楊文潔 孫 濤 韓 杰 楊 磊 王珺楠△

（1 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院疼痛科，濟(jì)南 250021；2 山東大學(xué)威海市立醫(yī)院疼痛科，威海 264200）

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后常見且難以控制的并發(fā)癥之一[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球SCI 發(fā)病率為30～40/（100萬·年），我國各地綜合發(fā)病率為23.7/（100 萬·年），其中有53%～80%的人會出現(xiàn)NP[2]。其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，疼痛劇烈、遷延難愈，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，導(dǎo)致抑郁甚至自殺[3]。目前脊髓損傷后神經(jīng)病理性疼痛 (SCI-induced neuropathic pain, SCI-NP)的治療主要有藥物治療和非藥物治療兩種方案，其中藥物治療是SCI-NP 最基礎(chǔ)及最常用的方法，包括一線的抗驚厥藥、三環(huán)抗抑郁藥，二、三線的曲馬多、阿片類鎮(zhèn)痛藥、非甾體抗炎藥等，但長期應(yīng)用藥物導(dǎo)致的耐受性、依賴性及藥物濫用等不良反應(yīng)仍是臨床治療的挑戰(zhàn)[4]。同時，由于SCI-NP 具體機(jī)制復(fù)雜不明，不同病人間臨床療效個體差異較大，目前尚缺乏更有效的治療方案。因此，積極探索SCI-NP 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的藥物及手術(shù)治療靶點(diǎn)，是當(dāng)前亟待解決的問題。

SCI-NP 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，中樞敏化是NP 發(fā)展和維持的基礎(chǔ)。研究證明，SCI 后持續(xù)增加的炎癥反應(yīng)通過形成中樞敏化介導(dǎo)NP，而損傷區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化失衡在形成中樞敏化過程中發(fā)揮重要作用[5]。文獻(xiàn)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換是一個動態(tài)重疊的過程[6]，改善抗炎微環(huán)境，逆轉(zhuǎn)其極化失衡，可能是更具優(yōu)勢的SCI-NP 治療策略。

環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷 (cyclic guanosine monophosphate, cGMP)是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，已被證明對細(xì)胞免疫反應(yīng)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用[7]。磷酸二酯酶(phosphodiesterases, PDEs)是細(xì)胞內(nèi)唯一可調(diào)節(jié)cAMP 和/或cGMP 水平的關(guān)鍵酶，包括11 種同工酶(PDE1-PDE11)[8]。其中，磷酸二酯酶-2A (phosphodiesterase-2A, PDE2A) 是一種被cGMP 刺激可同時降解cAMP 和cGMP 的雙底物酶，其廣泛分布于人體的大腦等多種組織中；近年來，PDE2A 在治療心力衰竭、改善學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能、改善抑郁焦慮樣行為等方面成為重要的研究靶點(diǎn)[9]。Beshay 等[10]通過小鼠體內(nèi)及RAW-264.7 巨噬細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)證明PDE抑制劑可抑制巨噬細(xì)胞活化和一氧化氮生成，因此也是多種免疫過程的有效調(diào)節(jié)劑。最近一項(xiàng)研究表明，PDE2 抑制劑Bay 60-7550 可緩解輕度睡眠不足模型小鼠的持續(xù)術(shù)后疼痛，但Bay 60-7550 鎮(zhèn)痛的具體機(jī)制尚不清楚[11]。此外，PDE2A 在大鼠脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細(xì)胞中含量較豐富，并推測其在傷害性信息的處理中發(fā)揮重要作用[12]。然而，目前國內(nèi)外尚無PDE2A-小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化在SCI-NP 模型中的研究。因此，本研究通過建立大鼠SCI-NP 模型，觀察選擇性PDE2A 抑制劑對SCI-NP的抗炎和鎮(zhèn)痛效果，探究PDE2A-小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化在SCI-NP 形成中的作用及其可能機(jī)制。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級健康SD 大鼠，雄性，6～7 周齡，體重210～260 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)繁育有限公司提供[許可證號：SCXK（魯）20190003]。所有實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于室溫25±1℃、濕度45%±5%、晝夜周期為12 h 的鼠房中，大鼠可自由地進(jìn)食水。所有動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作程序已通過山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：NSFC: NO.2019- 202）。

2. 主要實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

Bay 60-7550 (CAS No.:439083-90-6)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國Med Chem Express 公司。免疫組化一抗PDE2A 購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔二抗購于山東思科捷生物技術(shù)有限公司。PCR 引物：PDE2A、CD86(cluster of differentiation 86)、CD163 (cluster of differentiation 163)、IL-6 (interleukin 6)、IL-1β (interleukin 1β)、IL-10 (interleukin 10)、TGF-β (Transforming Growth Factor-β)委托上海博尚生物公司合成，Trizol RNA提取試劑盒 (AG21102)、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(AG1172)、Pro Taq HS SYBR Green 預(yù)混qPCR試劑盒 (AG11701) 均購自湖南艾科瑞生物公司。流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用抗體Granulocyte-FITC (clone HIS48)，Major Histocompatibility Complex II-PerCP-eFluor 710 (MHCII-PerCP-eFluor 710)(clone OX17) 和CD11b/c-eFluor 660 (clone OX42) 均購自美國eBioscience 公司，CD172a-PE (clone OX41) 購自美國BioLegend 公司。

3. 實(shí)驗(yàn)分組

根據(jù)既往研究[13]，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)探索鞘內(nèi)注射Bay 60-7550 的有效濃度。預(yù)實(shí)驗(yàn)中將大鼠隨機(jī)分為3 組（每組3 只）：溶媒組（vehicle 組）、給藥組（Bay 60-7550 0.1 mg/kg 組和Bay 60-7550 1 mg/kg 組）。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正式實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4 組（每組共24 只大鼠，每組取3～5 只分別用于分子生物學(xué)及行為學(xué)檢測）：假手術(shù)組（Sham 組）、模型組（SCI 組）、給藥組（Bay 60-7550 組）和溶媒組（vehicle 組）。Sham 組：僅切除椎板、鞘內(nèi)置管而不損傷脊髓；SCI 組：建立大鼠脊髓損傷模型并鞘內(nèi)置管；vehicle 組：脊髓損傷大鼠鞘內(nèi)注射10 μl 10% DMSO（溶解Bay 60-7550 粉末的溶媒組對照）；Bay 60-7550 組：脊髓損傷大鼠按照1 mg/kg 的濃度鞘內(nèi)注射10 μl Bay 60-7550。

4. 建立脊髓損傷模型

采用改良Allen 法建立大鼠SCI 模型[14]。腹腔注射2%阿佛丁(10 ml/kg)麻醉大鼠，待大鼠無傷害刺激反應(yīng)后俯臥位固定于手術(shù)板上。分別定位大鼠髖關(guān)節(jié)和最下肋骨，以定位點(diǎn)為中心向頭尾兩側(cè)5 cm 范圍備皮，消毒鋪巾。首先，于大鼠背部以L5椎體為中心沿后正中線做約1 cm 縱行切口，應(yīng)用聚乙烯套管(PE-10)經(jīng)L5椎體下緣椎間隙垂直穿刺，將導(dǎo)管沿頭側(cè)端置入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，深度約0.5 cm，此時腦脊液可從鞘內(nèi)導(dǎo)管流出。待大鼠麻醉恢復(fù)期，鞘內(nèi)注射2%利多卡因10 μl，若出現(xiàn)雙后肢拖拽行為或無力表現(xiàn)，則證明鞘內(nèi)給藥在合適的位置。應(yīng)用3-0縫線將導(dǎo)管牢牢地固定于皮下并分層縫合切口。

然后，以T10椎體為中心向頭、尾兩側(cè)做約3 cm縱行切口，分離肌腱和周邊肌肉組織充分暴露T9～T11椎板棘突和椎板，取出切除的T10椎板及棘突，充分暴露相應(yīng)節(jié)段的脊髓。將10 g 鐵棒沿玻璃管從30 mm 高度垂直下落撞擊脊髓，建立SCI 模型，術(shù)后充分止血縫合。術(shù)后每日1 次肌內(nèi)注射青霉素20×104U，連續(xù)5 天預(yù)防感染。將大鼠放回干凈溫暖的籠內(nèi)飼養(yǎng)恢復(fù)。此后每日人工排尿2 次(6:00～8:30 和16:30～18:00)，直至損傷大鼠可連續(xù)3 天自行排尿。

5. 鞘內(nèi)注射給藥

Bay 60-7550 溶液現(xiàn)用現(xiàn)配；給藥前將Bay 60-7550 固體粉末溶解于10% DMSO 中，使溶液pH 值調(diào)整為7.4。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，異氟醚麻醉下，Bay 60-7550 0.1 mg/kg 組經(jīng)大鼠鞘內(nèi)導(dǎo)管注射10 μl Bay 60-7550(0.1 mg/kg)；Bay 60-7550 1 mg/kg 組經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管注射10 μl Bay 60-7550 (1.0 mg/kg)；vehicle 組鞘內(nèi)注射相同劑量的DMSO (10 μl)。正式實(shí)驗(yàn)中，異氟醚麻醉下，分別給Bay 60-7550 組及vehicle 組大鼠經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管注射Bay 60-7550 (1.0 mg/kg, 10 μl) 或DMSO(10 μl)。預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)均于術(shù)后每日固定時間鞘內(nèi)注射Bay 60-7550 或DMSO (10 μl/d) 1 次，持續(xù)1 周。

6. 機(jī)械痛閾評估

采用Chaplan 等[15]報道的機(jī)械痛閾評估方法來測量大鼠50%機(jī)械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)，每組隨機(jī)分配5只大鼠。為避免主觀誤差，觀察者隱瞞實(shí)驗(yàn)大鼠的分組情況。在正常光照和均勻噪聲條件下，測量時間固定在上午8 點(diǎn)至12 點(diǎn)之間，同一觀察者于術(shù)前、術(shù)后第7、10、14、17、21 天測定大鼠雙后爪50% MWT，并取雙后爪50% MWT 平均值。

具體測量方法如下：將大鼠放置于底部為金屬網(wǎng)的透明玻璃箱內(nèi)，使大鼠適應(yīng)測試籠環(huán)境至少30 min，直至其探索活動消失。應(yīng)用8 根vonFrey纖維絲（0.4 g、0.6 g、1.0g、2.0 g、 4.0 g、6.0 g、8.0 g、15.0 g，美國Stoelting 公司生產(chǎn)），按“Up-Down”的方法依序刺激大鼠后爪底部中央。首先，施加2.0 g 的纖維絲，持續(xù)刺激約6～8 s，觀察大鼠是否出現(xiàn)快速縮足、舔足或搖晃反應(yīng)，若出現(xiàn)則認(rèn)定為陽性反應(yīng)。在陽性反應(yīng)情況下，標(biāo)記結(jié)果為“X”，按順序換用小一號的纖維絲。在陰性反應(yīng)下，結(jié)果標(biāo)記為“0”，并換用大一號的纖維絲刺激。當(dāng)出現(xiàn)第1 次前后刺激反應(yīng)變化后，繼續(xù)測量4 次，結(jié)果序列用于計算50% MWT。50% MWT 的計算公式為：50% MWT = 10(Xf+κδ)（Xf 為最后一個vonFrey纖維絲力度值的對數(shù)，κ 為陽性/陰性反應(yīng)序列的對應(yīng)值，δ = 0.224）。為避免大鼠出現(xiàn)機(jī)械性痛覺敏化，每次刺激至少間隔2 min。

7. 免疫組織化學(xué)染色

術(shù)后第7 天，用1.2%阿佛丁(10 ml/kg)麻醉大鼠，行升主動脈插管，依次用0.9%氯化鈉注射液200 ml 和4%多聚甲醛250 ml 進(jìn)行心臟灌注，解剖分離T9～T10脊髓組織（每組3 只大鼠），置于4%多聚甲醛固定24 h。免疫組化操作按照Stephenson等[12]文獻(xiàn)中描述的步驟。用距正中 (T9～T10) 尾側(cè)1 mm 處相對完整的脊髓組織制備石蠟切片，厚度約為5 μm。切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)固定、洗滌和封閉后，與抗兔PDE2A 一抗(1:150, Cat. No.: 55306-1-AP) 在4℃孵育過夜，經(jīng)磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffered saline,PBS)洗滌后，將組織與山羊抗兔二抗 (1:200) 在室溫下孵育40 min，接著用PBS 洗滌。使用DAB 試劑盒（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行染色，并用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。最后，使用奧林巴斯BX60 顯微鏡（ 奧林巴斯光學(xué)有限公司，日本東京）對染色的組織切片進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image J 圖像分析軟件，根據(jù)光密度(optical density, OD)值計算圖像中PDE2A 的陽性表達(dá)水平。

8. Western blot 檢測

術(shù)后第7 天，麻醉灌注后分別取各組大鼠T9～T11節(jié)段的脊髓組織，置于液氮保存。脊髓組織稱重在冰上剪碎，置于RIPA (radio-immunoprecipitation assay) 裂解緩沖液中勻漿提取蛋白質(zhì)。根據(jù)說明書通過BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)在7.5%分離膠上進(jìn)行SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電泳分離，后將其轉(zhuǎn)移至PVDF (polyvinylidene fluoride)膜上置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結(jié)束后將洗滌好的PVDF 膜置于一抗PDE2A 稀釋液(1:1000,Cat. No.55306-1-AP) 中，4 ℃孵育，搖床過夜。TBST 洗滌后，置于抗兔HRP (horseradish peroxidase) 二抗(1:1000)室溫孵育1.5 h。經(jīng)TBST 洗滌3次（每次10 min）后，在膜上滴加ECL 顯影液，于成像分析儀上顯像。使用Image J分析各條帶灰度值，PDE2A 與β-actin 灰度值的比值作為PDE2A 的相對表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)以Sham 組作歸一化處理。

9. 實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測 (real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)

術(shù)后第7 天，分離大鼠T9～T11節(jié)段的脊髓組織，液氮保存。應(yīng)用RNAex Pro 試劑提取脊髓組織中的RNA。參照試劑盒說明書要求，使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用Pro Taq HS SYBR Green 預(yù)混qPCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。最后，將擴(kuò)增的PCR 應(yīng)用瑞士Roche 公司的Light Cycler?480 II進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，分析Real-time PCR 擴(kuò)增及溶解曲線，以內(nèi)參GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 為對照，采用2-?CT公式進(jìn)行mRNA 相對表達(dá)量分析。GAPDH、M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86 及促炎因子：IL-6、IL-1β 和M2 型細(xì)胞表面標(biāo)記物CD163 及抗炎因子：IL-10、TGF-β 的引物（見表1）。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

10. 流式細(xì)胞術(shù)

術(shù)后第7 天，大鼠在1.2%阿佛丁深麻醉下，心臟灌注PBS 后，分離T9～T11脊髓節(jié)段置于含5%胎牛血清的培養(yǎng)基（Gibco，賽默飛世爾科技公司）中，轉(zhuǎn)移至4℃冰上進(jìn)行后續(xù)操作；將脊髓組織剪成小碎塊，加入與培養(yǎng)基等體積的0.25%胰蛋白酶液（不含EDTA，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）進(jìn)行消化，15 min 后加入與胰蛋白酶溶液等體積的5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)封閉，經(jīng)75 μm 細(xì)胞濾器過濾制備單細(xì)胞懸液。密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞[16]。離心后獲得的單細(xì)胞懸液使用抗大鼠流式細(xì)胞術(shù)抗體：Granulocyte-FITC(0.25 μg/100 μl)、CD172a-PE (0.25 μg/100 μl)、MHCII-PerCP-eFluor 710 (0.25 μg/100 μl) 和CD11b/c-efluor 660 (0.125 μg/100 μl)染色30 min。用400 μl PBS 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(LSRFortessaTM,BD, Cat.No.649225)采集單細(xì)胞并分析。通過Flow-Jo? 10.4 軟件 (BD) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞被標(biāo)記為CD11b/c+Granulocyt–、MHCII+CD172a–(M1型) 和CD172a+MHCII-(M2型) 亞型[17]。

11. 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0 軟件 (IBM) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示。通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，多組間比較采用重復(fù)測量方差分析和Turkey's post-hoc 分析。對于免疫組化、qRT-PCR 和流式細(xì)胞術(shù)比較，采用單因素方差分析，組間比較符合方差齊性時采用Turkey's post-hoc分析；若不符合方差齊性，則采用Tamhane's T2 post-hoc 分析。P< 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. Bay 60-7550 可減輕SCI 大鼠的機(jī)械性痛覺過敏

與Sham 組相比，SCI 組大鼠在術(shù)后7～21 天出現(xiàn)機(jī)械性痛覺過敏(P< 0.01)。同時，vehicle 組的50% MWT 顯著低于Sham 組 (P< 0.01)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與vehicle 組相比，鞘內(nèi)注射10 μl Bay 60-7550(0.1 mg/kg)對脊髓損傷大鼠的機(jī)械痛敏無明顯緩解作用；而鞘內(nèi)注射10 μl Bay 60-7550 (1 mg/kg)后大鼠機(jī)械痛閾值較vehicle 組明顯提高（P< 0.01，見圖1A）。因此，在正式實(shí)驗(yàn)中，鞘內(nèi)注射1 mg/kg的Bay 60-7550 后，脊髓損傷大鼠的機(jī)械痛覺過敏在術(shù)后7～21 天明顯減輕（P< 0.01，見圖1B）。

圖1 Bay 60-7550 對SCI 大鼠機(jī)械痛閾的影響 (±SEM)△△P < 0.01，與SCI + DMSO 組相比；**P < 0.01，與Sham 組相比；##P < 0.01, 與vehicle 組相比Fig. 1 Effects of Bay 60-7550 on mechanical pain threshold in SCI rats (±SEM)△△P < 0.01, compared with group SCI + DMSO; **P < 0.01, compared with group Sham; ##P < 0.01, compared with group vehicle.

2. Bay 60-7550 對SCI 大鼠脊髓PDE2A 表達(dá)的影響

免疫組化染色和Western blot 結(jié)果顯示：術(shù)后第7 天，SCI 組和vehicle 組大鼠脊髓損傷區(qū)脊髓背角PDE2A 陽性表達(dá)強(qiáng)度及蛋白表達(dá)均高于Sham 組（P< 0.01，見圖2A-K）。而Bay 60-7550 組脊髓背角PDE2A 表達(dá)低于vehicle 組（P< 0.05，見圖2A-K）。

圖2 Bay 60-7550 抑制SCI 大鼠PDE2A 的過表達(dá)(A-I: n = 3; J-K: n = 4,±SEM)(A-H)各組大鼠脊髓背角PDE2A 表達(dá)的免疫組化染色圖；(I)各組大鼠脊髓背角免疫組化染色PDE2A 的平均光密度值；(J)免疫印跡法檢測各組大鼠脊髓背角PDE2A 蛋白表達(dá)的代表性圖像；(K)各組大鼠經(jīng)β-肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)化后的蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計圖白色箭頭標(biāo)記為PDE2A 陽性表達(dá)；DH:脊髓背角；AOD:平均光密度值；Relative density ratio:相對密度比**P < 0.01，與Sham 組相比；#P < 0.05，與vehicle 組相比Fig. 2 Inhibition of PDE2A overexpression in SCI rats by Bay 60-7550 (A-I: n = 3; J-K: n = 4,±SEM)(A-H) Immunohistochemical staining images of PDE2A expression in the dorsal horn of the spinal cord in various groups of rats; (I) Average optical density values of immunohistochemical staining of PDE2A in the dorsal horn of the spinal cord of each group of rats; (J) Representative images of PDE2A protein expression in the dorsal horn of rat spinal cord in each group detected by Western blot; (K) The analyzed data normalized by β-actin in each group.White arrows show PDE2A positive expression; DH: spinal dorsal horn; AOD: average optical density**P < 0.01, compared with group Sham; #P < 0.05, compared with group vehicle.

3. Bay 60-7550 對大鼠脊髓損傷后巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞表型分化的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞比例（見圖3A, 3B）；與Sham 組相比，SCI 組、vehicle 組大鼠脊髓組織中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M1/M2 亞型即MHCII+/CD172a-細(xì)胞的比例顯著增加（P< 0.05，P< 0.01，見圖3B）。而Bay 60-7550 組M1/M2 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞比例低于SCI 組、vehicle 組（P<0.05，見圖3B）。

4. Bay 60-7550 對M1、M2 型細(xì)胞相應(yīng)炎癥因子表達(dá)的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與Sham 組相比，SCI 組和vehicle 組的M1 型標(biāo)志物CD86 mRNA 表達(dá)顯著增加 (P< 0.01)。與vehicle 組相比，Bay 60-7550 組M1 型標(biāo)志物CD86 mRNA 表達(dá)顯著降低（P< 0.01，見圖4A）。而M2 型標(biāo)志物CD163 mRNA 水平升高（P< 0.01，見圖4B）。

圖4 Bay 60-7550 對M1、M2 型細(xì)胞相應(yīng)炎癥因子表達(dá)的影響 (n = 3,±SEM)(A) qRT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織中CD86 mRNA 表達(dá)的比較；(B) qRT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織中CD163 mRNA 表達(dá)的比較；(C) qRT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織中IL-6 mRNA 表達(dá)的比較；(D) qRT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織中IL-1β mRNA 表達(dá)的比較；(E) qRT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織中IL-10 mRNA 表達(dá)的比較；(F) qRT-PCR檢測各組大鼠脊髓組織中TGF-β mRNA 表達(dá)的比較*P < 0.05，**P < 0.01，與Sham 組相比；#P < 0.05，##P < 0.01，與vehicle 組相比Fig. 4 Effect of Bay 60-7550 on the expression of corresponding inflammatory factors of M1 and M2 (n = 3,±SEM)(A) Comparison of CD86 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (B)Comparison of CD163 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (C) Comparison of IL-6 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (D) Comparison of IL-1β mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (E) Comparison of IL-10 mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR; (F) Comparison of TGF-β mRNA expression in spinal cord tissue of rats in each group detected by qRT-PCR.*P < 0.05，**P < 0.01, compared with group Sham; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group vehicle.

與Sham 組相比，SCI 組和vehicle 組大鼠脊髓組織中IL-6、IL-1β mRNA水平均顯著增加 (P< 0.01，P< 0.05)。與vehicle 組相比，Bay 60-7550 組鞘內(nèi)給藥后促炎因子IL-6、IL-1β mRNA 水平均顯著減少（P< 0.01，P< 0.05；見圖4C, 4D）。然而，與Sham 組相比，SCI 組大鼠脊髓組織中IL-10 mRNA水平無明顯增加 (P> 0.05)，vehicle 組IL-10 mRNA水平增加 (P< 0.01)。與vehicle 組相比，Bay 60-7550組大鼠脊髓組織中IL-10 mRNA 水平顯著性增加(P< 0.05)。與Sham 組相比，SCI 組和vehicle 組大鼠脊髓組織中M2 型抗炎細(xì)胞因子TGF-β mRNA 水平增加 (P< 0.01)。與vehicle 組相比，Bay 60-7550組大鼠脊髓組織中TGF-β mRNA 水平顯著性增加（P< 0.05，見圖4E, 4F）。

討 論

脊髓損傷后神經(jīng)病理性疼痛(SCI-NP)嚴(yán)重影響病人的日常生活，也給社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。SCI-NP 涉及復(fù)雜的病理生理過程，包括神經(jīng)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)、脊髓去抑制、下行疼痛調(diào)控通路中斷、中樞敏化及神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)[18]。因此，SCI-NP 的治療十分困難，臨床中仍缺乏有效的治療方案。

PDE2A 是細(xì)胞內(nèi)重要的信號調(diào)節(jié)因子，其廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]。Lakics 等[19]發(fā)現(xiàn)在多種哺乳動物的大腦和脊髓灰質(zhì)中PDE2A 含量豐富，其中PDE2A 免疫染色密度最高的部位是脊髓背角神經(jīng)元（尤其是I-II 層）的細(xì)胞核。隨后，Kallenborn-Gerhardt 等[20]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在酵母多糖誘導(dǎo)的小鼠足底炎性疼痛模型中，脊髓背角PDE2A表達(dá)上調(diào)，且PDE2A 免疫熒光標(biāo)記與脊髓背角淺層神經(jīng)元的標(biāo)記重疊。PDEs 被證明可參與慢性炎癥的產(chǎn)生，Rentsendorj 等[21]發(fā)現(xiàn)在小鼠急性肺損傷模型中抑制PDE2A 可增加上皮細(xì)胞cAMP、減少iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) 來降低早期上皮細(xì)胞活化和滲漏，同時促進(jìn)巨噬細(xì)胞iNOS 的增加，起到緩解炎性損傷的作用。Plummer 等[22]的研究顯示，選擇性PDE2A 抑制劑通過抑制cGMP水解可降低大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，PDE2A 在非壓迫性腰椎間盤突出大鼠模型的脊髓背角中表達(dá)上調(diào)，而鞘內(nèi)注射Bay 60-7550（0.1 mg/kg 或1 mg/kg）可減輕大鼠機(jī)械性痛覺過敏，降低脊髓后角中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平，產(chǎn)生抗炎和鎮(zhèn)痛的效果，且具有劑量依賴效應(yīng)[13]。本研究采用脊髓損傷大鼠模型，發(fā)現(xiàn)術(shù)后7～21 天模型大鼠產(chǎn)生明顯的機(jī)械性痛覺過敏；且對術(shù)后7天大鼠損傷區(qū)尾側(cè)脊髓背角進(jìn)行免疫組化染色和Western blot 蛋白定量檢測，發(fā)現(xiàn)SCI 大鼠脊髓背角PDE2A 免疫陽性水平和蛋白表達(dá)升高。我們推測SCI 大鼠脊髓背角PDE2A 的過表達(dá)可能與SCI-NP的產(chǎn)生有關(guān)。鞘內(nèi)注射Bay 60-7550 (1 mg/kg) 1周后，脊髓損傷大鼠機(jī)械性痛覺超敏明顯減輕，脊髓背角PDE2A 表達(dá)顯著減少，脊髓組織中促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6) 明顯減少，且抗炎細(xì)胞因子 (IL-10、TGF-β) 明顯升高。因此，推測鞘內(nèi)注射PDE2A 選擇性抑制劑Bay 60-7550 具有抑制SCI 大鼠脊髓背角中PDE2A 的表達(dá)，減輕脊髓背角神經(jīng)炎癥反應(yīng)，緩解SCI 大鼠機(jī)械性痛覺超敏的作用。

眾多研究表明，SCI 后脊髓背角神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生許多分子信號變化，包括神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子的表達(dá)或釋放，細(xì)胞內(nèi)第二信使、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及蛋白激酶 (protein kinase A, PKA; protein kinase C, PKC)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (extracellular regulated protein kinases, ERK) 激活的細(xì)胞內(nèi)信號通路等，對中樞敏化的產(chǎn)生具有重要作用[23]。PDE2A是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使的關(guān)鍵酶，這些證據(jù)表明PDE2A 在脊髓背角的分布及參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用可能與中樞敏化的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)有關(guān)。但PDE2A參與調(diào)節(jié)中樞敏化的具體機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)炎癥在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Ji 等[24]提出脊髓神經(jīng)炎癥通過神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用可導(dǎo)致疼痛。脊髓損傷后單核細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等激活釋放大量炎性物質(zhì)，其中組織內(nèi)駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞和血源性浸潤的巨噬細(xì)胞大量聚集于損傷區(qū)域[25]。生理?xiàng)l件下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于M0 靜止表型；脊髓損傷后由于局部微環(huán)境的改變，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞發(fā)生促炎（M1 型）或抗炎（M2 型）表型的極化，并以M1 型占優(yōu)勢，此時促炎與抗炎之間的平衡被打破[26]。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子加重神經(jīng)炎癥，并進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，從而形成炎癥反應(yīng)與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞之間的正反饋級聯(lián)環(huán)路，導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮[27]。因此，持續(xù)的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化之間的反饋調(diào)節(jié)可能參與脊髓損傷后中樞敏化的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠SCI 術(shù)后7 天流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞大量激活，且以M1 表型為主，這一研究結(jié)果與報道一致[28]。

有研究表明，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎作用介導(dǎo)了NP 的形成，而M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎作用對NP 起到一定緩解作用，且NP 與M1/M2 小膠質(zhì)細(xì)胞比例增加有關(guān)[29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI 大鼠鞘內(nèi)注射Bay 60-7550 后7 天，流式細(xì)胞儀中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞M1/M2 表型極化狀態(tài)顯著改變，M1 型細(xì)胞明顯減少，M2 型細(xì)胞顯著升高。同時本研究結(jié)果還顯示，M2 表型標(biāo)志物(CD163)的表達(dá)顯著升高，抗炎細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)水平明顯升高，機(jī)械性痛覺超敏緩解；相反，M1 型表面標(biāo)記物 (CD86) 和促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)生成減少。此外，Detloff 等[30]證明TNF-α 和IL-1β 參與了SCI 后機(jī)械性痛覺超敏的發(fā)展，而IL-6 參與了機(jī)械性痛覺超敏的維持。根據(jù)這些結(jié)果，可推測Bay 60-7550 可能參與驅(qū)動小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞從M1表型向M2 表型的轉(zhuǎn)化，且具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用。

但本研究僅觀察了鞘內(nèi)注射Bay 60-7550 對SCI 大鼠機(jī)械性疼痛和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響，未闡明PDE2A 與中樞敏化的具體機(jī)制及Bay 60-7550 對細(xì)胞極化作用的可能機(jī)制。Bay 60-7550 對大鼠SCI 的恢復(fù)及運(yùn)動改善情況仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行探究。

綜上所述，本研究證明了選擇性PDE2A 抑制劑Bay 60-7550在大鼠SCI-NP模型中具有鎮(zhèn)痛作用，并可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的極化，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。因此，PDE2A 可能是減輕SCI 后神經(jīng)病理性疼痛的潛在治療靶點(diǎn)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。