王嬋 初麗敏 王燕云

(石家莊市第三醫(yī)院,河北 石家莊 050000)

胃癌是一種常見的癌癥,臨床上雖然其診斷和治療策略得到改善,但是晚期胃癌患者的預(yù)后仍然很差〔1〕。對胃癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的致病機(jī)制及臨床治療進(jìn)行探索和闡明具有積極意義。微小RNA(miR)是一類內(nèi)源性、長度在18～22 nt的非編碼RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié),在生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用〔2〕。目前已有充分證據(jù)表明miR能夠?qū)?xì)胞周期、增殖、凋亡和遷移產(chǎn)生影響,進(jìn)而導(dǎo)致多種腫瘤或者疾病的發(fā)生和發(fā)展,對miR深入研究和理解其調(diào)節(jié)機(jī)制及改善胃癌的治療具有重要的意義〔3〕。相對于癌旁正常組織,miR-451在胃癌組織中表達(dá)較低,且低表達(dá)患者的生存期較短,可作為胃癌患者的預(yù)后標(biāo)志物〔4〕,miR-203a-3P和miR-99b-5P能夠靶向胰島素樣生長因子(IGF)-1R進(jìn)而阻止胃癌的發(fā)生和發(fā)展〔5〕。研究表明miR-424-5P在多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá),例如肝癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等〔6〕。miR-424-5P在胃癌組織中有較高表達(dá),表明miR-424-5P能夠參與胃癌的調(diào)節(jié),但是其潛在機(jī)制還未明確。本文通過體外研究探討miR-424-5P對胃癌細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料 人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞(ATCC),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實際(Lipofectamine 2000,美國Invitrogen),miR-424-5P inhibitor、miR-424-5P mimics和陰性對照購自廣州銳博有限公司,RNA提取試劑盒購自北京康為有限公司,SYBR Green qPCR Master Mix 檢測試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司,Transwell小室和DMEM培養(yǎng)基購自美國Coring公司,胎牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青有限公司,四甲基噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司,二甲基亞砜(DMSO)購自北京鼎國有限公司,高遷移率族蛋白(HMG)A1報告基因載體構(gòu)建購自上海吉瑪有限公司,雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司,基質(zhì)膠購自美國BD公司,電化學(xué)發(fā)光(ECL)、細(xì)胞裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、SOX7抗體和GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌BGC-823細(xì)胞復(fù)蘇后,應(yīng)用10%胎牛血清,在5%二氧化碳和37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每1～2 d更換新鮮的培養(yǎng)基,細(xì)胞數(shù)量鋪滿瓶底80%以上時進(jìn)行傳代。將對數(shù)期生長細(xì)胞接種至96孔板中,培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁生長后用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,應(yīng)用miR-424-5P抑制物(inhibitor)轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞列為anti-miR-424-5P組。應(yīng)用Mimic作為陰性對照進(jìn)行轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞組標(biāo)記為anti-NC組,不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞列為對照組,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集各組BGC-823細(xì)胞,應(yīng)用RNA提取試劑盒將細(xì)胞內(nèi)總RNA提取,應(yīng)用分光光度計對RNA純度和濃度進(jìn)行檢測,應(yīng)用合格的RNA以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并以其為模板,參考SYBR GreenqPCR Master Mix檢測試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系包括cDNA 2 μl,2×SYBR Green 10 μl,ddH2O 6 μl及上下游引物各1 μl。反應(yīng)條件為94 ℃反應(yīng)5 min,然后再94 ℃反應(yīng)30 s,58 ℃反應(yīng)20 s,72 ℃反應(yīng)20 s,共反應(yīng)40個循環(huán),結(jié)束后生產(chǎn)Ct值,應(yīng)用2-ΔΔCt法對各組miR-424-5P的相對表達(dá)水平進(jìn)行計算,將U6作為內(nèi)標(biāo),實驗重復(fù)3次。

1.4MTT研究 將對數(shù)期生長的BGC-823細(xì)胞接種到96孔板中,參考1.2方法對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和分組,細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h后,應(yīng)用MTT實驗對細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測,在各個時間點每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵化4 h,傾倒上次培養(yǎng)液,加入150 μl DMSO,在震蕩儀上震蕩10 min,待沉淀溶解后,應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定光密度值,實驗重復(fù)3次,取均值。

1.5劃痕實驗 在6孔板背面均勻畫直線,每孔至少穿過5條線。將BGC-823細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)形成單層細(xì)胞,應(yīng)用滅菌槍頭在單層細(xì)胞上垂直畫直線。應(yīng)用PBS洗滌細(xì)胞3次,然后加入不含血清的培養(yǎng)基,然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,在顯微鏡(200倍)下測量細(xì)胞遷移距離。

1.6Transwell研究 應(yīng)用50～100 μl基質(zhì)膠包被的Transwell小室的基底膜,在4 ℃條件下風(fēng)干,收集各組BGC-823細(xì)胞,應(yīng)用無血清DMEM培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸,將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/ml,在小室中加入200 μl細(xì)胞懸液,下室中加入600 μl放入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,取出小室,用棉簽擦除上室細(xì)胞,用多聚甲醛固定液固定30 min,去除固定液,在室溫下風(fēng)干,用0.1%結(jié)晶紫染色液染色20 min,在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野拍照,對穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計算,實驗重復(fù)3次。

1.7免疫印跡實驗 對轉(zhuǎn)染48 h后各組BGC-823細(xì)胞進(jìn)行收集,加入200 μl細(xì)胞裂解液,在冰上進(jìn)行為期30 min裂解并提取細(xì)胞中的總蛋白,應(yīng)用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行檢測,選擇40 μg變性蛋白樣品進(jìn)行葡聚糖凝膠電泳對蛋白分離,將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜上,在5%脫脂奶粉中進(jìn)行2 h封阻,取出膜等滲鹽緩沖液(TBST)進(jìn)行3次洗膜,然后加入1∶3 000稀釋的二抗,在室溫下孵育2 h,應(yīng)用TBST洗膜3次,加入ECL化學(xué)發(fā)光液,在暗室中進(jìn)行曝光,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)對膠片進(jìn)行掃描,然后應(yīng)用ImageJ進(jìn)行分析,以GAPDH作為內(nèi)參,對各組HMGA1蛋白相對表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.8數(shù)據(jù)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗及多組間單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染miR-424-5P inhibitor對胃癌細(xì)胞miR-425-5P的表達(dá)影響 anti-miR-424-5P組miR-424-5P的相對表達(dá)量明顯低于對照組和anti-NC組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞miR-424-5P表達(dá)水平、敲低miR-424-5P對胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力的影響及miR-424-5P與HMGA1靶向調(diào)控關(guān)系

2.2胃癌細(xì)胞miR-424-5P敲低對其增殖能力影響 BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,anti-miR-424-5P組OD值顯著低于anti-NC組和對照組(P<0.05)。見表1。

2.3敲低miR-424-5P 對胃癌BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響 與anti-NC組和對照組比較,anti-miR-424-5P組遷移距離顯著較低(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 3組細(xì)胞遷移劃痕實驗結(jié)果(×200)

2.4敲低miR-424-5P對胃癌細(xì)胞侵襲能力影響 與anti-NC組和對照組比較,anti-miR-424-5P組BGC-823細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著較少(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 3組胃癌細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色,×100)

2.53組HMGA1蛋白表達(dá)與對照組和anti-NC組比較,anti-miR-424-5P組細(xì)胞HMGA1蛋白表達(dá)水平顯著較高(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 3組HMGA1表達(dá)

3 討 論

胃癌的發(fā)生及進(jìn)展涉及異常細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和轉(zhuǎn)移的多步驟和多因素過程,miR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過程中有相對重要的作用〔7〕。miR在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中一些miR認(rèn)為是腫瘤抑制基因,另一些被認(rèn)為是致癌基因。miR的異常表達(dá)能夠通過對靶基因抑制參與腫瘤的侵襲和增殖〔8〕。所以鑒定參與腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)生的特定miR及其靶標(biāo)對腫瘤的診斷、治療和預(yù)防有重要意義〔9〕。

miR-424-5P作為一種新發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤有密切關(guān)系的miRNAs生物分子,在多種惡性腫瘤中有異常表達(dá)且發(fā)揮不同的生物學(xué)功能〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5P在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系中均表達(dá)降低,其通過靶向抑制SMAD7信號通路所介導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲進(jìn)行抑制〔11〕。研究表明基底乳腺癌中miR-424-5P對雙腎上腺皮質(zhì)激素樣激酶(DCLK)1產(chǎn)生靶向作用,對乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖產(chǎn)生抑制作用,同時發(fā)揮抑癌作用〔12〕。也有研究表明,miR-424-5P在肝癌組織中表達(dá)較低,能夠通過對YES關(guān)聯(lián)蛋白(YAP)1產(chǎn)生抑制,進(jìn)而削弱肝癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔13〕。研究表明,miR-424-5P在胃癌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)形式〔14〕,但是miR-424-5P在胃癌中發(fā)揮的功能及其潛在的機(jī)制還有待研究〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中敲低miR-424-5P水平能夠明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

HMGA1能夠調(diào)節(jié)多個轉(zhuǎn)錄因子,作為癌基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用,在正常人中一般為表達(dá)缺失和低表達(dá),在癌癥患者中經(jīng)常出現(xiàn)過度表達(dá)〔16〕,前期研究表明,HMGA1過度表達(dá)和膀胱癌患者預(yù)后、復(fù)發(fā)、腫瘤分期和等級有密切關(guān)系,對HMGA1表達(dá)降低能夠降低細(xì)胞活性,阻滯細(xì)胞周期〔17〕。研究表明HMGA1能夠通過Wnt/β-連環(huán)素(catenin)信號通路參與宮頸癌的發(fā)展。HMGA基因相關(guān)的miR在垂體腺瘤重表達(dá)有所下調(diào),從而造成患者HMGA1和HMGA2表達(dá)上調(diào),但是在無功能的垂體腺瘤中,下調(diào)miR和HMGA1表達(dá)上調(diào)無關(guān),表明靶向HMGA基因的miR下調(diào)能夠增加人垂體腺瘤中HMGA蛋白表達(dá)〔18,19〕。miR能夠通過抑制HMGA1的轉(zhuǎn)錄從而抑制HMGA1的表達(dá)〔20〕。當(dāng)強(qiáng)制增強(qiáng)miR-296表達(dá)后,能夠上調(diào)HMGA1表達(dá),降低人前列腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖表明HMGA1能夠成為miR靶基因發(fā)揮作用〔21〕。本研究提示,miR-424-5P通過靶向調(diào)控HMGA1控制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

miR-424-5P能否成為臨床上治療胃癌的作用靶點,仍需要大量的體內(nèi)外數(shù)據(jù)證實,從而為胃癌的治療提供新的靶點和治療策略。