王瀟然 于欣 王永杰 王勇 廉吉虎 李震霄 董春麗 宋海濤 張靚靚 張海濤

(吉林省人民醫(yī)院,吉林 長春 130021)

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,全球男性癌癥死亡的第五大原因,在加勒比地區(qū)(29/10 萬) 和非洲(19.9/10 萬) 等黑人種族國家中死亡率最高〔1〕。 與歐美國家相比,我國前列腺癌具有發(fā)病率低(10.23/10萬男性人口)、疾病確診時分期偏晚,近年來發(fā)病率快速升高等特點〔2〕。糖酵解對于癌細胞維持其強大的生物合成和能量需求至關(guān)重要,它可以促進腫瘤的發(fā)生、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解的關(guān)鍵限速酶,在PK催化下,磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)分子高能磷酸基團轉(zhuǎn)移給二磷酸腺苷(ADP)生成腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)〔3〕。 ATP的高速產(chǎn)生滿足能量需求,乳酸的大量積累促進腫瘤的發(fā)生。在很大程度上,腫瘤酸中毒反過來協(xié)同促進腫瘤生長,增強了對某些抗腫瘤治療的耐藥性,并損害了抗腫瘤免疫〔4〕。PKM2已被證明在多種癌癥中過表達,并促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。用短發(fā)夾RNA(shRNA)敲除PKM2的表達并用PKM1替代,降低了人腫瘤細胞系在裸鼠移植中形成腫瘤的能力〔5〕。因此,PKM2是治療腫瘤中一個有趣的潛在靶點。本研究通過shRNA沉默PKM2觀察能否使人前列腺癌細胞株(PC3)在體外增加化療敏感性?；熕幬镞x用環(huán)磷酰胺(CTX),其是治療雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的二線藥物。研究結(jié)果表明PKM2可以作為提高化療效率的重要靶點。

1 材料和方法

1.1質(zhì)粒的構(gòu)建和擴增 PKM2的shRNA靶向序列為(5′-CCGGGCTGTGGCTCTAGACACTAAACTCG AGTTTAGTGTCTAG-3′),并使用對PK水平?jīng)]有影響的shRNA作為對照組(5′-CCGGGAGGCTTCTTATAAGTGTTTACTCGAGTAAACACTTATAAGAAGC C-3′)〔6〕。表達質(zhì)粒(pshRNA-pkm2和pshRNA-Con)由Genesi生物技術(shù)公司構(gòu)建(武漢,中國),Qiagen質(zhì)粒由Mega試劑盒(Qiagen,Hilden,德國)提取,并在-20 ℃下保存。

1.2腫瘤細胞系和細胞培養(yǎng) PC3細胞株購自美國 (Manassas,VA),并按照說明書進行培養(yǎng)。 PC3在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640中保存。細胞在含5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)生長。

1.3用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法分析細胞活力 將細胞以每孔1×104的密度接種于100 μl 96孔板的培養(yǎng)基中。當(dāng)細胞培養(yǎng)到65%～75%的融合度時,細胞被分別轉(zhuǎn)染到pshRNA-PKM2組(0.2 μg)、pshRNA-Con組(0.2 μg)、CTX組(2 μg/ml)、pshRNA-PKM2(0.2 μg)+CTX(2 μg/ml)組。細胞孵育48 h后,進行MTT實驗。未經(jīng)處理的細胞可作為100%細胞活力的指標(biāo)。用SpectraMAX酶標(biāo)儀(SpectraMaxL;分子設(shè)備,加州,美國)在570 nm波長處測定吸光度。

1.4流式細胞術(shù)分析細胞凋亡情況 將PC3細胞接種于6孔板中,每孔2×1052 ml培養(yǎng)基中。48 h后收集附著的和漂浮的細胞,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次。然后用膜聯(lián)蛋白V-FITC蛋白試劑盒(貝克曼-庫爾特,布雷亞,加州,美國)對細胞進行染色。用流式細胞儀(貝克曼-庫爾特)分析細胞凋亡情況。

1.5體內(nèi)抗腫瘤作用 8 w雄性裸鼠每只大鼠注射5×106PC3細胞。總結(jié)psh RNA-Con組(生理鹽水)、CTX組、 pshRNA-PKM2組、pshRNA-PKM2+CTX組大鼠的腫瘤生長情況。腫瘤的平均體積為60 mm3時開始治療。PKM2質(zhì)粒每天注射1次,連續(xù)注射10 d;CTX每周注射1次,連續(xù)注射3 w。在治療階段,每3 d測量1次腫瘤的寬度和長度,并如前所述計算腫瘤體積。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS11.5軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT比色法檢測細胞增殖情況 pshRNA-Con組細胞增殖率〔(1.36±0.056 5)%〕明顯高于pshRNA-PKM2組〔(0.77±0.166 3)%〕、CTX組〔(0.66±0.064 8)%〕、pshRNA-PKM2+CTX組〔(0.34±0.067 3)%,均P<0.05〕,pshRNA-PKM2+CTX組細胞增殖率明顯低于pshRNA-PKM2組和CTX組(均P<0.05),pshRNA-PKM2組和CTX組細胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 pshRNA-PKM2+CTX組細胞凋亡率〔(60.3±5.0)%〕明顯高于pshRNA-Con組〔(5.6±1.5)%〕、pshRNA-PKM2組〔(19.7±1.7)%〕、CTX組〔(37.6±3.1)%,均P<0.05〕。

2.34組腫瘤體積比較 4組第18天腫瘤體積差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),每隔4 d檢測大鼠腫瘤體積,均較前一次檢測腫瘤體積明顯增大(均P<0.05),第18天后,pshRNA-Con組同一時間點腫瘤體積均明顯高于其他3組,pshRNA-PKM2+ CTX組同一時間點腫瘤體積均明顯低于其他3組(均P<0.05)。見表1。

表1 4組腫瘤體積比較

3 討 論

糖酵解是癌細胞代謝葡萄糖的主要途徑,而在大多數(shù)正常細胞則是通過氧化磷酸化途徑代謝。在氧氣充足的條件下,癌細胞也會繼續(xù)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸,這種有氧糖酵解,被稱為瓦伯格效應(yīng),該效應(yīng)有利于多種癌癥的生長。逆轉(zhuǎn)瓦伯格效應(yīng)可能是一種有前景的新治療策略。 抑制糖酵解可導(dǎo)致B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)的細胞死亡激動因子(Bad)蛋白在Ser112位點的快速去磷酸化,從而使Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)定位于線粒體,從而導(dǎo)致大量細胞凋亡〔6〕。糖酵解抑制劑對線粒體有缺陷或缺氧條件下的癌細胞特別有效,這些細胞通常與常規(guī)抗癌藥物和放療的抵抗有關(guān)。因為有氧糖酵解在癌癥中很常見,而缺氧存在于大多數(shù)腫瘤微環(huán)境中〔6,7〕。

哺乳動物中PK中有四種亞型:M1、M2、L和R,在不同類型的細胞中表達的有差異;L型和R型在肝臟、腸道和紅細胞中表達。M1在骨和大腦等成人組織中表達,而M2在胚胎發(fā)育、未分化組織和腫瘤中表達〔8〕。PKM2受酪氨酸磷酸化調(diào)控,PKM2存在兩種形式,對底物PEP具有高親和力的四聚體形式或?qū)EP具有低親和力的二聚體形式。PKM2利用產(chǎn)生丙酮酸、乳酸和ATP的葡萄糖碳進行能量利用的能力取決于四聚體的形式,而PKM2結(jié)構(gòu)底物的生成依賴于二聚體形式。 四聚體表現(xiàn)為催化活性,而其二聚體則參與了致癌事件。PKM2以其二聚體的形式易位到細胞核,從而激活一系列參與癌細胞異常進展的基因〔9〕。PKM2除了維持持續(xù)的有氧糖酵解外,PKM2還在癌細胞中發(fā)揮其非代謝功能,以介導(dǎo)其增殖、逃避程序性細胞凋亡和其他致癌事件〔10〕。

與鄰近正常組織相比,PKM2在乳腺癌組織中強烈表達,PKM2的高表達與乳腺癌患者預(yù)后不良及化療耐藥性相關(guān),可用于預(yù)測化療敏感性。靶向PKM2可以逆轉(zhuǎn)化療耐藥性,為乳腺癌患者提供了一種有效的治療方法〔11〕。有研究表明PKM2在致癌hras驅(qū)動的尿路上皮腫瘤的生長和維持中發(fā)揮了重要作用。PKM2的顯著過表達與尿路上皮腫瘤的發(fā)生相一致,而PKM2的消亡則顯著減少了由HRas癌基因引起的尿路上皮腫瘤的形成〔12〕。PKM2調(diào)節(jié)hsp90介導(dǎo)的胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)前體蛋白的穩(wěn)定性,并促進癌細胞在缺氧時的存活〔13〕。沉默PKM2可顯著提高人肺腺癌A549細胞的放射敏感性及移植瘤的放射協(xié)同作用,其可能主要通過誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬發(fā)揮關(guān)鍵作用〔14〕。Guo等〔15〕利用shRNA抑制PKM2的表達,同時聯(lián)合順鉑處理A549肺癌細胞,結(jié)果顯示抑制PKM2的表達可以顯著增強化療藥物對癌細胞的殺傷作用。Meng等〔16〕發(fā)現(xiàn)沉默PKM2的表達在體內(nèi)外均可提高非小細胞肺癌對放療的敏感性。研究表明,PKM2作為一種蛋白激酶,可調(diào)節(jié)癌癥進展、化學(xué)耐藥性和免疫調(diào)節(jié)〔17,18〕。

降低PKM2的表達可能會阻止腫瘤細胞的代謝,并可能成為一種癌癥治療的新靶點。RNAi質(zhì)粒與CTX聯(lián)合抗腫瘤活性機制尚不清楚,抑制腫瘤生長是通過抗增殖作用和誘導(dǎo)細胞凋亡。細胞凋亡是對細胞損傷的一種反應(yīng),如化療藥物引發(fā)的DNA損傷。雖然絕大多數(shù)癌細胞糖酵解增加,并依賴該途徑來獲得足夠的能量供應(yīng),但眾所周知,足夠的ATP水平對于細胞凋亡的發(fā)生和進展是必需的。

pshRNA-PKM2和CTX聯(lián)合治療可增強其抗腫瘤活性。下調(diào)PKM2的表達可顯著抑制PC3細胞的生長和增殖。pshRNA-PKM2和CTX聯(lián)合不僅能顯著抑制PC3的生長, 且可誘導(dǎo)更多的PC3細胞凋亡。內(nèi)源性表達shRNA的質(zhì)?？梢栽谵D(zhuǎn)染48 h后成功地耗盡PC3細胞中高達80%的PKM2的表達。此外,通過PKM2的shRNA降低PKM2蛋白水平,可顯著抑制PC3細胞的生長速率。靶向PKM2的shRNA可以抑制PC3細胞的生長,增加化療對CTX的敏感性。分子靶向治療是腫瘤治療的未來發(fā)展方向。靶向PKM2的shRNA可以抑制PC3細胞的生長,增加對CTX的化療敏感性。