鄭育秀 劉麗麗 黃澤波 王濤 劉莉芳

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科,海南 ?？?570311)

心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(CPB)是將血液引出至體外,經(jīng)體外氧合后重新輸回動(dòng)脈系統(tǒng)的生命支持技術(shù),現(xiàn)已被不斷應(yīng)用于心臟、動(dòng)脈等手術(shù)中〔1〕。然而,CPB是目前公認(rèn)的最易誘發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)的手術(shù)〔2〕。POCD臨床癥狀包括焦慮、神經(jīng)功能損傷、記憶能力衰退,嚴(yán)重影響患者的康復(fù),并限制了CPB的應(yīng)用。由于海馬神經(jīng)元狀態(tài)對(duì)于維持正常的認(rèn)知功能至關(guān)重要,海馬神經(jīng)元炎癥與凋亡是POCD形成的主要原因〔3〕。因此,探索潛在的海馬神經(jīng)元保護(hù)劑治療POCD是擴(kuò)大CPB在臨床中應(yīng)用的關(guān)鍵。丙泊酚是一種起效快、誘導(dǎo)平穩(wěn)、易蘇醒的麻醉藥物,廣泛應(yīng)用于外科患者的麻醉和重癥監(jiān)護(hù)室患者的鎮(zhèn)靜。研究表明,低劑量丙泊酚具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用,且已在缺血性腦卒中模型中得到許多文獻(xiàn)的證實(shí)〔4,5〕。然而,低劑量丙泊酚對(duì)CPB模型誘導(dǎo)POCD的影響的研究尚少。本研究探究丙泊酚對(duì)CPB誘導(dǎo)POCD的改善機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用48只SD大鼠,12月齡,體質(zhì)量500～600 g,SPF級(jí)。由海南藥物研究所有限責(zé)任公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(瓊)2020-0007。所有大鼠入組后喂養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物飼養(yǎng)室,使用許可證號(hào):SYXK(瓊)2017-0013。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(24±2)℃,濕度(60±5)%,自由飲食攝水。1 w后,將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照(Control)組,模型(Model)組,丙泊酚組,丙泊酚+LY294002(Propofol+LY294002),每組12只。CBP模型構(gòu)建前,丙泊酚+LY294002組大鼠連續(xù)3 d鼻滴LY294002,10 μg/只。CBP模型構(gòu)建當(dāng)日,以3%七氟烷麻醉大鼠,構(gòu)建CPB模型。結(jié)束后取丙泊酚,丙泊酚+LY294002組尾靜脈注射20 mg/kg丙泊酚。術(shù)中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作,術(shù)后3 d腹腔注射青霉素鈉。對(duì)照組不做任何處理。在CBP構(gòu)建后第31～35 d開展Morris水迷宮測(cè)試。取6只大鼠腦組織以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)炎性細(xì)胞因子含量。取3只大鼠腦組織切片,通過電生理測(cè)試檢測(cè)海馬突觸活性的長時(shí)程增強(qiáng)。取3只大鼠腦組織切片,采用尼氏(Nissl)染色檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)。最后,利用Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則,且符合國家衛(wèi)生部動(dòng)物保健研究所的指導(dǎo)方針,并經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器 丙泊酚(美國Sigma公司,批號(hào):56931);LY294002(美國MCE公司,批號(hào):846739);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司,批號(hào):3003-2793,3005-5943,3009-4831);Nissl染色試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)公司,批號(hào):G2830);Anti-Toll樣受體(TLR)4抗體、Anti-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗體、Anti-p-PI3K抗體、Anti-蛋白激酶B(Akt)抗體、Anti-p-Akt抗體、Anti-叉頭蛋白(Fox)O1抗體、Anti-p-Foxo1抗體、Anti-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司,批號(hào):b38729,b34304,b39201,b30439,b39483,b38493,b39843,b38490);Morris水迷宮(江蘇賽昂斯生物科技公司,型號(hào):SA201);膜片鉗系統(tǒng)(Axon,PClamp10.1 記錄分析軟件,MultiClamp 700B 放大器,MultiClamp 1550B 放大器);酶標(biāo)儀(Thermo,型號(hào):Fc);光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,型號(hào):BX53);電泳裝置(美國Biorad公司,型號(hào):Mini-protean Tetra);化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能生物公司,型號(hào):5200)。

1.3CPB模型構(gòu)建 CPB裝置主要由貯血器、蠕動(dòng)泵、膜式氧合器構(gòu)成,整個(gè)系統(tǒng)預(yù)充由乳酸林格溶液:6%羥乙基淀粉:甘露醇:碳酸氫鈉=11∶7∶1∶1的混合溶液。參考文獻(xiàn)〔6〕中大鼠CPB-POCD模型構(gòu)建方案,將大鼠麻醉后,氣管插管并接呼吸機(jī)通純氧氣,設(shè)置呼吸頻率60次/min。大鼠腹部皮膚消毒備皮,分離出雙側(cè)股動(dòng)脈,左側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管并固定,注射300 U/kg肝素并監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓,右側(cè)股動(dòng)脈用于血液動(dòng)脈灌注。大鼠頸部皮膚消毒備皮,分離右側(cè)頸內(nèi)靜脈并置管,緩慢插向心臟使導(dǎo)管前端位于右心房處,結(jié)扎固定套管。開始CPB,將右心房血液引流至貯血器,經(jīng)蠕動(dòng)泵泵入氧合器再經(jīng)右股動(dòng)脈回輸,設(shè)置流速約100 ml/(kg·min)。氧合器以0.2 L/min純氧供氧,整個(gè)過程維持大鼠恒溫38～39 ℃。60 min后,停止CPB,待血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定后逐層縫合傷口。對(duì)照組完全麻醉后,備皮消毒,分離出雙側(cè)股動(dòng)脈與右側(cè)頸靜脈,左側(cè)股動(dòng)脈穿刺置管,連接壓力表監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP),維持60 min。

1.4Morris水迷宮測(cè)試 Morris水迷宮儀器是1個(gè)直徑1.2 m、深50 cm的圓形水池,分4個(gè)象限。第Ⅰ象限中設(shè)置1個(gè)低于水面1 cm、直徑12 cm的平臺(tái),水池壁上貼有不同圖形幫助大鼠游泳時(shí)定位。訓(xùn)練期間,將大鼠自各個(gè)象限依次投入水中,記錄大鼠90 s內(nèi)尋找平臺(tái)時(shí)間,取平均時(shí)間記為逃避潛伏期,共4 d。測(cè)試期間,撤去平臺(tái),將大鼠自第Ⅲ象限區(qū)域投入水中,記錄大鼠90 s內(nèi)首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間。

1.5海馬神經(jīng)元電生理檢測(cè) 將大鼠處死后使用預(yù)冷的氧飽和高糖切片緩沖液心臟灌流,取腦組織制備橫向海馬切片,約400 μm。參考文獻(xiàn)〔7〕測(cè)試方法,將切片轉(zhuǎn)移至32 ℃的氧飽和人工腦脊液(ACSF)中平衡。在腦組織 CA1 區(qū)使用聚四氟乙烯涂層的鎢絲單極電極(A-M Systems)以 0.017 Hz(雙相脈沖,0.1 ms 半波持續(xù)時(shí)間)刺激沙弗側(cè)支連合通路引起基線場(chǎng)興奮性突觸后電位(fEPSPs)。用充滿 ACSF 的玻璃微電極記錄。在基線記錄期間,調(diào)整刺激強(qiáng)度以引發(fā) fEPSP,初始斜率值為 200 μA 電流時(shí)引發(fā)的最大值的 40 %,固定電極與刺激強(qiáng)度。在基線穩(wěn)定記錄20 min后, 應(yīng)用高頻刺激誘發(fā)長時(shí)程增強(qiáng)(LTP),連續(xù)20串高頻脈沖,每串包含200個(gè)脈沖,頻率為200 Hz,波寬200 μs,串間隔30 s,高頻刺激連續(xù)記錄60 min。

1.6炎癥細(xì)胞因子測(cè)試 大鼠麻醉后取海馬組織,加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)勻漿,離心(12 000 r/min,30 min),取上清液,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)TNF-α,IL-6與IL-1β試劑盒說明書,在預(yù)包被板ELISA板中加入檢測(cè)樣品與檢測(cè)抗體,孵育1.5 h,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素孵育30 min,每孔加入顯色底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB),10 min后加入終止液,在450 nm處檢測(cè)最大吸收波長。

1.7Nissl染色 將大鼠處死后,使用預(yù)冷的PBS灌注,以多聚甲醛固定后石蠟包埋,切片。取石蠟切片脫蠟至水,將切片浸入焦油紫染色液中,將染缸于56 ℃下浸染1 h,去離子水沖洗,將切片浸入尼氏分化液中分化1 min,無水乙醇迅速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.8Western印跡 將大鼠處死后取海馬區(qū)組織,加入裂解液勻漿,離心(12 000 r/min,30 min),取上清液,加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min。取十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn),每孔樣品上樣10 μg。濕法轉(zhuǎn)膜將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,4 %脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃條件下一抗稀釋液孵育過夜。次日,室溫條件下,二抗稀釋液孵育1 h。將發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上,自動(dòng)成像儀成像。結(jié)果用ImageJ軟件定量分析,以目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin的灰度值比值作為最終量化統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1丙泊酚對(duì)CPB-POCD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 各組經(jīng)歷了多日的水迷宮訓(xùn)練后,逃避潛伏期均明顯減少(P<0.05)。與對(duì)照組相比,模型組逃避潛伏期在第3天與第4天均出現(xiàn)了明顯的增加(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組在第4天逃避潛伏期明顯減少(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY-294002組在第4天逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)。水迷宮測(cè)試中,與對(duì)照組相比,模型組首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間明顯增加(P<0.05),第Ⅰ象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與模型組相比,丙泊酚組首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間明顯減少(P<0.05),第Ⅰ象限停留時(shí)間明顯增加(P<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294002組首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間明顯增加(P<0.05),第Ⅰ象限停留時(shí)間明顯減少(P<0.05),穿越平臺(tái)次數(shù)減少,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮訓(xùn)練中逃避潛伏期及測(cè)試指標(biāo)比較

2.2丙泊酚對(duì)CPB-POCD大鼠長時(shí)程電位的影響 與對(duì)照組相比,模型組長時(shí)程電位明顯降低(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組長時(shí)程電位明顯增加(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294002組長時(shí)程電位明顯減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組長時(shí)程電位比較

2.3丙泊酚對(duì)CPB-POCD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)的影響 對(duì)照組海馬CA1區(qū)Nissl染色顯示,神經(jīng)元密集且細(xì)胞間排列整齊,數(shù)量密集,細(xì)胞質(zhì)輪廓清晰,且胞質(zhì)中Nissl體數(shù)量較多;模型組神經(jīng)元數(shù)量較少,細(xì)胞膜破裂且鮮有Nissl體分布;與模型組相比,丙泊酚組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元狀態(tài)明顯改善,而丙泊酚+LY294002組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)損傷。見圖2。

圖2 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元(Nissl染色,×100)

2.4丙泊酚對(duì)CPB-POCD大鼠炎性細(xì)胞因子的影響 與對(duì)照組相比,模型組腦組織中IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯增加(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組腦組織中IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯減少(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294002組腦組織中IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中炎性細(xì)胞因子含量及海馬區(qū)TLR4/Akt/FoxO1信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

2.5丙泊酚對(duì)CPB-POCD大鼠海馬TLR4/FoxO1與PI3K/Akt蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,模型組海馬中TLR4表達(dá)明顯增加,p-PI3k、p-Akt、p-FoxO1表達(dá)明顯減少(P<0.05);與模型組相比,丙泊酚組海馬中TLR4表達(dá)明顯減少,p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1表達(dá)明顯增加(P<0.05);與丙泊酚組相比,丙泊酚+LY294001組海馬中TLR4表達(dá)明顯增加,p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見表2、圖3。

1～4:對(duì)照組、模型組、丙泊酚組、丙泊酚+LY294002組

3 討 論

CPB誘導(dǎo)的POCD嚴(yán)重降低心臟手術(shù)患者的生活質(zhì)量,限制CPB在臨床上的應(yīng)用。研究調(diào)查顯示,有3%～6%經(jīng)歷CPB的患者會(huì)出現(xiàn)明顯腦功能缺陷癥狀,部分患者腦損傷率可高達(dá)60%～70%,且約有30%患者POCD癥狀會(huì)持續(xù)到6個(gè)月以上〔8〕。POCD患者臨床表現(xiàn)為焦慮、神經(jīng)功能損傷、記憶能力衰退。本研究結(jié)果提示,CPB-POCD模型大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能明顯損傷,即本研究POCD模型構(gòu)建成功。

Meta分析顯示,老齡患者的外科手術(shù)過程中,丙泊酚會(huì)引起POCD,其機(jī)制可能涉及GABA受體功能增強(qiáng),海馬神經(jīng)元突觸的長時(shí)程增強(qiáng)抑制〔9〕。此外,170 mg/kg丙泊酚麻醉2 h會(huì)導(dǎo)致老齡小鼠遠(yuǎn)期的β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積,造成神經(jīng)元凋亡〔10〕。且150 mg/kg丙泊酚連續(xù)注射30 d會(huì)不可逆得引起小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙〔11〕。因此,高劑量丙泊酚麻醉會(huì)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡并造成POCD。然而,丙泊酚也被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制主要涉及維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性,從而抑制POCD發(fā)生〔10〕。腦卒中研究顯示,15 mg/kg丙泊酚通過調(diào)控炎癥小體(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1信號(hào)通路,抑制炎性小體的生成,發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用〔12〕。帕金森病研究中,100 mg/kg丙泊酚通過調(diào)控抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá)與促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá),減少帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡〔13〕。因此,丙泊酚的治療作用與不良反應(yīng)主要與其劑量相關(guān)。本研究中丙泊酚劑量為20 mg/kg,屬于較低的應(yīng)用劑量,展現(xiàn)中樞神經(jīng)的保護(hù)作用,逆轉(zhuǎn)了CPB手術(shù)造成的大鼠POCD癥狀。

TNF-α、IL-6、IL-1β是一類調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥和免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng),是POCD發(fā)病的重要病理因素之一〔14〕。TLR4作為一種模式識(shí)別受體,在與其配體結(jié)合后會(huì)招募信號(hào)適配器并啟動(dòng)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的釋放。PI3K/Akt信號(hào)通路則通過抑制TLR4活化在機(jī)體內(nèi)抗炎癥反應(yīng)作用,其中涉及轉(zhuǎn)錄因子FoxO1的調(diào)控〔15〕。FoxO1通過與TLR4基因多個(gè)增強(qiáng)子原件結(jié)合,活化TLR4信號(hào)。而PI3K激活則誘導(dǎo)Akt活化,引起FoxO1磷酸化而失活,從而抑制TLR4信號(hào)通路,形成一個(gè)炎癥的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制〔16〕。研究顯示,黃芩苷可以通過活化PI3K/Akt/FoxO1表達(dá)引起小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4表達(dá)下調(diào)〔17〕。因此,本研究認(rèn)為丙泊酚調(diào)節(jié)CPB誘導(dǎo)的POCD是通過活化PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的。

綜上,丙泊酚以劑量依賴的方式影響海馬神經(jīng)元,低劑量的丙泊酚通過活化PI3K/Akt信號(hào)通路,增加FoxO1的磷酸化,從而減少TLR4表達(dá),減輕了CPB誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)與POCD癥狀。