龐勇 王于藍(lán) 高勤

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1麻醉科,四川 南充 637000;2手術(shù)中心)

心肌缺血屬于一種病理生理狀態(tài),會(huì)影響心臟的泵血收縮和舒張功能,手術(shù)治療過(guò)程中易發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(MIRI),對(duì)患者治療和預(yù)后產(chǎn)生不利影響〔1〕。外源性阿片藥物舒芬太尼為目前臨床廣泛應(yīng)用的麻醉藥,相關(guān)研究表明其可模擬缺血預(yù)處理減輕MIRI〔2〕。既往研究發(fā)現(xiàn),缺血后處理可通過(guò)激活線粒體ATP敏感性鉀通道(mito-KATP)發(fā)揮心臟保護(hù)作用〔3〕。而縫隙連接蛋白(Cx)43作為一種組成心肌縫隙連接的特殊通道蛋白可形成縫隙連接,其正常表達(dá)與分布是保證心臟心肌細(xì)胞間正常電傳導(dǎo)的重要條件,且研究證實(shí)缺血后可通過(guò)Cx43磷酸化程度對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用〔4,5〕。盡管mito-KATP與Cx43均被證實(shí)參與了MIRI的病理生理過(guò)程〔6,7〕,但截至目前關(guān)于舒芬太尼預(yù)處理與mito-KATP及其對(duì)心肌細(xì)胞Cx43之間的影響關(guān)系仍鮮有報(bào)道。本研究擬制備離體MIRI模型,評(píng)價(jià)舒芬太尼預(yù)處理對(duì)離體大鼠心肌細(xì)胞Cx43的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量200～250 g,購(gòu)于鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng),生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2019-0002。在溫度21～25 ℃,濕度40%～60%,12 h黑白交替,正常飲水?dāng)z食條件下常規(guī)飼養(yǎng)7 d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器 枸櫞酸舒芬太尼注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20203651);5-羥基葵酸鈉(5-HD)(武漢易泰科技有限公司上海分公司,貨號(hào):HY-136615);K-H液(118.5 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4、1.2 mmol/L KH2PO4、2.5 mmol/L CaCl2、25.0 mmol/L NaHCO3、11.0 mmol/L葡萄糖)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液、Trizol試劑、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(美國(guó)Abcam公司,貨號(hào)分別為:ab197234、ab150077、ab118623、ab16324、ab163954);4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液、蘇木素染色液、伊紅染色液(自北京諾博萊德科技有限公司,貨號(hào)分別為:152635、163241、155395);小鼠抗人Cx43)、磷酸化(p)-Cx43單克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體、抗GAPDH兔多克隆抗體(上海信裕生物科技有限公司,貨號(hào)分別為:120662、120513、120657、121532);Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司,型號(hào):DB040);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號(hào):41201ES25);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C1062S);Nikon SMZ1500實(shí)體顯微鏡(日本尼康公司);激光掃描共聚焦顯微鏡(日本olympus公司,型號(hào):FV3000);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司,型號(hào):GelDoc IT TS2)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 將健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為缺血再灌注組(I/R組)、舒芬太尼預(yù)處理組(Sufen組)、mito-KATP特異性阻斷劑5-HD組(5-HD組)、舒芬太尼預(yù)處理+5-HD組(SH組),每組10只。

1.4離體心臟缺血再灌注損傷模型的建立及處理 腹腔注射麻醉大鼠,起效后迅速斷頭處死,固定褪毛,開(kāi)胸取出心臟,置于95%O2和5%CO2預(yù)充且4 ℃預(yù)冷的K-H液中,將心腔內(nèi)殘血排空后立即懸掛于Langendorff灌注架上,在37 ℃條件下采用K-H液(pH值7.35～7.45)以100 cm H2O,2 L/min的流量恒壓灌注。將自制的乳膠水囊置入左心室內(nèi),調(diào)節(jié)水囊容積使左心室舒張末壓維持在4～7 mmHg。對(duì)于心率(HR)<200次/min,左心室收縮壓(LVSP)<75 mmHg,早搏>2次/min的心臟不予選擇,缺少的心臟按上述方法重新制作補(bǔ)充。缺血區(qū)心肌局部發(fā)白,冠狀動(dòng)脈流量及左心室舒張壓(LVDP)較基礎(chǔ)值下降40%～60%〔8〕視為缺血成功。每只心臟平衡15 min后,I/R組持續(xù)灌注30 min后停止灌注,然后恢復(fù)灌注2 h;Sufen組與5-HD組分別灌注含舒芬太尼(10 nmol/L)、5-HD(100 μmol/L)的K-H液30 min;SH組于舒芬太尼預(yù)處理前10 min至缺血5 min灌注含舒芬太尼(10 nmol/L)和5-HD(100 μmol/L)的K-H液30 min。

1.5各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 分別于平衡末(T1)、缺血前(T2)、再灌注末(T3)記錄各組HR、LVSP、LVDP、左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.6各組心肌梗死面積測(cè)定 再灌注結(jié)束后隨機(jī)選取每組2個(gè)心臟,采用生理鹽水沖洗干凈后減去心房和右心室組織,置于-80 ℃冰箱冷凍2 h后取出,沿心臟長(zhǎng)軸方向切薄片,厚度為1～2 mm,使用TTC染色20 min,生理鹽水沖洗后使用Nikon SMZ1500實(shí)體顯微鏡拍照,并在Image Pro軟件中分析計(jì)算梗死面積。

1.7各組Cx43的平均光密度(AOD)測(cè)定 再灌注結(jié)束后隨機(jī)選取每組3個(gè)心臟,切取1 mm3左心室組織制成冰凍切片,放于研缽中,加入液氮充分研磨至粉末,使用Triton X-100在室溫下封閉30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,滴加小鼠抗人Cx43單克隆抗體(1∶100稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜,PBS清洗,加入羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶100稀釋),室溫避光孵育1 h,PBS清洗后用DAPI染色,室溫避光孵育10 min,最后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,并應(yīng)用Image Analysis System11.0圖像分析軟件計(jì)算Cx43的AOD值。

1.8各組Cx43 mRNA表達(dá)情況檢測(cè) 再灌注結(jié)束后隨機(jī)選取每組2個(gè)心臟,切取1 mm3左心室組織制成冰凍切片,使用Trizol試劑提取左心室組織總RNA,使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,然后進(jìn)行PCR,總反應(yīng)體系為20 μl。引物序列如下:Cx43正向5′-GCCAATGCGGTGTTTACATTAT-3′,反向5′-CACTCTAGGCAATCCCCATCTA-3′;GAPDH正向5′-CGATGCGCGCTGATCGCCC-3′,反向5′-AGGGGG-GCTAAGCAGTTGGT-3′。采用2-ΔΔCt法分析各組Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.9各組Cx43蛋白及p-Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 再灌注結(jié)束后選取每組剩下的3個(gè)心臟,切取1 mm3左心室組織制成冰凍切片,放于研缽中,加入液氮充分研磨至粉末,加入蛋白裂解液提取總蛋白,對(duì)蛋白濃度和純度進(jìn)行測(cè)定,電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,置于5%脫脂牛奶中封閉2 h,在一抗溶液(稀釋濃度1∶500)中4 ℃孵育過(guò)夜,Tis-HCI緩沖液清洗后,在二抗溶液(稀釋濃度1∶5 000)中室溫孵育2 h,Tis-HCl緩沖液清洗后采用化學(xué)發(fā)光法顯色,在凝膠成像分析系統(tǒng)中分析蛋白條帶,Labworks4.6軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差或重復(fù)測(cè)量方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同時(shí)刻血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 I/R組、Sufen組、5-HD組、SH組T1、T2時(shí)HR、LVSP、LVDP、±dp/dtmax差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);T3時(shí),與Sufen組比較,I/R組、5-HD組、SH組HR、LVSP、±dp/dtmax均下降,LVDP均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)刻血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.2各組心肌梗死面積比較 I/R組、Sufen組、5-HD組、SH組心肌梗死面積分別為(22.36±2.31)%、(8.89±1.17)%、(23.36±2.50)%、(21.28±2.38)%,4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Sufen組比較,I/R組、5-HD組、SH組均增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組心肌細(xì)胞Cx43的AOD比較 I/R組、Sufen組、5-HD組、SH組Cx43的AOD值分別為8.48±0.89、25.89±2.64、8.62±1.12、9.31±1.08,4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Sufen組比較,I/R組、5-HD組、SH組Cx43的AOD值均減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);見(jiàn)圖1。

綠色為細(xì)胞核,Cx43呈紅色

2.4各組心肌組織Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 I/R組、Sufen組、5-HD組、SH組心肌組織Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.05、0.78±0.09、0.22±0.04、0.25±0.04,4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Sufen組比較,I/R組、5-HD組、SH組Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5各組心肌組織Cx43蛋白及p-Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 I/R組、Sufen組、5-HD組、SH組心肌組織Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.25±0.06、0.81±0.10、0.23±0.05、0.27±0.06),p-Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.22±0.03、0.79±0.08、0.21±0.03、0.24±0.05),4組Cx43蛋白及p-Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Sufen組比較,I/R組、5-HD組、SH組均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組Cx43、p-Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

在MIRI過(guò)程中,心肌細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列病理生理改變,使細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)受損,并啟動(dòng)細(xì)胞因子介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡甚至心臟驟?！?〕。研究發(fā)現(xiàn)MIRI是心血管疾病患者臨床預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔10,11〕。因此尋找新的靶點(diǎn)來(lái)減輕或抑制MIRI的發(fā)展成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

舒芬太尼已被研究證實(shí)在MIRI過(guò)程中可以發(fā)揮心肌保護(hù)作用,但其作用機(jī)制較復(fù)雜,涉及多種信號(hào)通路,目前仍存在一些爭(zhēng)議〔12〕。本研究結(jié)果說(shuō)明缺血再灌注可導(dǎo)致離體心臟損傷,影響大鼠HR和血流動(dòng)力學(xué),證實(shí)本研究大鼠離體MIRI模型制備成功,而Sufen組在T1、T2、T3血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)波動(dòng)范圍較小,說(shuō)明舒芬太尼預(yù)處理可在一定程度上減輕血流動(dòng)力學(xué)波動(dòng)。舒芬太尼作為一種μ阿片受體激動(dòng)劑,不僅具有良好的鎮(zhèn)痛效果,還具有良好的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性,可保證足夠的心肌氧供應(yīng)〔13〕。心肌梗死面積是心血管疾病患者預(yù)后的關(guān)鍵性因素,也是鑒定MIRI的金標(biāo)準(zhǔn)〔14〕。本研究結(jié)果說(shuō)明舒芬太尼能有效減輕大鼠缺血再灌注后的心肌梗死面積;mito-KATP參與MIRI病理生理過(guò)程,且舒芬太尼預(yù)處理對(duì)于心肌的保護(hù)作用極有可能是基于mito-KATP相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活來(lái)實(shí)現(xiàn),與其他相關(guān)研究〔15〕結(jié)果一致。但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

既往研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞縫隙連接參與MIRI,而Cx43是廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的Cx,參與形成縫隙連接及相關(guān)通道,該通道與心律失常、心肌組織損傷和纖維化有關(guān)的心臟疾病有關(guān)〔16〕。在MIRI過(guò)程中,Cx43及p-Cx43的表達(dá)與分布均發(fā)生不同程度改變,從而對(duì)心肌電活動(dòng)及心肌收縮舒張功能產(chǎn)生影響〔17〕。本研究說(shuō)明舒芬太尼預(yù)處理可增加心肌細(xì)胞間的Cx43蛋白表達(dá)。Whisenant等〔18〕表示,Cx43表達(dá)增加對(duì)于心律失常和缺血再修復(fù)均有積極作用。國(guó)外一項(xiàng)研究〔19〕調(diào)查顯示肽類Cx43治療劑在心臟修復(fù)醫(yī)學(xué)中有重要作用。本研究結(jié)果說(shuō)明舒芬太尼預(yù)處理可通過(guò)增加心肌Cx43表達(dá)發(fā)揮心臟保護(hù)作用。同時(shí),本研究結(jié)果說(shuō)明舒芬太尼預(yù)處理增加心肌細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)的機(jī)制可能與mito-KATP激活有關(guān)。在吳亞輝等〔20〕研究中,右美托咪定預(yù)處理對(duì)于離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用也與促進(jìn)Cx43表達(dá)及磷酸化和mito-KATP通道開(kāi)放有關(guān),本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相一致。Cx43可能參與調(diào)節(jié)線粒體K+內(nèi)流,而mito-KATP對(duì)調(diào)節(jié)線粒體K+內(nèi)流具有重要作用,線粒體K+內(nèi)流會(huì)增加ATP生成和活性氧,這些物質(zhì)可發(fā)揮良好的心肌保護(hù)效應(yīng)〔21〕。

綜上,Cx43與MIRI關(guān)系密切,舒芬太尼預(yù)處理減輕大鼠離體MIRI的作用機(jī)制可能與通過(guò)開(kāi)放mito-KATP通道促使Cx43蛋白表達(dá)有關(guān)。