曾偉 馬民 李燕偉 蘆二永

(1河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,河南 洛陽(yáng) 471003;2洛陽(yáng)市中心醫(yī)院眼科)

鼻咽癌是起源于鼻咽上皮的頭頸部惡性腫瘤,國(guó)際癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2018年全球鼻咽癌新增病例高達(dá)129 079例〔1〕。東南亞和中國(guó)廣東是鼻咽癌高發(fā)地區(qū),雖然磁共振成像、調(diào)強(qiáng)放療及同步放化療已被廣泛應(yīng)用,但仍有30%患者最終出現(xiàn)復(fù)發(fā)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差〔2〕。因此,闡明鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,有望為鼻咽癌治療提供有效靶點(diǎn)。環(huán)狀RNA(circRNA)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的具有共價(jià)閉合連續(xù)環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA,其通過(guò)直接與微小RNA(miRNA)結(jié)合間接調(diào)節(jié)miRNA靶基因的表達(dá),參與調(diào)控癌細(xì)胞的惡性表型〔3,4〕。研究發(fā)現(xiàn),circRNA結(jié)合基序蛋白(circRBM)33在胃癌組織標(biāo)本、細(xì)胞株中顯著上調(diào),且CircRBM33的表達(dá)與胃癌的臨床特征密切相關(guān),沉默circRBM33可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔5〕。然而,鼻咽癌中circRBM33的表達(dá)模式和功能仍有待闡明。miR-3196是胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的抑制因子,miR-3196高表達(dá)能夠阻礙癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔6,7〕。miR-3196被預(yù)測(cè)為circRBM33的靶點(diǎn),但circRBM33是否通過(guò)靶向miR-3196影響鼻咽癌進(jìn)展尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)鼻咽癌組織中circRBM33、miR-3196表達(dá)水平,分析circRBM33、miR-3196的相互作用,揭示circRBM33靶向miR-3196對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1組織來(lái)源 收集2019年3月至2020年3月河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行內(nèi)鏡下活檢術(shù)并確診的鼻咽癌患者33例(女12例,男21例,年齡31～71歲,中位年齡47歲)的癌組織和配對(duì)正常癌旁組織,所有組織切除后立即放入液氮中冷凍,并保存在-80 ℃冰箱?；颊呔\斷為非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌,術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。本研究獲得患者書(shū)面知情同意,并經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批。

1.2細(xì)胞和試劑 人鼻咽癌細(xì)胞6-10B購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心;將circRBM33小干擾RNA(si-circRBM33)、小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、miR-3196模擬物(miR-3196 mimics)、miRNA模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-3196抑制物(miR-3196 inhibitor,anti-miR-3196)、miRNA抑制物陰性對(duì)照(anti-miR-NC組)、circRBM33過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-circRBM33)、空載質(zhì)粒(pcDNA)、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物公司;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自上海博谷生物公司;PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、SYBR-Green Master Mix購(gòu)自日本TaKaRa;包被基質(zhì)膠的Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒、鼠源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、鼠源上皮表型E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)單克隆抗體、兔源神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)多克隆抗體、羊抗鼠或羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京百奧萊博生物公司。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)circRBM33、miR-3196 mRNA相對(duì)水平 使用Trizol試劑臨床組織樣本中提取總RNA,分別利用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成miR-3196、circRBM33的互補(bǔ)DNA(cDNA),再用SYBR-Green Master Mix進(jìn)行RT-qPCR。用2-ΔΔCt方法分析circRBM33和miR-3196的相對(duì)水平。miR-3196上游引物5′-CCTGTGTATGCATCCTCGACTG-3′,下游5′-CTGGCGTGTAATGGAGTCG-3′;circR-BM33上游引物5′-CCCAGAAGAAGGACAGTATGAA-3′,下游5′-TGTAACACCCTGAGAACTGAAAT-3′;U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′;GAPDH上游引物序列5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′,下游5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組及處理 6-10B細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中,待其80%匯合時(shí),按1∶2比例傳代。將第三代對(duì)數(shù)期的6-10B細(xì)胞接種在24孔板上,每孔2×105個(gè)細(xì)胞,待其50%融合時(shí),使用Lipofectamine2000將最終濃度為50 nmol/L的si-circRBM33、si-NC、miR-3196 mimics、miR-NC、si-circRBM33與anti-miR-NC、si-circRBM33與anti-miR-3196及終濃度為0.4 g/L的pcDNA、pcDNA-circRBM33分別轉(zhuǎn)染至6-10B細(xì)胞,分別記為si-circRBM33組、si-NC組、miR-3196組、miR-NC組、si-circRBM33+anti-miR-NC組、si-circRBM33+anti-miR-3196組、pcDNA組、pcDNA-circRBM33組。收集轉(zhuǎn)染48 h的6-10B細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另取未處理的6-10B細(xì)胞作為對(duì)照(Con)組。

1.5CCK-8法測(cè)定6-10B細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染48 h的6-10B細(xì)胞(1×104個(gè))接種于96孔板,48 h后加入CCK-8溶液,每孔10 μl。37 ℃孵育2.5 h。細(xì)胞活力以用酶標(biāo)儀測(cè)得的各孔在450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值表示。

1.6平板克隆實(shí)驗(yàn)測(cè)定6-10B細(xì)胞克隆形成數(shù) 將6-10B細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板,每孔3×102個(gè)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱孵育10～14 d直到出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞集落。菌落固定,室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)(大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)量表示克隆形成數(shù))。

1.7劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測(cè)定6-10B細(xì)胞遷移 將6-10B細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞板,每孔1×106個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞融合為一層時(shí)用100 μl移液槍頭尖端在細(xì)胞表面劃一直線。每孔用磷酸鹽緩沖液洗滌3次,200倍顯微鏡下測(cè)量劃痕距離0 h。37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后,顯微鏡下測(cè)量劃痕距離24 h。劃痕愈合率=(劃痕距離0 h-劃痕距離24 h)/劃痕距離0 h×100%。

1.8Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定6-10B細(xì)胞侵襲 取100 μl細(xì)胞懸液(無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋)、500 μl含血清培養(yǎng)基分別加入預(yù)先包被基質(zhì)膠的Transwell小室上腔、24孔板下腔。37 ℃孵育24 h后,無(wú)菌棉簽除去未過(guò)膜細(xì)胞,用4%多聚甲醛和0.5%結(jié)晶紫分別固定和染色穿膜細(xì)胞。顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(隨機(jī)選擇5個(gè)視野),其均值作為細(xì)胞侵襲數(shù)量。

1.9Western印跡測(cè)定6-10B細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá) 用RIPA緩沖液提取各組6-10B細(xì)胞蛋白,隨后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,將得到的蛋白濕轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜上,然后按照封閉、孵育一抗(GAPDH抗體為1∶10 000稀釋,E-cadherin抗體為1∶500稀釋,N-cadherin抗體為1∶800稀釋)、孵育酶標(biāo)二抗、化學(xué)發(fā)光顯色步驟進(jìn)行。凝膠成像儀進(jìn)行成像,并分析E-cadherin和N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.10雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果合成含有miR-3196結(jié)合位點(diǎn)序列的circRBM33野生型(WT)熒光素酶報(bào)告載體wt-circRBM33、突變型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體MUT-circRBM33。分別將上述報(bào)告基因載體分別與miR-NC、miR-3196 mimics共轉(zhuǎn)染至6-10B細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,將細(xì)胞裂解,并用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè),熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1鼻咽癌組織circRBM33和miR-3196表達(dá) 與癌旁組織(1.00±0.06)相比,鼻咽癌組織中circRBM33相對(duì)表達(dá)(4.29±0.35)明顯升高(t=53.223、P=0.000),鼻咽癌組織中miR-3196相對(duì)(0.35±0.03)較癌旁組織(1.00±0.09))明顯下降(t=39.359、P=0.000)。

2.2干擾circRBM33表達(dá)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-circRBM33組6-10B細(xì)胞中circRBM33相對(duì)表達(dá)較Con組、si-NC組顯著降低(P<0.05),提示轉(zhuǎn)染si-circRBM33后6-10B細(xì)胞中circRBM33表達(dá)受到抑制。si-circRBM33組與si-NC組、Con組比較,6-10B細(xì)胞OD值明顯下降,克隆形成數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少,劃痕愈合率與N-cadherin蛋白表達(dá)明顯下降,E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)。見(jiàn)圖1、圖2、圖3、表1。

表1 干擾circRBM33表達(dá)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖1 干擾circRBM33表達(dá)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 干擾circRBM33表達(dá)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞克隆形成的影響(結(jié)晶紫染色)

圖3 干擾circRBM33表達(dá)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞遷移(×40)、侵襲(結(jié)晶紫染色,×400)的影響

2.3過(guò)表達(dá)miR-3196影響鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 miR-3196組6-10B細(xì)胞中miR-3196相對(duì)表達(dá)較Con組、miR-NC組顯著增加(P<0.05),提示轉(zhuǎn)染miR-3196 mimics后6-10B細(xì)胞中circRBM33表達(dá)上調(diào)。與Con組、miR-NC組比較,miR-3196組6-10B細(xì)胞OD值明顯下降,克隆形成數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少,劃痕愈合率與N-cadherin蛋白表達(dá)明顯下降,E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5、圖6、表2。

表2 過(guò)表達(dá)miR-3196對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

1～5:Con組、miR-NC組、miR-3196組、si-circRBM33+anti-miR-NC組、si-circRBM33+anti-miR-3196組

圖5 各組6-10B細(xì)胞克隆形成(結(jié)晶紫染色)

圖6 各組6-10B細(xì)胞遷移(×40)和侵襲(結(jié)晶紫染色,×400)

2.4抑制miR-3196表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circRBM33表達(dá)對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 si-circRBM33+anti-miR-3196組與si-circRBM33+anti-miR-NC組相比,6-10B細(xì)胞中miR-3196的相對(duì)表達(dá)明顯下降,細(xì)胞OD值、克隆形成數(shù)和細(xì)胞侵襲數(shù)、劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高,E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5、圖6、表3。

表3 抑制miR-3196表達(dá)恢復(fù)了干擾circRBM33對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

2.5circRBM33靶向miR-3196 StarBase預(yù)測(cè)顯示miR-3196與circRBM33存在互補(bǔ)的核苷酸位點(diǎn)。見(jiàn)圖7。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,同與WT-circRBM33共轉(zhuǎn)染,與轉(zhuǎn)染miR-NC組(1.02±0.07)比較,轉(zhuǎn)染miR-3196 mimics細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性(0.42±0.04)顯著降低(t=22.326、P=0.000)。pcDNA-circRBM33組6-10B細(xì)胞中miR-3196相對(duì)表達(dá)(0.35±0.03)顯著低于pcDNA組(1.00±0.00;t=65.000、P<0.05);si-circRBM33組6-10B細(xì)胞中miR-3196相對(duì)表達(dá)(2.29±0.27)明顯高于si-NC組(1.02±0.05;t=13.875、P<0.05)。

圖7 circRBM33與miR-3196互補(bǔ)的核苷酸序列

3 討 論

既往研究顯示,circRNA通過(guò)調(diào)節(jié)鼻咽癌細(xì)胞惡性行為在鼻咽癌發(fā)病、進(jìn)展中具有重要作用,Hong等〔8〕研究發(fā)現(xiàn),circRNA富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白(circCRIM)1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合與miR-422a結(jié)合,阻止miR-422a對(duì)其靶基因叉頭框蛋白(FOX)Q1的抑制作用,最終導(dǎo)致鼻咽癌轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和多西紫杉醇耐藥,circCRIM1高表達(dá)提示鼻咽癌患者預(yù)后不良。Ke等〔9〕指出,沉默circRNA同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶(circHIPK)3可降低鼻咽癌細(xì)胞在體內(nèi)外的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力。因此,闡明circRNA在鼻咽癌中的作用可為鼻咽癌治療提供潛在有效靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明,circRBM33在鼻咽癌組織中上調(diào)表達(dá),干擾circRBM33表達(dá)能夠抑制6-10B細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力。EMT是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的重要步驟,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞表型的獲得和細(xì)胞侵襲能力的增強(qiáng)關(guān)系密切〔10,11〕。此外,Ding等〔12〕研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌中circRBM33表達(dá)亦上調(diào),敲除circRBM33明顯抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,這與本研究中干擾circRBM33的抑制功能一致。

目前關(guān)于circRNA作用機(jī)制報(bào)道最為廣泛的是和miRNA的相互作用。Chen等〔13〕研究發(fā)現(xiàn),放療抵抗鼻咽癌組織中circ_000543表達(dá)顯著高于放射敏感鼻咽癌組織,敲減circ_000543通過(guò)靶向上調(diào)miR-9可提高鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。Li等〔14〕指出,miR-508-5p介導(dǎo)下調(diào)circ_0081534對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。據(jù)報(bào)道,肝癌組織中miR-3196表達(dá)下調(diào),且miR-3196下調(diào)與腫瘤大小、臨床病理分期相關(guān),過(guò)表達(dá)miR-3196可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng),增加細(xì)胞凋亡〔15〕。miR-3196還可作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的下游靶基因參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、糖酵解、凋亡、遷移和EMT過(guò)程〔16,17〕。本研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌組織中miR-3196表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-3196可降低6-10B細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力,下調(diào)蛋白N-cadherin表達(dá),上調(diào)蛋白E-cadherin表達(dá),這與miR-3196在乳腺癌中抗癌作用吻合〔17〕。進(jìn)一步研究表明,miR-3196是circRBM33的直接靶點(diǎn),且circRBM33對(duì)miR-3196具有負(fù)性調(diào)控作用。由于干擾circRBM33表達(dá)與過(guò)表達(dá)miR-3196對(duì)6-10B的抗癌作用一致,提示6-10B細(xì)胞中可能存在circRBM33/miR-3196調(diào)控途徑。本研究結(jié)果顯示,抑制miR-3196表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)干擾circRBM33對(duì)6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,進(jìn)一步證實(shí)circRBM33靶向miR-3196調(diào)控6-10B細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

綜上,鼻咽癌組織中circRBM33表達(dá)上調(diào),miR-3196表達(dá)下調(diào)。干擾circRBM33可抑制鼻咽癌6-10B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其通過(guò)上調(diào)miR-3196表達(dá)實(shí)現(xiàn)。