楊佳霖 全貞玉

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延邊 133002)

骨骼的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程稱(chēng)為骨代謝〔1〕。骨代謝的平衡是維持人體骨骼健康的重要基石,骨穩(wěn)態(tài)受成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收共同調(diào)控〔2〕。骨質(zhì)疏松是一種骨形成和骨吸收失衡所導(dǎo)致的代謝性、全身性骨骼疾病,表現(xiàn)為骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退變,繼發(fā)骨脆性增加,極易出現(xiàn)病理性骨折〔3〕。骨質(zhì)疏松發(fā)生與多種因素有關(guān),其主要危險(xiǎn)因素為長(zhǎng)期缺乏運(yùn)動(dòng)、雌激素下降及飲食結(jié)構(gòu)不合理等〔4〕。目前全球已進(jìn)入老齡化社會(huì),骨質(zhì)疏松已成為位居第三位的慢性疾病〔5〕。藥物治療在減緩骨質(zhì)流失,預(yù)防骨質(zhì)疏松方面取得一定療效,但都有一定副作用〔6〕。尋找一種新的行之有效的骨質(zhì)疏松治療方法十分必要。維生素(Vit)D對(duì)骨骼的保護(hù)作用已經(jīng)得到了證實(shí)。近年來(lái),益生菌在臨床方面的用途受到廣泛關(guān)注,有研究表明腸道菌群與腸道屏障等相互作用影響鈣吸收,對(duì)骨骼有保護(hù)作用〔7〕。本研究通過(guò)補(bǔ)充VitD和益生菌探討其聯(lián)合對(duì)骨代謝的影響及對(duì)骨骼的保護(hù)作用,基于腸道菌群的變化研究腸道菌群與骨質(zhì)疏松的關(guān)系,為VitD聯(lián)合益生菌防治骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 25-羥維生素D(上海賽可銳生物科技有限公司),達(dá)益喜【衡】益生菌(江蘇微康生物科技有限公司),大鼠VitD3、大鼠血鈣血磷、大鼠Ⅰ型膠原交聯(lián)C末端肽(CTX)、大鼠骨特異性堿性磷酸酶(B-ALP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司),大鼠血清鎂試劑盒(貝博生物科技有限公司);全波段Biotech酶標(biāo)儀(美國(guó)公司),Micro-CT(日本Rigaku公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 13月齡SPF級(jí)雌性SD中老年大鼠32只,體質(zhì)量在330～380 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001。 隨機(jī)分成對(duì)照組、VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組,每組8只。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑制備和給藥方法 VitD灌胃溶液:精確稱(chēng)取VitD3 0.2 mg,加入花生油1 ml,充分混勻,使維生素完全溶解,即得到濃度為200 μg/ml的維生素儲(chǔ)備溶液,將其放入4 ℃冰箱保存。灌胃時(shí)吸取儲(chǔ)備溶液1 μl,加入1 ml花生油進(jìn)行稀釋即可得到濃度為0.2 μg/ml的維生素D灌胃溶液。益生菌灌胃溶液:稱(chēng)取2 g益生菌粉,其中含有益生菌2×1010CFU,溶于20 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中,離心機(jī)搖勻,得到濃度為 1×109CFU/ml的益生菌灌胃溶液。對(duì)照組灌胃PBS和花生油,VitD組灌胃PBS和VitD溶液,益生菌組灌胃益生菌溶液和花生油,VitD+益生菌組灌胃益生菌溶液和維生素D溶液,連續(xù)4 w。益生菌于每日上午10點(diǎn)灌胃,灌胃濃度為1×109CFU/ml,每只大鼠灌胃1 ml〔8〕,VitD于每日下午2點(diǎn)灌胃,灌胃濃度為0.2 μg/ml,灌胃劑量為0.5 ml/kg〔9〕。

1.4檢測(cè)樣品制備 4 w后腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,記錄體質(zhì)量,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min離心10～15 min,取上清,于-80 ℃凍存待測(cè)。用銳利器械分離右側(cè)股骨,快速剝離股骨上附著的肌肉和結(jié)締組織,放入-80 ℃冰箱保存待測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d,收集大鼠新鮮糞便置于無(wú)菌PE管中,注意避免毛發(fā)污染,保存于-80 ℃冰箱中凍存待測(cè)。

1.5血清礦物質(zhì)指標(biāo)檢測(cè) 使用大鼠血鈣、血磷ELISA試劑盒檢測(cè)血清中鈣、磷的含量,具體步驟按照說(shuō)明書(shū),用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。使用血清鎂試劑盒測(cè)定大鼠血清鎂含量,具體步驟及公式按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.6血清骨代謝相關(guān)酶檢測(cè) 采用大鼠CTX ELISA試劑盒、大鼠B-ALP試劑盒檢測(cè)CTX、B-ALP含量,實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.7骨組織參數(shù)檢測(cè) 將大鼠股骨放入Micro-CT掃描儀中,掃描部位為股骨頭,設(shè)置分辨率為10 μm,掃描時(shí)間為5 min,輸入其他相應(yīng)參數(shù)后,確保股骨頭處于掃描畫(huà)框內(nèi)后開(kāi)始掃描,得到掃描CT圖像,利用Ctan軟件得到骨組織參數(shù),包括骨密度(BMD)、骨體積(BV)、所選ROI體積(TV)、相對(duì)骨體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

1.8糞便腸道菌群檢測(cè) 大鼠腸道菌群檢測(cè)委托于北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)大鼠腸道菌群的組成、菌種和菌屬。選擇擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6 S V4區(qū),引物序列為正向:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′,反向:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)后,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾,得到有效數(shù)據(jù);然后基于有效數(shù)據(jù)通過(guò)DADA2進(jìn)行降噪,獲得ASVs特征序列,采用QIIME2的classify-sklearn算法對(duì)每個(gè)ASV使用Naive Bayes分類(lèi)器進(jìn)行物種注釋,根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各種特征表,獲得腸道菌群界、門(mén)、綱、目、科、屬、種各水平物種信息。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。大鼠BMD和骨組織參數(shù)使用CTan軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組均毛發(fā)濃密富有光澤,精神狀態(tài)良好,行動(dòng)敏捷,活動(dòng)量、飲水量和攝食量無(wú)明顯差異,灌胃前后各組體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組灌胃前后體質(zhì)量

2.2各組血清礦物質(zhì)水平 與對(duì)照組比較,VitD+益生菌組的血清鈣水平明顯升高(P<0.05)。各組血清、磷、鎂無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清礦物質(zhì)水平及骨代謝生化指標(biāo)比較

2.3各組骨代謝生化指標(biāo)及骨密度水平 與對(duì)照組相比,VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組血清CTX水平明顯降低(P<0.05);與VitD組和益生菌組相比,VitD+益生菌組血清CTX水平明顯降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比,VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組血清B-ALP水平明顯升高(P<0.05),與VitD組和益生菌組相比較,VitD+益生菌組血清B-ALP水平明顯升高(P<0.05)。對(duì)照組相比較,益生菌組、VitD組和VitD+益生菌組BMD水平明顯升高(P<0.05)。VitD+益生菌組的BMD水平顯著高于VitD組和益生菌組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)結(jié)果 與對(duì)照組相比,VitD組和VitD+益生菌組BV/TV值明顯升高(P<0.05),VitD組、益生菌組和VitD+益生菌組Tb.Th明顯升高(P<0.05),VitD+益生菌組的Tb.Th顯著高于VitD組和益生菌組(P<0.05)。與對(duì)照組、VitD組和益生菌組相比,VitD+益生菌組Tb.Sp明顯升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比,益生菌組和VitD+益生菌組SMI值明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)比較

2.5各組腸道菌群變化情況 圖1顯示門(mén)水平上4組腸道菌群分布最多的是厚壁菌門(mén)(Firmicutes),其次為擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)。圖2表明4組中乳桿菌屬(Lactobacillus)富集顯著為優(yōu)勢(shì)菌,其中VitD+益生菌組中乳桿菌屬占比最高,約占序列總數(shù)的25%。益生菌組和VitD+益生菌組的Chao1指數(shù)顯著高于VitD組和對(duì)照組(P<0.05)。益生菌組的shannon指數(shù)顯著高于VitD組(P<0.05)。見(jiàn)表4。PCA分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和VitD組距離較近,表明對(duì)照組和VitD組的腸道菌群組成相似;益生菌組和VitD+益生菌組與其他組距離較遠(yuǎn),菌群組成相似度較低。見(jiàn)圖3。NMDS統(tǒng)計(jì)反映群落結(jié)構(gòu)4組樣本重合部分較少,聚類(lèi)圈顯示聚集傾向不同,說(shuō)明4組腸道菌群組成是不同的。見(jiàn)圖4。

圖1 門(mén)級(jí)物種相對(duì)豐度

圖2 屬級(jí)物種相對(duì)豐度

圖4 腸道菌群NMDS分析

表4 各組腸道菌群多樣性

3 討 論

骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制是礦物質(zhì)代謝異常,鈣攝入過(guò)低,鎂攝入較高可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因之一〔10〕,血鈣、血鎂、血磷都是與骨代謝相關(guān)的礦物質(zhì),三者互相聯(lián)系、互相制約。研究表明腸道菌群可發(fā)酵食物產(chǎn)生短鏈脂肪酸,降低腸道局部pH,從而促進(jìn)鈣吸收〔11〕。Ghanem等〔12〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示食用益生菌可以使血漿中的鈣含量顯著增加,但食用益生菌對(duì)磷、鎂含量影響不大。本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn),VitD和益生菌可增加血清中鈣的水平,聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

骨代謝指標(biāo)是骨組織的代謝產(chǎn)物,骨生理狀態(tài)變化的敏感指標(biāo),該指標(biāo)有助于鑒別原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松,判斷骨轉(zhuǎn)換類(lèi)型、預(yù)測(cè)骨丟失狀況〔13〕。臨床上常見(jiàn)的骨代謝標(biāo)志物主要包括VitD、CTX、N端骨鈣素(N-MID)、B-ALP等〔14〕。VitD對(duì)骨的保護(hù)作用已得到充分證實(shí),研究表明長(zhǎng)期缺乏VitD會(huì)導(dǎo)致低鈣血癥和低磷血癥,造成與軟骨病或軟骨病相關(guān)的骨礦化受損〔15〕。CTX含量與骨吸收程度相關(guān),是骨吸收的特異性、敏感性指標(biāo),反映了破骨細(xì)胞活性,CTX含量越高表明破骨細(xì)胞的活性越高,骨吸收越活躍。B-ALP參與骨形成過(guò)程,是骨形成較靈敏標(biāo)志物之一,血清B-ALP測(cè)定可為骨質(zhì)疏松的早期診斷、治療效果和預(yù)后情況提供依據(jù)〔16〕。有研究表明益生菌可改善絕經(jīng)后婦女的骨密度,降低血清CTX含量,且不會(huì)增加不良反應(yīng)發(fā)生,對(duì)預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有一定作用〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)充VitD和益生菌可影響實(shí)驗(yàn)大鼠CTX和B-ALP水平,從而有助于維護(hù)骨骼健康。

腸道菌群影響骨代謝的主要途徑包括其改善腸道通透性,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收,調(diào)節(jié)免疫等〔18〕。益生菌通過(guò)改變腸道菌群,從而影響免疫系統(tǒng),炎癥因子與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞關(guān)系密切,當(dāng)腸道菌群變化時(shí),相應(yīng)的炎癥因子水平改變,成骨和破骨細(xì)胞的數(shù)量隨之改變〔19〕。益生菌和VitD具有協(xié)同作用,益生菌可以增加宿主體內(nèi)VitD和VitD受體表達(dá)及其活性〔20〕。益生菌能夠影響骨代謝,改善骨質(zhì)疏松,研究表明:腦-腸-腸道菌群軸、腦-骨軸、腸-骨軸是調(diào)節(jié)骨代謝的主要機(jī)制〔21〕。本實(shí)驗(yàn)表明:補(bǔ)充VitD和益生菌顯著增強(qiáng)大鼠骨密度,提升骨骼強(qiáng)度,改善骨小梁數(shù)量與形態(tài),改變骨微結(jié)構(gòu),減少骨丟失,從而在一定程度上改善骨質(zhì)疏松。Parvaneh等〔22〕的研究也表明補(bǔ)充雙歧桿菌可以導(dǎo)致骨小梁微結(jié)構(gòu)改變,改變股骨微觀結(jié)構(gòu),促進(jìn)骨形成,減少骨丟失。VitD3可以調(diào)節(jié)上消化道腸道微生物群,增強(qiáng)菌群豐度,從而保護(hù)胃腸道健康〔23〕。益生菌可以通過(guò)增加其在腸道中的數(shù)量及通過(guò)與其他細(xì)菌菌株競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌素來(lái)改變微生物群組成,且益生菌可以通過(guò)碳水化合物產(chǎn)生寡糖,寡糖進(jìn)一步被細(xì)菌代謝,代謝物還可進(jìn)一步改善微生物組成。擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是腸道微生物群的兩大優(yōu)勢(shì)菌群,對(duì)維持宿主新陳代謝有重要作用〔24〕,擬桿菌門(mén)參與碳水化合物發(fā)酵、糖類(lèi)代謝和膽汁酸代謝等,厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)相似,能夠有效吸收熱量,是一類(lèi)肥胖有關(guān)的菌群〔25〕。乳桿菌屬益生菌能夠抑制動(dòng)物腸道病原菌生長(zhǎng),維持腸道菌群平衡,刺激和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,減少疾病發(fā)生〔26〕。本研究表明,VitD和益生菌改變腸道菌群數(shù)量與結(jié)構(gòu),使有益菌增加,同時(shí)增加腸道菌群豐度、均勻度與多樣性,進(jìn)而在一定程度上改善骨代謝保護(hù)骨骼健康。為合理補(bǔ)充VitD和益生菌在預(yù)防骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展提供了理論依據(jù)。