李敏 陳浩雄 黃佳純 朱根福

(廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

2型糖尿病(T2DM)是一種慢性、高度異質(zhì)性、多因素、進展性疾病,以遺傳性和獲得性胰島素抵抗及胰島素分泌紊亂為特征〔1,2〕。全球中患有糖尿病的人數(shù)大約為4.15億,未診斷出糖尿病的人數(shù)大約為1.93億人。T2DM占所有糖尿病患者的90%以上,T2DM會導(dǎo)致微小血管、大血管各種并發(fā)癥,給患者帶來各種生理和心理的困擾,并給醫(yī)療系統(tǒng)帶來沉重的負擔〔3〕。亞洲是T2DM流行的主要地區(qū),亞洲排名前兩個流行中心是中國和印度〔4〕。二甲雙胍是最受歡迎的口服降糖藥物之一,被廣泛認為是T2DM患者的最佳初始治療方法〔5〕。運動對T2DM患者尤其有益,原因有很多〔6～8〕。盡管人們對T2DM的危險因素有了更多的了解,并獲得了成功的預(yù)防方法,但其流行率和發(fā)病率在全球仍繼續(xù)上升。通過現(xiàn)代生物技術(shù)分析T2DM的發(fā)病機制尤為重要。

中藥及復(fù)方在防治T2DM時取得不可否認的臨床療效,T2DM在中醫(yī)中屬于“消渴”范疇,其重要病機實腎虛和脾虛。黃芪和山藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并列為上品,山藥,甘,平,入肺、脾、腎經(jīng);補脾養(yǎng)陰,生津益肺,補五勞七傷;黃芪,味甘,性微溫;歸脾、肺經(jīng);補氣升陽,益水之源,生津養(yǎng)血。二藥相配補脾固腎,益氣生津,二者一陰一陽,相互促進,使脾氣升,散精達肺,輸布津液以止渴?，F(xiàn)代藥理表明,山藥能作為過氧化物酶增殖體激活受體(PPAR)γ的激動劑、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)激活劑從而治療T2DM〔9〕。黃芪甲苷通過調(diào)節(jié)磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1(PI3K/Akt/FoxO1)通路抑制糖尿病大鼠肝糖異生〔10,11〕。本研究擬采用生物信息學和網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,分析T2DM差異miRNA和mRNA并構(gòu)建miRNA-mRNA 互作網(wǎng)絡(luò),分析二者聯(lián)合用藥治療T2DM的潛在機制。

1 材料和方法

1.1miRNA芯片信息與差異表達miRNA的數(shù)據(jù)處理及分析 NCBI-GEO 被視為一個免費的基因芯片/基因圖譜公共數(shù)據(jù)庫,從中獲得了健康人群和T2DM的miRNA表達譜GSE148961〔12〕,包括18例T2DM患者血清樣本和12例健康人群血清樣本;其表達譜平臺為:GPL25243 NanoString nCounter miRNA Expression Panel。

GEO數(shù)據(jù)庫中獲取健康人群和T2DM的mRNA表達譜GSE7014〔13〕,包括20例T2DM患者肌肉樣本和2例健康人群肌肉樣本;其表達譜平臺為:GPL570〔HG-U133_Plus_2〕 Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 Array。T2DM樣本和健康樣本之間的差異表達基因通過R軟件和Perl腳本分析處理,軟件版本:R-4.1.0,Perl5.32.1.1,軟件包為BiocManager3.9,limma3.26.8。T2DM差異表達miRNA和mRNA的篩選條件為|logFC|>1,P值<0.05。

1.2miRNA靶基因預(yù)測與miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對于目標miRNA靶基因的預(yù)測,本研究借助TargetScan〔14〕、miRDB〔15〕在線數(shù)據(jù)庫對miRNA下游靶基因進行預(yù)測。取差異mRNA與差異miRNA下游靶基因兩者的交集,并利用韋恩圖進行可視化,獲取差異靶基因。形成T2DM miRNA-mRNA的互作關(guān)系,通過Cytocape3.8.2對miRNA-mRNA互作關(guān)系進行可視化。

1.3黃芪-山藥藥對有效成分和靶點分析 檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP),網(wǎng)址https://tcmsp-e.com/,輸入中藥名稱:黃芪和山藥,以口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18 作為篩選條件,分析黃芪-山藥藥對的有效成分和靶點。取差異mRNA與潛在藥物靶點的交集,采用韋恩圖可視化,獲取黃芪-山藥藥對的治療靶點。同時根據(jù)差異miRNA與其下游靶基因的對應(yīng)關(guān)系,構(gòu)建治療靶點與miRNA之間的“靶點-miRNA”互作關(guān)系。

1.4藥對-有效成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 構(gòu)建T2DM藥對-有效成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,借助cytoscape3.8.8軟件〔16〕進行可視化,有效成分和治療為節(jié)點,有效成分和靶點的相互關(guān)系為連線,橢圓形代表有效成分,三角形代表靶點,紅色代表黃芪對應(yīng)的有效成分,綠色代表山藥對應(yīng)的有效成分。同時根據(jù)差異miRNA與其下游靶基因的對應(yīng)關(guān)系,構(gòu)建T2DM-miRNA-mRNA-有效成分-中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5黃芪-山藥藥對治療靶點蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲分析 PPI網(wǎng)絡(luò)信息通過在線工具檢索相互作用基因的檢索工具(STRING)進行分析,篩選條件中等置信度(medium confidence)>0.7,然后應(yīng)用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建差異表達基因的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件可以對分子相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化。拓撲分析借助CytoNCA插件完成。

1.6T2DM治療靶點基因本體(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析 T2DM治療靶點的GO和KEGG富集分析通過R軟件分析,軟件包括R-4.1.0,軟件包包括clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2,篩選條件為P<0.05,校正后P<0.05〔17〕。

2 結(jié) 果

2.1差異表達miRNA結(jié)果及其靶基因 通過GEO數(shù)據(jù)庫,下載GSE148961數(shù)據(jù)集T2DM miRNA表達矩陣文件,其中包括T2DM組:GSM4486670、GSM4486671、GSM4486672、GSM4486673、GSM4486674、GSM4486675、GSM4486676、GSM4486677、GSM4486678、GSM4486679、GSM4486680、GSM4486681、GSM4486682、GSM4486683、GSM4486684、GSM4486685、GSM4486686、GSM4486687;對照組:GSM4486688、GSM4486689、GSM4486690、GSM4486691、GSM4486692、GSM4486693、GSM4486694、GSM4486695、GSM4486696、GSM4486697、GSM4486698、GSM4486699。其中l(wèi)ogFC<-1的35個miRNA在T2DM中表達下調(diào)(表1和圖1)。miR-1307-3p(logFC=2.434,P=0.000,校正后P=0.036)、miR-491-5p(logFC=2.223,P=0.000,校正后P=0.023),P值最顯著差異,且校正后P均<0.05,作為本研究的目標miRNA。

2.2mRNA芯片信息與差異mRNA分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫,下載GSE7014數(shù)據(jù)集2型糖尿病mRNA表達矩陣文件,其中包括T2DM組:GSM161945、GSM161946、GSM161948、GSM161949、GSM161950、GSM161951、GSM161952、GSM161953、GSM161954、GSM161955、GSM161956、GSM161957、GSM161958、GSM161959、GSM161960、GSM161961、GSM161962、GSM161963、GSM161964、GSM161965,對照組:GSM161966、GSM161967、GSM161968、GSM161969、GSM161970、GSM161971。其中mAMPD1、MYH2、MYH1、MYL1、CMYA5等logFC>1的2 190個mRNA在T2DM中表達上調(diào);MT1E、MT1H、MT1HL1、MT2A、MT1X等logFC<-1的3 953個mRNA在T2DM中表達下調(diào)(圖1)。

2.3miRNA靶基因預(yù)測與miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TargetScan在線數(shù)據(jù)庫對miRNA下游靶基因進行預(yù)測,共得到1 843個靶基因。取6 146個差異mRNA與1 843個差異miRNA預(yù)測靶基因兩者的交集,并利用韋恩圖進行可視化,共獲取590個2型糖尿病目標miRNA作用的靶基因。miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括592個節(jié)點,605條邊(互作關(guān)系),67個靶基因與miR-491-5p構(gòu)成miRNA-mRNA互作關(guān)系,538個靶基因與miR-1307-3p構(gòu)成miRNA-mRNA互作關(guān)系(圖2)。

圖2 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4黃芪-山藥藥對有效成分和靶點分析 檢索TCMSP查找黃芪-山藥有效成分和靶點,共得到36個有效成分,其中黃芪得到20個有效成分(表2),山藥得到16個有效成分(表3)。共預(yù)測到黃芪-山藥藥對靶點為538個,其中黃芪含有408個靶點,山藥含有130個靶點。

表2 黃芪主要活性成分信息

表3 山藥主要活性成分信息

取6 146個差異mRNA與538個藥物預(yù)測靶基因兩者的交集,并利用韋恩圖進行可視化,共獲取78個黃芪-山藥藥對治療T2DM的治療靶點,其包括PGR、PTGS1、AR、SCN5A、NCOA2、CHRM1、RXRA、SLC6A2、ESR1、PTPN1等。

2.5miRNA參與藥對-有效成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建T2DM的藥對-有效成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,共有106個節(jié)點,216條邊。黃芪中有效成分MOL000387、MOL000392、MOL000211、MOL000354、MOL000296、MOL000379、MOL000371、MOL000380、MOL000442、MOL000033、MOL000098、MOL000433、MOL000422、MOL000378、MOL000417、MOL000239調(diào)控PGR、PTGS1、AR、SCN5A、NCOA2、PGR、NCOA2、CHRM1、PTGS1、SCN5A、RXRA、SLC6A2、PGR、PTGS1、ESR1、AR、PTPN1、GSK3B、NCOA2、PPARD、NCOA1、MAOB、RELA、PTGS1、CHRM1、ESR1、SCN5A、RXRA、ADRB2、ADRA1D、NCOA2、PTGS1、KCNH2、CHRM1、ESR1等靶點參與改善T2DM。山藥中有效成分MOL005458、MOL005438、MOL005465、MOL000322、MOL000449、MOL001559、MOL001736、MOL005430、MOL005440、MOL000546、MOL000953、MOL005435調(diào)控CHRM1、RXRA、SLC6A3、ADRB2、MAOB、PTGS1、PTGS1、KCNH2、CHRM1、SCN5A、CHRM5、ADRB2、ADRA1D、NCOA2、NCOA1、RXRA、KCNH2、CHRM1、ESR1、SCN5A、ADRA1D、NCOA2、NCOA1、PGR、PGR、PGR、NR3C2、ABAT、NCOA2、PGR、NR3C2、NCOA2、RXRA、NCOA1等靶點參與改善T2DM(圖3)。

圖3 藥物-有效成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

進一步地構(gòu)建了T2DM-miRNA-mRNA-有效成分-中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,此網(wǎng)絡(luò)中黃芪中參與改善T2DM的有效成分包括MOL000422、MOL000098、MOL000239、MOL000296、MOL000354、MOL000371、MOL000378、MOL000380、MOL000387、MOL000392、MOL000417,山藥中參與改善T2DM的有效成分包括MOL001736、MOL000322、MOL000449、MOL005430。得到miR-1307-3p-PTPN1、miR-1307-3p-SCN5A、miR-1307-3p-BCL2、miR-1307-3p-CHEK2、miR-1307-3p-E2F2、miR-1307-3p-IL10RB、miR-1307-3p-IRF1、miR-1307-3p-MAPK1、miR-491-5p-PTGS1共9條miRNA-mRNA相互關(guān)系。PTPN1、SCN5A、BCL2、CHEK2、E2F2、IL10RB、IRF1、MAPK1、PTGS1共9個靶點作為miRNA調(diào)控黃芪-山藥藥對治療T2DM的重要橋梁。見圖4。

圖4 T2DM-miRNA-mRNA-有效成分-中藥網(wǎng)絡(luò)

2.6黃芪-山藥藥對治療靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓撲分析 通過String數(shù)據(jù)庫,獲取PPI內(nèi)容,利用Cytoscape3.8.2軟件對PPI信息進行網(wǎng)絡(luò)可視化(圖5A),并對PPI網(wǎng)絡(luò)進行度中心性(Degree,圖5B)、中介中心性(Betweenness,圖5C)、接近中心性(Closeness,圖5D)算法拓撲分析(表4)。結(jié)果顯示,在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中,共有76個節(jié)點,451條邊,即76個靶點之間可相互作用,共有451組互作關(guān)系。拓撲分析Degree算法中共有10個節(jié)點,45條邊;Betweenness算法中共有10個節(jié)點,29條邊;Closeness算法中共有10個節(jié)點,45條邊。

A:PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建;B:Degree拓撲分析;C:Betweenness拓撲分析;D:Closeness拓撲分析

表4 拓撲分析評分結(jié)果

2.7T2DM治療靶點GO和KEGG分析 見圖6。T2DM治療靶點的GO和KEGG富集分析通過R軟件和Biocoductor包分析,BP結(jié)果中黃芪-山藥藥對治療T2DM的治療靶點富集對類固醇激素的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、內(nèi)在凋亡信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、凋亡信號通路的調(diào)控、細胞內(nèi)受體信號通路、凋亡信號通路的負調(diào)控、細胞對化學應(yīng)激的反應(yīng)、對病毒的反應(yīng)、對紫外線的反應(yīng)、對酮的反應(yīng)等1 154個。

圖6 GO和KEGG富集分析

CC結(jié)果中黃芪-山藥藥對治療T2DM的治療靶點富集膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜筏、小窩、蛋白激酶復(fù)合物、線粒體外膜、細胞器外膜、外膜、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、CD40受體復(fù)合物、突觸前膜的組成部分等18個,MF結(jié)果中黃芪-山藥藥對治療T2DM的治療靶點富集核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、G蛋白耦聯(lián)胺受體活性、轉(zhuǎn)錄共調(diào)控結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性,RNA 聚合酶Ⅱ特異性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合等87個,KEGG結(jié)果中黃芪-山藥藥對治療T2DM的治療靶點富集脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、前列腺癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、小細胞肺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、TNF信號通路、人類T細胞白血病病毒1感染、丙型肝炎、p53信號通路等120個。

3 討 論

miRNA屬于小的非編碼單鏈RNA(19～24 bp),它們通過阻止翻譯并促進目標轉(zhuǎn)錄物的降解進而調(diào)控基因的表達。miRNA在調(diào)節(jié)基因表達中起重要作用,據(jù)報道與多種代謝疾病有關(guān),包括糖尿病。它們通過與目標mRNA分子堿基配對而獲得生物活性,從而在3′非翻譯區(qū)引導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物(RISC)。RISC與mRNA序列的結(jié)合會導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制〔18〕。miRNAs在其他疾病中顯示出作為進展生物標志物的潛力。在糖尿病患者中,血清miRNAs比血細胞miRNAs更容易受到變化的影響〔19〕。一項5年前瞻性觀察研究尋找miRNAs作為從糖尿病前期到糖尿病進展的預(yù)測生物標志物〔20〕,采用NanoString技術(shù)檢測798個miRNAs的表達水平,ROC分析顯示miR-491-5p、miR-1307-3p、miR-298可作為預(yù)測T2DM的診斷工具〔曲線下面積(AUC)分別為94.0%、88.0%、84.0%〕,并且得到RT-qPCR驗證,miRNA靶基因主要富集于神經(jīng)元中神經(jīng)元NO合酶(nNOS)信號通路、淀粉樣蛋白加工及肝膽汁淤積。miR-1307-3p、miR-491-5p可以作為用于預(yù)測糖尿病前期患者的T2DM的生物標志物。另外,本研究中miR-1287-3p、miR-616-3p、miR-363-3p、miR-574-5p、miR-423-5p、miR-1290等也可以作為潛在的候選生物標志物。

T2DM是一種復(fù)雜的代謝紊亂,涉及多個基因,影響不同的細胞信號通路。眾所周知的生物標志物可以識別已經(jīng)表現(xiàn)出代謝改變的患者,比如高血糖。幾乎每個患有T2DM的患者通常都經(jīng)歷糖尿病前期,但并不是所有的前期糖尿病患者最終都會患上糖尿病。生活方式的改變或藥物干預(yù)計劃的引入可以顯著延緩甚至阻止T2DM的發(fā)展〔21,22〕。T2DM患者血清胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)1和白細胞介素(IL)-17水平升高。胰島素/IGF-1信號通路和IL-17信號通路之間的串擾是由GSK3β介導(dǎo)的〔23〕。IL-6、NFKB1和PIK3CG的表達及IL-17信號通路是種植體周圍炎與T2DM之間的首要候選分子連鎖機制〔24〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種促炎細胞因子,與自身免疫性疾病、類風濕關(guān)節(jié)炎、感染性休克等炎癥性疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。TNF-α被認為是肥胖相關(guān)的胰島素抵抗和T2DM發(fā)病的一個致病因子。缺乏TNF-AOR受體的基因敲除小鼠的結(jié)果表明,TNF-α在調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素敏感性方面有作用〔25〕。當TNF信號通路被激活時,除了DNM1L啟動線粒體分裂外,還會激活caspases,啟動細胞死亡程序凋亡和壞死〔26〕。α-葡萄糖苷酶抑制劑主要是p53信號通路對多條通路的調(diào)節(jié)作用〔27〕。

PTPN1、SCN5A、BCL2、CHEK2、E2F2、IL10RB、IRF1、MAPK1、PTGS1作為本次研究的關(guān)鍵治療靶點。PTPN1變異與T2DM和肥胖有中度關(guān)聯(lián),PTPN1變異體可能調(diào)節(jié)脂質(zhì)分布,從而影響對代謝性疾病的易感性〔28〕。B細胞淋巴瘤(Bcl)-2家族對糖尿病有雙刃劍效應(yīng)。這些蛋白是由促炎細胞因子或脂毒性誘導(dǎo)B細胞凋亡的線粒體途徑的關(guān)鍵控制者。同時,一些Bcl-2成員還調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和B細胞功能〔29〕。Kari等〔30〕在來自1 124個家庭的3 383例高血壓遺傳流行病學網(wǎng)絡(luò)(HyperGEN)參與者中發(fā)現(xiàn)了22號染色體上與T2DM相關(guān)的強有力證據(jù);檢驗點(CHEK)2基因是細胞對DNA損傷反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,位于該連鎖高峰期的0.22Mb處,涉及胰腺β細胞損傷和細胞凋亡。血管生成素樣蛋白(Angptl)-8的增殖機制是上調(diào)增殖激活因子cyclinA1、cyclin F和E2F2,下調(diào)增殖抑制因子CDKN1A和CDKN2A。Angptl-8主要通過促進RPE細胞的增殖來促進增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)〔31〕。研究表明,165例1型糖尿病患者和291例T2DM患者,有6個生物標志物(CD5、CCL23、CST5、IL-10RB、PD-L1、TNFRSF9)與兩種糖尿病類型的腎小球濾過率(eGFR)呈負相關(guān)〔32〕。研究證明,脂肪細胞中 IRF1 的表達確實有助于體外和體內(nèi)炎癥過程的上調(diào)。這突出了 IRF1 與肥胖相關(guān)炎癥和由此產(chǎn)生的代謝失調(diào)的相關(guān)的代謝性疾病,包括T2DM〔33〕。HEK293T 細胞中的過表達研究表明 GPR21 是一種組成型活性受體,它與 Gαq G 型蛋白耦聯(lián),導(dǎo)致MAPK的激活。 GPR21 體外的過度表達也顯著減弱了胰島素信號傳導(dǎo)。在血清存在的情況下,GPR21 對 MAPK 和胰島素信號傳導(dǎo)的影響降低〔34〕。通過 GWAS檢測T2DM和肥胖易感基因座中 16 個獨立的單核苷酸多態(tài)性 (SNP),發(fā)現(xiàn)FCGRA2、STAT4、CELSR2、PPARG、Ext2 rs3740878、GCKR、PTGS1等7個基因變異與T2D患者的風險顯著相關(guān)。

本研究中miR-1307-3p-PTPN1、miR-1307-3p-SCN5A、miR-1307-3p-BCL2、miR-1307-3p-CHEK2、miR-1307-3p-E2F2、miR-1307-3p-IL10RB、miR-1307-3p-IRF1、miR-1307-3p-MAPK1、miR-491-5p-PTGS1的靶向關(guān)系更值得深入研究。PTPN1、SCN5A、BCL2、CHEK2、E2F2、IL10RB、IRF1、MAPK1、PTGS1共9個靶點作為miRNA調(diào)控黃芪-山藥藥對治療T2DM的重要橋梁,篩選T2DM差異miRNA及其調(diào)控的靶基因,有望為探索T2DM的診治提供新的研究思路,并為T2DM治療藥物的研發(fā)提供較為可靠的信號通路和作用靶點。然而,本研究仍需要結(jié)合大量臨床樣本并進行相關(guān)的基礎(chǔ)實驗進一步驗證,方能完全最終明確這些差異miRNA-mRNA調(diào)控黃芪-山藥藥對治療T2DM的作用。