李章春 孫海波 秦萍 梁子聰 趙洪賓 謝洪書

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,貴州 都勻 558000)

骨性關(guān)節(jié)炎是老年人的多發(fā)病和常見病,發(fā)病率約為20%,其中膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)的發(fā)病率高達(dá)80%〔1〕。KOA是一種慢性退行性疾病,以關(guān)節(jié)間隙狹窄、軟骨下骨密度增加和關(guān)節(jié)軟骨軟化剝脫為主要特征,與年齡、肥胖、運(yùn)動過度、機(jī)械損傷等因素關(guān)系密切,臨床常見表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動受限、畸形、功能障礙等〔2,3〕,嚴(yán)重影響患者的日常生活。目前,KOA的常用治療藥物主要是非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等,但是該類藥物易引發(fā)患者胃腸不適等不良反應(yīng),因此,療效也并不理想。中醫(yī)藥以副作用小,療效好的特點(diǎn),逐漸發(fā)揮出治療慢性病的優(yōu)勢〔4〕。魚腥草揮發(fā)油,具有抗病毒、抗炎等功效〔5〕,已應(yīng)用于部分疾病的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究,但有關(guān)KOA的相關(guān)研究卻鮮有報道。炎癥細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在KOA發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要的作用〔6,7〕,本研究探討魚腥草揮發(fā)油對KOA大鼠血清iNOS、MMP-3、MMP-13水平的影響。

1 材料與方法

1.1動物分組 健康SD大鼠60只,體質(zhì)量200～220 g,雌雄各半(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(湘)2019-0013)。動物隨機(jī)分為6組,正常組,模型組、陽性藥物組、魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組,每組10只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2試劑與藥物 白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、iNOS、MMP-3、MMP-13試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司,全自動酶標(biāo)儀:mindrady MR-96A;鹽酸氨基葡萄糖片(國藥準(zhǔn)字H20060647,江蘇正大清江制藥有限公司);注射用青霉素鈉(國藥準(zhǔn)字H13020431,華北制藥股份有限公司)。

1.3模型制備 遵照文獻(xiàn)方法〔8,9〕,乙醚麻醉大鼠,固定在操作臺上,取仰臥位,選取右側(cè)膝關(guān)節(jié)造模,備皮消毒后,從髕骨旁內(nèi)側(cè)行2 cm左右切口。正常組只切開皮膚,不破壞韌帶、半月板等組織,進(jìn)行縫合;其余各組采用改良Hulth法造模,打開關(guān)節(jié)腔,用鑷子向外側(cè)推髕骨至脫位,彎曲膝關(guān)節(jié),使前交叉和內(nèi)側(cè)副韌帶暴露,依次切斷兩個韌帶,摘除半月板,術(shù)中注意保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨面和其他組織,用無菌紗布按壓止血,生理鹽水清洗關(guān)節(jié)腔2～3次,后逐層進(jìn)行縫合。術(shù)后每組大鼠給予40萬U/d的青霉素肌肉注射,連續(xù)注射7 d。第8天驅(qū)趕大鼠進(jìn)行活動,2次/d,每次30 min,持續(xù)4 w,4 w后開始灌胃給藥。

1.4藥物提取與給藥 依據(jù)文獻(xiàn)〔10,11〕,100 g干魚腥草粉碎,料液與蒸餾水以1∶10的比例進(jìn)行混合,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中常溫浸泡10 h,70 ℃加熱回流10 h,停止加熱收集揮發(fā)油,用吐溫-80作乳化劑,溶于生理鹽水,配制成0.5%吐溫-80的揮發(fā)油制備液備用。灌胃給藥〔12〕,陽性藥物組以0.26 g/kg劑量灌胃鹽酸氨基葡萄糖水溶液,魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組以25、50、100 mg/kg劑量灌胃揮發(fā)油制備液,模型組和正常組給予無菌生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)灌胃6 w。

1.5膝關(guān)節(jié)腫脹檢測 用電子游標(biāo)卡尺分別于手術(shù)前、灌胃給藥后的第1、3、5、6周檢測各組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)的寬度,測3次取平均值,膝關(guān)節(jié)腫脹度=每次測量數(shù)值-手術(shù)前數(shù)值;電子數(shù)顯卡尺,精度0.01,靖江量具有限公司提供。

1.6實(shí)驗(yàn)取材 末次給藥的次日稱取大鼠體質(zhì)量,股動脈取血處死大鼠,靜置、離心,取上清液備用,ELISA法檢測各組血清IL-6、IL-8、TNF-α、iNOS、MMP-3、MMP-13含量,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。取右側(cè)膝關(guān)節(jié),剝離滑膜組織置于4%的多聚甲醛固定,取肝臟、腎臟、脾臟等組織,剝離脂肪,濾紙吸干稱重,計算臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.7標(biāo)本處理 取經(jīng)多聚甲醛固定的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,經(jīng)脫鈣、包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色等常規(guī)處理,光鏡下觀察病理組織的改變。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn),Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1魚腥草揮發(fā)油對KOA大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 灌胃給藥1 w后,與正常組比較,各實(shí)驗(yàn)組膝關(guān)節(jié)腫度均明顯增大(P<0.05),與模型組比較,各給藥組膝關(guān)節(jié)腫脹度差異不顯著(P>0.05),表明,造模因素已經(jīng)導(dǎo)致大鼠膝關(guān)節(jié)炎癥的引發(fā);灌胃給藥3、5、6 w,與模型組比較,各給藥組膝關(guān)節(jié)腫脹度均不同程度下降,其中,陽性藥物組和魚腹草揮發(fā)油高劑量組下降最為明顯(P<0.05),見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)腫脹度及血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

2.2魚腥草揮發(fā)油對KOA大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8含量的影響 與正常組比較,模型組和各給藥組血清TNF-α、IL-6、IL-8含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,除魚腥草揮發(fā)油低劑量組TNF-α外,陽性藥物組和魚腥草揮發(fā)油各劑量組血清TNF-α、IL-6、IL-8含量明顯降低(P<0.05),見表1。

2.3魚腥草揮發(fā)油對KOA大鼠血清iNOS、MMP-3、MMP-13含量的影響 與模型組比較,陽性藥物組和魚腥草揮發(fā)油低、中、高劑量組血清iNOS、MMP-3、MMP-13含量均不同程度降低,除魚腥草低劑量組iNOS、MMP-3外,各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。魚腥草揮發(fā)油高劑量組與陽性藥物組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組血清iNOS、MMP-3、MMP-13水平及肝臟、脾臟、腎臟器指數(shù)比較

2.4各組腎臟、肝臟、脾臟器指數(shù)比較 與正常組和模型組比較,陽性藥物組和魚腥草揮發(fā)油高劑量組腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)顯著升高,魚腥草揮發(fā)油中劑量組肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,陽性藥物組脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.5iNOS、MMP-3、MMP-13水平與TNF-α、IL-6、IL-8含量的相關(guān)性 KOA大鼠血清內(nèi)iNOS、MMP-3、MMP-13水平與TNF-α(r=0.830、0.814、0.868)、IL-6(r=0.831、0.789、0.871)、IL-8(r=0.933、0.877、0.962)含量均呈顯著正相關(guān)(均P<0.001)。

2.6魚腥草揮發(fā)油對KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變的影響 正常組膝關(guān)節(jié)滑膜組織厚度正常,細(xì)胞層次清晰,未見炎癥細(xì)胞浸潤;模型組膝關(guān)節(jié)滑膜組織明顯增厚,細(xì)胞排列、層次紊亂,見大量血管翳形成,毛細(xì)血管大量充血、水腫,纖維細(xì)胞增生,大量炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組進(jìn)行比較,可見魚腥草揮發(fā)油高、中、低劑量組膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)的血管翳形成數(shù)量、纖維細(xì)胞增生程度、炎癥細(xì)胞滲出數(shù)量及浸潤范圍均有不同程度改善,其中高劑量組膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥明顯減輕,僅有少量纖維細(xì)胞增生,炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少,與陽性藥物組膝關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)病變程度相近,見圖1。

圖1 各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理組織(HE染色,×400)

3 討 論

據(jù)研究,KOA在全球的發(fā)病率約為12%,我國的發(fā)病率為5.4%～30.5%〔13〕,在80歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)34.8%〔14〕,然而,KOA確切的發(fā)病機(jī)制還并不十分明確,雖然常用的非甾體抗炎藥物能夠發(fā)揮抗炎止痛的效果,但由于老年患者常伴隨基礎(chǔ)代謝性疾病,長期服用此類藥物,不僅易引發(fā)嘔吐、消化道出血,而且還會導(dǎo)致多種不良反應(yīng)〔15〕。為進(jìn)一步促進(jìn)中醫(yī)藥的發(fā)展,國務(wù)院于2016年頒發(fā)了《國務(wù)院關(guān)于印發(fā)中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016-2030年)的通知》,文件中強(qiáng)調(diào),要加強(qiáng)對慢性病、多發(fā)病、常見病中醫(yī)藥科學(xué)防治,要尋找新的中藥候選藥物,根據(jù)疾病的藥物靶標(biāo)進(jìn)行治療研究〔16〕。

魚腥草屬三白草科蕺菜屬植物蕺菜的全草或地上部分,主要分布在貴州、四川等長江流域以南的省份,揮發(fā)油是魚腥草主要的藥用成分,具有清除自由基、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等功效〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)〔18,19〕,魚腥草揮發(fā)油能夠降低大鼠和小鼠的TNF-α、IL-6等炎癥因子水平,對心肌缺血和骨質(zhì)疏松起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明,魚腥草揮發(fā)油能夠?qū)OA大鼠發(fā)揮抗炎作用,呈劑量依賴性。此外,在本研究中還發(fā)現(xiàn),魚腥草揮發(fā)油能夠?qū)OA大鼠血清iNOS、MMP-3、MMP-13水平起到抑制作用。

iNOS是一氧化氮合酶的一種亞型,與KOA的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系十分密切〔20〕。在KOA的早期,關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破壞,受破壞的軟骨細(xì)胞將蛋白釋放進(jìn)滑膜腔內(nèi),引發(fā)iNOS的表達(dá),并促進(jìn)一氧化氮的大量生成,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解,進(jìn)而引發(fā)滑膜炎。TNF-α、IL-6、IL-8等被認(rèn)為是KOA發(fā)病機(jī)制主要參與的細(xì)胞因子,能夠誘導(dǎo)iNOS的表達(dá),而iNOS能夠進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激反應(yīng),加速細(xì)胞因子對軟骨細(xì)胞的損壞〔21〕。本研究結(jié)果表明,魚腥草揮發(fā)油可能通過降低KOA大鼠細(xì)胞因子水平,對iNOS的表達(dá)發(fā)揮抑制作用,從而實(shí)現(xiàn)對KOA大鼠炎癥的緩解。MMPs是Ca2+、Zn2+等金屬離子依賴性的蛋白酶家族,能夠參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、分化與凋亡、組織重構(gòu)等多種生物學(xué)過程,根據(jù)作用底物分為6類,MMP-3是間質(zhì)溶解素類蛋白酶,MMP-13是膠原酶〔22,23〕。KOA發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)〔24,25〕,MMPs能夠使關(guān)節(jié)軟骨中的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖發(fā)生斷裂,使關(guān)節(jié)軟骨纖維結(jié)構(gòu)受到破壞,通過降低膠原纖維分子篩的濾過作用,加速相關(guān)酶對關(guān)節(jié)軟骨的降解和破壞作用,加重炎癥的引發(fā),而IL-1β等炎癥細(xì)胞因子,又能夠進(jìn)一步激活MMPs的合成,從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的進(jìn)一步加劇。臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)相關(guān)研究均發(fā)現(xiàn),MMP-3和MMP-13在患者和實(shí)驗(yàn)動物血清中都有高表達(dá)〔26,27〕。本研究結(jié)果表明,魚腥草揮發(fā)油能夠改善KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥且呈劑量依賴性。