組,每組10只。電針組小鼠進行電針預處理。小鼠雙下肢備皮后常規(guī)消毒,固定小鼠,選取0.25 mm×25 mm一次性針灸針于膝關節(jié)后外側、腓骨小頭下約3.5 mm處選取足三里穴[10],直刺進針3 mm左右,連接韓氏電針儀并持續(xù)30 min(疏密波,2.5 mA,頻率2～100 Hz),以小鼠雙下肢出現(xiàn)輕微顫動且不掙扎為度;非經(jīng)非穴組小鼠電針刺激足三里穴旁開5 mm處,采用同樣刺激參數(shù),其余操作同電針組;電針組和非經(jīng)非穴小鼠連續(xù)干預5 d,模型組與正常組小鼠不作干預。末次干預結束后,模型組、電針組和非經(jīng)非穴小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液(10 mg/mL)進行膿毒癥模型制備,依據(jù)文獻及前期預實驗結果發(fā)現(xiàn)造模3 h后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、豎毛等表現(xiàn)表明造模成功[11],正常組小鼠腹腔注射相同體積生理鹽水。造模3 h后通過眼眶取血收集小鼠血漿,后續(xù)通過離心獲得上清,然后將所有小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液[30 mg/(kg·bw)]進行麻醉處死,收集小鼠糞便以及將小鼠結腸組織在生理鹽水中洗凈殘留糞便,樣本均置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?另外取末端回腸組織1 cm固定于福爾馬林中,以備后續(xù)檢測。

1.4 指標檢測

1.4.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色和腸組織損傷評分

回腸組織固定于福爾馬林溶液中48 h后,進行組織脫水,石蠟包埋,切片、HE染色和中性樹膠封片,最后在光學顯微鏡下觀察回腸組織病理形態(tài),并根據(jù)腸黏膜損傷標準[12]對回腸組織進行病理評分。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細胞因子表達

稱取0.1 g左右結腸組織置于1.5 mL EP管中,并加入9倍量磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS),在30 Hz條件下進行超聲破碎2 min,12 000 r/min離心5 min,取上清用于檢測IL-1β、IL-6、TNF-α含量;另外取出-80 ℃冰箱中的血清樣本用于檢測CRP和PCT。將IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP和PCT的ELISA試劑盒進行室溫平衡60 min,然后加入50 μL待測組織上清液和100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體,并于37 ℃恒溫箱中溫育60 min;接著棄去液體,洗板5次后每孔加入底物A和B各50 μL,于37 ℃恒溫箱中避光孵育15 min;最后加入50 μL終止液,在450 nm波長處測定各孔OD值。

兩者的設計理念不同，G9追求旗艦級單反的操控和使用體驗。而E-M1 II則是正統(tǒng)的無反思路。如果你傾向于旅行、街頭拍攝，E-M1 II顯然用起來更加方便。但如果你專注體育題材拍攝，或者手比一般人都大，G9的設計會更加適合你。

1.4.3 蛋白印跡(Western blot,WB)法檢測蛋白表達

稱取80 mg左右的結腸組織置于1.5 mL EP管中,并加入9倍量放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液,用以提取組織中蛋白,利用BCA蛋白測定試劑盒確定蛋白濃度,在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)凝膠中分離蛋白裂解物,通過轉膜使其電轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,在5%脫脂牛奶中封閉2 h后與IL-1β(1:1 000)、IL-6(1:6 000)、TNF-α(1:1 000)、β-actin(1:10 000)、claudin-5(1:2 000)、occludin(1:600)抗體在4 ℃條件下共孵育過夜,次日與二抗于室溫下共孵育2 h后,利用化學發(fā)光試劑盒再進行成像檢測,并利用Image J軟件對其灰度值進行定量分析。

1.4.4 逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)技術檢測肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)、ZO-1、claudin-5、occludin基因表達量稱取50 mg左右結腸組織置于1.5 mL EP管中,加入9倍量TRIZOL用以提取總RNA,然后通過RT-PCR試劑盒將其反轉錄為cDNA,采用SYBR Green檢測MLCK、MLC、ZO-1、claudin-5、occludin在結腸組織中的表達,反應條件為95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火及延伸30 s,40個循環(huán)。然后采用2-Ct法計算個基因的相對表達量,并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為參照基因。各基因序列如表1所示。

表1 各檢測指標引物序列

1.4.5 免疫熒光法檢測蛋白表達

4 μm熒光回腸組織石蠟切片經(jīng)過脫蠟、水化和抗原修復后在固定液中固定10 min,洗滌3次后在封閉液中封閉60 min,然后在4 ℃的條件下與ZO-1(1:1 000)和claudin-5(1:1 000)抗體進行結合過夜,次日與熒光標記的二抗避光孵育60 min,然后加入少量DAPI染色液室溫放置5 min,最后在玻片上滴加抗熒光淬滅劑后蓋上玻片,在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析比較數(shù)據(jù),進一步兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電針預處理對膿毒癥小鼠回腸組織病理學的影響

正常組小鼠腸道組織黏膜未見明顯糜爛與缺失,且腺體排列規(guī)整和無炎癥細胞浸潤;模型組小鼠結腸組織出現(xiàn)細胞排列紊亂與缺失、結構被破壞、腺體變形,有顯著的病理損傷;電針組小鼠回腸上皮細胞基本完整,腺體排列整齊,病理損傷較模型組有所減輕;非針非穴組小鼠回腸組織病理則與模型組小鼠相似。詳見圖1。與正常組比較,模型組小鼠回腸組織病理評分顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,電針組小鼠回腸組織病理評分顯著降低(P＜0.05)。詳見圖2。提示電針足三里預處理可顯著改善LPS誘導的腸黏膜組織病理損傷。

圖1 4組小鼠回腸組織HE染色圖(HE×40)

圖2 4組小鼠回腸組織病理評分比較(±s,n＝10)

2.2 電針預處理對膿毒癥小鼠炎癥因子的影響

ELISA結果顯示,與正常組比較,模型組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著增高(P＜0.05);與模型組比較,電針組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量降低(P＜0.05)。詳見圖3。WB結果顯示,與正常組比較,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達顯著上調(P＜0.05);與模型組比較,電針組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表達明顯下調(P＜0.05)。詳見圖4和圖5。提示電針預處理可通過降低促炎因子的表達抑制LPS引起的炎癥反應。

圖3 4組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量比較(±s,n＝10)

圖4 WB檢測4組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達條帶圖(n＝10)

圖5 4組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達比較(±s,n＝10)

2.3 電針預處理對膿毒癥小鼠血清CRP和PCT的影響

與正常組比較,模型組小鼠血清中CRP與PCT含量顯著升高(P＜0.05);與模型組比較,電針組血清中CRP與PCT含量明顯下降(P＜0.05)。詳見圖6。

圖6 4組小鼠血清CRP與PCT含量比較(±s,n＝10)

2.4 電針預處理對膿毒癥小鼠緊密連接蛋白表達的影響

與正常組比較,模型組小鼠結腸組織中occludin蛋白、occludin mRNA、claudin-5 mRNA和ZO-1 mRNA的相對表達量顯著降低(P＜0.05);與模型組比較,電針組occludin蛋白、occludin mRNA、claudin-5 mRNA和ZO-1 mRNA的相對表達量顯著提高(P＜0.05)。詳見圖7和圖8。模型組在LPS的作用下表達claudin-5和ZO-1蛋白的藍綠色熒光強度較正常組弱,而電針組藍綠色熒光強度較模型組強,詳見圖9和圖10。提示電針足三里預處理可通過提高緊密連接蛋白的表達修復LPS引起的膿毒癥腸黏膜損傷。

圖7 4組occludin-5蛋白條帶圖

圖8 4組小鼠結腸組織中occludin、occludin mRNA、claudin-5 mRNA和ZO-1 mRNA蛋白表達比較(±s,n＝10)

圖9 4組claudin-5免疫熒光蛋白圖(×40)

圖10 4組ZO-1的免疫熒光蛋白圖(×40)

2.5 電針預處理對膿毒癥小鼠MLCK/MLC信號通路的調節(jié)作用

與正常組比較,模型組小鼠MLCK和MLC mRNA相對表達量顯著增加(P＜0.05);與模型組比較,電針組小鼠MLCK和MLC mRNA相對表達量顯著降低(P＜0.05)。詳見圖11。提示電針足三里預處理可下調MLCK/MLC信號通路的表達,從而發(fā)揮腸黏膜損傷保護作用。

圖11 4組小鼠MLCK和MLC mRNA相對表達量(±s,n＝10)

3 討論

膿毒癥是一種機體對感染的反應失調導致的多器官功能障礙綜合征(MODS),具有高發(fā)病率和死亡率[13]。由于胃腸道是MODS的始動器官,因此腸黏膜屏障功能在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用早已引起廣泛的關注[14]。目前臨床針對腸黏膜功能的保護措施主要有益生菌、谷氨酰胺和腸黏膜保護劑等,但是膿毒癥患者由于腸黏膜屏障功能損傷較重造成胃腸動力差,胃腸內給藥容易出現(xiàn)潴留、腹瀉,增加誤吸風險等,效果均不盡如人意[15]。而足三里穴作為治療胃腸疾病的經(jīng)典穴和首選穴,在治療膿毒癥腸黏膜屏障功能損傷中具有明顯的優(yōu)勢。因此本實驗通過建立LPS誘導的膿毒癥腸黏膜屏障功能損傷模型探討了電針足三里預處理對其的治療作用及潛在機制。實驗數(shù)據(jù)表明電針足三里顯著減輕膿毒癥腸黏膜病理損傷和腸道炎癥反應,并且可通過抑制MLCK/MLC信號通路上調緊密連接蛋白的表達修復腸黏膜屏障功能。

炎癥失衡是膿毒癥發(fā)病的關鍵基礎,當機體發(fā)生膿毒癥時腸道內的革蘭氏陰性菌細胞壁會占據(jù)主導地位,而其主要成分LPS會刺激單核細胞或巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列促炎因子,引發(fā)炎癥風暴[16-17]。CHEN L等[18]的研究表明在膿毒癥模型中促炎因子顯著增加,在引發(fā)炎癥反應的同時也導致了腸源性感染。本實驗數(shù)據(jù)也表明模型組小鼠腸組織中的上述促炎因子表達明顯升高,腸黏膜也有明顯的病理損傷。此外,臨床研究表明電針足三里可減輕膿毒癥患者的炎癥反應,改善其腸功能障礙[19]。本研究中電針足三里的預處理不僅顯著逆轉了這些細胞因子的變化并且也減輕了LPS引起的腸黏膜組織損傷,這表明電針足三里可通過降低炎癥反應保護膿毒癥腸黏膜屏障損傷。

CRP和PCT作為響應炎癥反應而產(chǎn)生的蛋白質,一直以來也是臨床診斷膿毒癥的關鍵指標和生物標志物[20]。CRP是在肝臟中被IL-6上調合成的蛋白質,在膿毒癥急性炎癥期間顯著升高,可通過與微生物磷脂成分結合而促進巨噬細胞將其清除[21]。PCT是在LPS等內源性和外源性刺激下分泌的急性期蛋白,在膿毒癥感染期間比其他炎癥因子更早作為臨床診斷標志物[22]。本實驗結果也發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在LPS的刺激下血清中PCT和CRP水平急劇上升,但是電針足三里逆轉了其水平的增加。這進一步說明了電針足三里對膿毒癥急性期引發(fā)的炎癥風暴有顯著的調控作用。

膿毒癥腸黏膜屏障功能損傷一直被認為引發(fā)全身炎癥反應啟動的關鍵環(huán)節(jié)[23]。腸道緊密連接蛋白的破壞是導致腸道通透性增加、腸黏膜屏障損傷和功能障礙的主要原因之一[24]。緊密連接蛋白由ZO-1、occludin和claudin組成,ZO-1是一種可調控腸上皮細胞緊密連接蛋白的組裝和逆轉細胞間連接蛋白表達而對腸道通透性產(chǎn)生影響的支架蛋白[25]。occludin則是一種可與ZO-1連接的跨膜蛋白,其水平的改變可反映腸黏膜屏障破壞的程度,且有研究表明在腸上皮細胞系和動物模型中其表達的增加有助于腸黏膜屏障功能損傷的修復[26]。claudin-5通過形成緊密連接蛋白鏈在腸上皮細胞間形成屏障,當其異常表達時會導致腸上皮結構損傷和功能障礙,引發(fā)腸上皮細胞間隙通透性增加,最終使得LPS等物質透過腸黏膜屏障進入體循環(huán)導致膿毒癥的發(fā)生[27]。在本研究中發(fā)現(xiàn)模型組小鼠ZO-1、occludin和claudin-5的表達均顯著降低,相比之下電針足三里組小鼠緊密連接蛋白的表達有明顯的逆轉。這表明電針足三里可通過上調緊密連接蛋白的表達修復膿毒癥腸黏膜損傷屏障并防止膿毒癥進一步惡化。

研究表明MLCK是調控緊密連接蛋白的關鍵物質,當MLCK啟動轉錄后增加MLCK蛋白的表達,又進一步促進MLC的激活,這促使了ZO-1、occludin和claudin-5等緊密連接蛋白的重新分布,導致腸黏膜屏障損傷[28]。YE X等[29]證明抑制MLCK/MLC信號通路的激活可增強緊密連接蛋白的表達從而抑制腸道通透性增加。本研究為進一步探究電針足三里對緊密連接蛋白的調控機制,對MLCK/MLC信號通路進行檢測發(fā)現(xiàn)電針足三里抑制了LPS引起的MLCK和MLC的激活,提示該信號通路可能是電針足三里發(fā)揮腸黏膜屏障損傷保護作用的關鍵機制。

綜上所述,電針足三里預處理可通過抑制炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的分泌和上調緊密連接蛋白(ZO-1、occludin和claudin-5)的表達發(fā)揮對LPS誘導的膿毒癥腸黏膜屏障功能損傷的保護作用,其調控機制可能與MLCK/MLC信號通路有關。但是本實驗仍存在一定的缺陷,后續(xù)需對腸道損傷引發(fā)的細菌易位以及MLCK/MLC信號通路進行深入研究,并進一步探討非經(jīng)非穴部位在膿毒癥發(fā)展過程中的作用。