吳元龍，惠鳳嬌，潘振遠(yuǎn)，尤春源，林海榮，李志博，金雙俠，聶新輝

后基因組時(shí)代發(fā)展抗除草劑作物的機(jī)遇及挑戰(zhàn)

吳元龍1，惠鳳嬌2，潘振遠(yuǎn)1，尤春源3，林海榮1，李志博1，金雙俠2，聶新輝1

1石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，新疆石河子 832011

全球農(nóng)業(yè)正在面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，育種技術(shù)是種業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵?；蚓庉嫾夹g(shù)是指對目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，實(shí)現(xiàn)對特定靶標(biāo)基片段的刪除、插入和替換。利用基因編輯技術(shù)可以精準(zhǔn)修改目標(biāo)基因或?qū)⒛撤N優(yōu)良基因引入到作物中產(chǎn)生優(yōu)良農(nóng)藝性狀，在分子設(shè)計(jì)育種中具有巨大潛力，對保障糧食安全具有重大意義。雜草危害對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)影響巨大，如何高效、安全、可持續(xù)地防治草害一直是研究的熱點(diǎn)。目前，全球市場已經(jīng)出現(xiàn)超過200種的化學(xué)除草劑，利用化學(xué)方法來防治草害已成為現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的重要組成部分，抗除草劑作物的推廣也顯著降低了雜草防治成本，但隨著抗除草劑作物的大面積推廣和長期使用單一除草劑，雜草抗/耐藥性和抗性基因逃逸等環(huán)境安全問題逐漸被發(fā)現(xiàn)。目前，功能基因組學(xué)、生物信息學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展（特別是基因編輯技術(shù)在植物中的廣泛應(yīng)用），為創(chuàng)制抗除草劑作物和新型高效的除草劑系統(tǒng)創(chuàng)造了條件。本文首先介紹抑制植物氨基酸生物合成、植物脂類代謝、植物類胡蘿卜素、質(zhì)體醌和生育酚生物合成途徑除草劑的主要作用靶標(biāo)基因及其作用機(jī)制。其次，介紹2種挖掘新型抗除草劑基因與除草劑系統(tǒng)的方法，包括基于CRISPR/Cas系統(tǒng)對作物內(nèi)源的除草劑抗性基因進(jìn)行定向突變方法和基于天然產(chǎn)物與生物體在自然界中存在共同進(jìn)化理論的抗性基因?qū)蚍椒?。同時(shí)，介紹3種培育抗除草劑作物方法的研究進(jìn)展，包括常規(guī)育種培育法、轉(zhuǎn)基因育種培育法和基于CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)培育法。其中，重點(diǎn)介紹CIRSPR/Cas系統(tǒng)、堿基編輯技術(shù)和Prime-editing系統(tǒng)在培育抗除草劑作物中的研究進(jìn)展。針對抗性雜草的產(chǎn)生及環(huán)境安全問題是當(dāng)前化學(xué)防治雜草面臨的主要挑戰(zhàn)，以及抗除草劑作物所面臨的主要挑戰(zhàn)是基因逃逸問題。目前，快速發(fā)展的基因組編輯技術(shù)為后基因組時(shí)代發(fā)展抗除草劑作物提供了新的解決策略和新的機(jī)遇。最后，對除草劑作物的未來進(jìn)行了展望。

基因編輯技術(shù)；除草劑；抗除草劑基因；抗除草劑作物育種

0 引言

人類為了獲取食物進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，隨著世界人口的不斷增長和環(huán)境問題的日趨嚴(yán)峻，農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的提高成為亟須解決的重要科學(xué)問題，任何影響作物生產(chǎn)力的因素都應(yīng)該被高度重視[1]。其中，農(nóng)田雜草是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，雜草防治是作物生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雜草具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性[2]，與農(nóng)作物競爭生長資源（包括光照、水分和養(yǎng)分等）和空間條件[3]，增加田間病害蟲的發(fā)生，釋放有毒物質(zhì)造成糧食減產(chǎn)[4]。因此，雜草會(huì)直接影響作物產(chǎn)量，阻礙農(nóng)業(yè)的快速、健康、可持續(xù)性發(fā)展。世界農(nóng)田雜草種類繁多，超過上百種雜草具有較大危害性，造成作物平均減產(chǎn)可達(dá)15%以上，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失近千億元[5-7]。有報(bào)道顯示，雜草危害水稻產(chǎn)量可達(dá)40%以上[8]。開發(fā)高效，可持續(xù)的草害防治措施成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要戰(zhàn)略目標(biāo)之一，也一直是研究者研究的熱點(diǎn)問題。

雜草防治有多種方法，人工除草可以有效減少雜草危害，但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率低下，不符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢?；瘜W(xué)除草由于操作簡單，經(jīng)濟(jì)有效而被廣泛應(yīng)用。除草劑不僅具有除草速度快和效率高的特點(diǎn)，而且適應(yīng)于機(jī)械化種植、病蟲害綜合防治和耕作制度的改革。因此，噴施除草劑是防治雜草的主要手段。目前，全球市場已經(jīng)出現(xiàn)超過200種的化學(xué)除草劑，除草劑的年產(chǎn)量已居農(nóng)藥之首，利用化學(xué)方法來防除草害已成為現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的重要組成部分，對全球糧食生產(chǎn)作出了重大貢獻(xiàn)[1, 9]。除草劑的分類方式多樣，如根據(jù)作用方式可以將除草劑分為選擇性除草劑（如苯磺隆、敵稗和苯達(dá)松等）和滅生性除草劑（如草甘膦和草銨膦等）；根據(jù)有效成分可以將除草劑分為以無機(jī)物或有機(jī)物為原料，經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)或機(jī)械加工而制成的化學(xué)除草劑（具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的除草劑類型已超過20余類）和利用生物活體或生物代謝產(chǎn)物制成的生物除草劑；根據(jù)在作物體內(nèi)的移動(dòng)情況可以將除草劑分為觸殺型除草劑（百草枯、乙氧氟草醚等）和內(nèi)吸型除草劑（2,4-D丁酯、雙草醚、草甘膦）等等。

世界范圍內(nèi)長期、廣泛使用某一類型的除草劑，造成的雜草抗藥性和基因逃逸、藥害殘留等環(huán)境安全問題日益顯現(xiàn)，備受全球關(guān)注，因此，有必要研發(fā)出更高效的除草劑，以及培育出抗除草劑的作物新種質(zhì)[1]?；诃h(huán)境友好與可持續(xù)性考慮，對于新型除草劑的要求也越來越嚴(yán)苛，它不僅要高效殺滅雜草，還需要考慮安全無公害，適應(yīng)環(huán)境和不影響作物本身的生長發(fā)育等因素。因此，如何獲得選擇性強(qiáng)，作用機(jī)理獨(dú)特，安全高效，對環(huán)境和人類的影響極小的除草劑就顯得尤為重要。另一方面，這也對抗除草劑作物發(fā)展提出了新的要求。針對目前雜草防治的瓶頸問題，一方面已經(jīng)從一些微生物、動(dòng)物、植物中挖掘到一些抗除草劑基因。同時(shí)，基于雜交育種以及植物基因工程的發(fā)展，成功獲得了一些可以耐受特定除草劑的作物，為一些滅生性除草劑的大面積推廣提供了條件，極大地降低了雜草防治的成本[10]。隨著功能基因組學(xué)，代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因工程技術(shù)（特別是基因編輯技術(shù)）的快速發(fā)展，為解決雜草危害提供了新的切入點(diǎn)和發(fā)展方向，為解決除草劑面臨的挑戰(zhàn)創(chuàng)造了條件。為了闡明抗除草劑作物的發(fā)展，本文將對除草劑的主要類型及其作用機(jī)制進(jìn)行簡介；進(jìn)一步介紹新型抗除草劑及其基因系統(tǒng)的挖掘；最后介紹抗除草劑作物的培育及基于后基因組時(shí)代發(fā)展抗除草劑作物的機(jī)遇與挑戰(zhàn)，以期為環(huán)境友好型除草劑的開發(fā)和抗除草劑作物的培育提供理論參考。

1 除草劑作用主要靶標(biāo)基因及其作用機(jī)制

研究除草劑的作用靶標(biāo)基因，可以為研制新型除草劑與抗除草劑作物的培育提供重要的參考價(jià)值。植物為了維持其正常的生長發(fā)育，需要不斷地進(jìn)行呼吸作用、光合作用、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)的代謝，這些代謝通路的維持對于植物生長發(fā)育具有重要作用[11-12]。通過阻礙這些代謝通路來達(dá)到殺死雜草的目的是許多除草劑的主要作用機(jī)制。目前，主要有以下幾種不同作用機(jī)制的除草劑，抑制植物氨基酸生物合成途徑、抑制植物光合作用、抑制植物呼吸作用、抑制植物微管與組織發(fā)育的化學(xué)除草劑和干擾植物激素平衡、利用生物活體或生物代謝產(chǎn)物制成的生物除草劑。

1.1 抑制植物氨基酸生物合成

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成成分，而蛋白質(zhì)是生命的執(zhí)行者，目前，抑制氨基酸和蛋白質(zhì)代謝的除草劑主要有3種類型，分別是抑制支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA）生物合成類、抑制芳香族氨基酸合成類和抑制植物氮代謝類。

BCAA是指分子結(jié)構(gòu)中的R基團(tuán)具有支鏈碳鏈，包括亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸，均屬于人體必需氨基酸[13-14]。由于植物無法像動(dòng)物一樣從食物中吸收支鏈氨基酸，必須自身合成，因此，支鏈氨基酸生物合成途徑對于植物生長至關(guān)重要。同時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)不存在該代謝途徑，因此，靶向該途徑的除草劑具有高度特異性與安全性是目前僅次于草甘膦的重要化學(xué)除草劑之一。支鏈氨基酸生物合成途徑是由丙酮酸經(jīng)乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（aceto hydroxyacid isomeroreductase，AHIR）和二羥酸脫水酶（dihydroxyacid dehydratase，DHAD）催化形成纈氨酸和亮氨酸，以及由α-酮丁酸經(jīng)上述3種酶催化形成異亮氨酸2條代謝通路構(gòu)成（圖1-A），其中，ALS、AHIR和DHAD酶即為支鏈氨基酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶[14]。ALS也稱為乙酰羥基酸合成酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS，EC2.2.1.6）具有催化形成乙酰羥基丁酸酯和乙酰乳酸酯的功能。目前，已經(jīng)開發(fā)出許多靶向ALS的除草劑，這類除草劑具有廣譜性、活性高、選擇性強(qiáng)、對動(dòng)物低毒性的特點(diǎn)，使其在全球范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。其作用機(jī)制均是抑制ALS活性，阻礙植物支鏈氨基酸的合成，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂和植物生長，最終導(dǎo)致植物枯萎死亡[15]。而靶向AHIR和DHAD的除草劑還處于研究階段，其中，已有研究表明，aspterric acid（AA）可以靶向DHAD，阻礙支鏈氨基酸生物合成途徑，是具有廣譜、高效、低毒性的新型綠色除草劑。相信在不久的將來靶向DHAD的除草劑將會(huì)被推廣應(yīng)用[16]。

芳香族氨基酸（aromatic amino acids）是指分子結(jié)構(gòu)中帶有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸（tyrosine）、苯丙氨酸（phenylalanine）和色氨酸（tryptophan）。其生物合成是通過莽草酸途徑（shikimate pathway）形成[17]。其中，葉綠體酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS，EC2.5.1.19），催化莽草酸-3-磷酸（shikimate- 3-phosphate，S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）形成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate，EPSP）（圖1-B）。目前，世界上使用最廣泛和最重要的除草劑草甘膦（glyphosate）的靶向位點(diǎn)就是上述的葉綠體酶EPSPS[18]。草甘膦自1974年問世以來，已在全球廣泛使用，是一種具有穩(wěn)定C-P鍵的磷酸鹽化合物，是具有環(huán)境友好性的非選擇性除草劑，可以廣泛控制一年生和多年生雜草。其作用機(jī)制是當(dāng)草甘膦經(jīng)植物莖葉吸入體內(nèi)后，由于草甘膦的化學(xué)結(jié)構(gòu)與PEP相似，二者競爭結(jié)合EPSPS，但不會(huì)影響S3P和EPSPS的結(jié)合，最終會(huì)形成草甘膦：EPSPS:S3P三元復(fù)合物，阻斷EPSPS與PEP的結(jié)合從而抑制EPSPS的活性，導(dǎo)致前體物質(zhì)莽草酸大量積累，植物所需的芳香族氨基酸無法正常合成，影響植株正常的氮代謝活動(dòng)并最終導(dǎo)致死亡[18-19]。

谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS，EC6.3.1.2）具有將谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的酶活，是谷氨酰胺合成關(guān)鍵酶，也是植物氮代謝的關(guān)鍵酶（圖1-C）。靶向GS的化合物有L- phosphinothricin、phosalacine、tabtoxinine-β-lactam和oxetin[20]。其中，作為除草劑應(yīng)用比較廣泛的就是草銨膦（phosphinothricin，PPT），其作用機(jī)制是草銨膦為谷氨酸的類似物，會(huì)與谷氨酸競爭GS結(jié)合位點(diǎn)，抑制氮代謝，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨積累，最終導(dǎo)致植物枯萎死亡[21]。

A：支鏈氨基酸生物合成途徑及抑制乙酰羥基酸合成酶除草劑的作用位置模式圖；B：抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶除草劑的作用位置模式圖；C：抑制谷氨酰胺合成酶除草劑的作用位置模式圖。GS：谷氨酰胺合成酶；GOGAT：谷氨酸合成酶

1.2 抑制植物脂類代謝

脂類對于植物細(xì)胞維持正常功能具有重要作用，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACCase，EC.6.4.1.2）將乙酰CoA羧化生成丙二酰CoA（圖2），該步驟是脂類和脂肪酸合成的關(guān)鍵限速步驟[22]。在植物中，ACCase有2種同功異構(gòu)酶，其中，對除草劑敏感的異構(gòu)酶是一個(gè)分子量約為220 kDa多官能團(tuán)蛋白質(zhì)，包含4種截然不同的蛋白質(zhì)的多酶復(fù)雜結(jié)構(gòu)。目前，已知有許多靶向ACCase的除草劑，包括芳氧苯氧丙酸（aryloxy phenoxy propionate，APP）、環(huán)己二酮（cyclohexanedione，CHD）和苯吡唑啉（phenyl pyrazoline，PPZ）的化學(xué)基團(tuán)等[1]。這些除草劑的作用機(jī)制是通過抑制植物脂類合成途徑中的關(guān)鍵酶ACCase酶活性，影響脂類合成而導(dǎo)致植物枯萎死亡。

圖2 抑制乙酰輔酶A羧化酶除草劑的作用位置模式圖[4]

1.3 抑制植物類胡蘿卜素、質(zhì)體醌和生育酚生物合成途徑

類胡蘿卜素、質(zhì)體醌和生育酚生物合成途徑之間具有相關(guān)性（圖3），其中，類胡蘿卜素在光合作用、光保護(hù)和抗氧化作用中的輔助采光作用中發(fā)揮著重要作用；質(zhì)體醌在光合磷酸化中起重要作用；生育酚是重要的抗氧化劑。在該生物合成途徑中具有一些重要的關(guān)鍵基因，包括對羥苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、茄尼基焦磷酸合酶（solanyl diphosphate synthase，SPS）、尿黑酸茄尼酯轉(zhuǎn)移酶（homogentisate solanesyl transferase，HST）和八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS），均是重要的除草劑靶標(biāo)基因（圖3）。其中，研究比較多的靶向基因?yàn)?。HPPD是生物體內(nèi)參與酪氨酸代謝的關(guān)鍵酶，催化羥基苯丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate，HPPA）轉(zhuǎn)化為尿黑酸（homogentisic acid，HGA），HGA是植物生物合成質(zhì)體醌和生育酚的重要前體，質(zhì)體醌是類胡蘿卜素的生物合成前體，因此，在光合作用中發(fā)揮著重要作用[23]。生育酚是植物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)。HPPD抑制劑類除草劑的作用機(jī)制是可以與HPPD酶活性位點(diǎn)的Fe2+螯合，阻斷HPPD與底物HPPA的結(jié)合，形成對HPPD的競爭性抑制，阻斷植物中質(zhì)體醌和生育酚的形成[4]。

2 挖掘新型抗除草劑基因與除草劑系統(tǒng)

抗除草劑作物（指在通常致死劑量的除草劑作用后仍然能夠存活并再生的作物）的推廣會(huì)導(dǎo)致雜草抗藥性產(chǎn)生和基因逃逸等環(huán)境問題，單一種類除草劑的使用也會(huì)加速雜草抗藥性的進(jìn)化[3]。因此，挖掘新型作用機(jī)制的抗除草劑基因（型）和新型高效的除草劑系統(tǒng)就顯得尤為重要。

HPPD：4-羥基苯基丙酮酸雙氧化酶；DXS：1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶；SPS：茄尼基焦磷酸合酶；HST：尿黑酸茄尼酯轉(zhuǎn)移酶；PDS：八氫番茄紅素脫氫酶

傳統(tǒng)抗除草劑基因的挖掘是在除草劑環(huán)境條件下進(jìn)行物理或化學(xué)誘變，獲得目標(biāo)抗性材料后利用分子育種手段定位獲得目的基因，或者是從天然微生物中挖掘抗性基因如鼠傷寒沙門氏菌中克隆到的抗草甘膦的aroA基因[24]，來自吸水鏈霉菌的抗草銨膦的BAR（bialaphos resistance）和PAT（phosphinthricin acetyltransferase）基因[25]。但這些傳統(tǒng)的育種方法存在效率較低，育種周期長，工作量大的弊端。目前，隨著功能基因組學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展，育種技術(shù)也由傳統(tǒng)的分子育種迅速地轉(zhuǎn)型進(jìn)入到后基因組學(xué)時(shí)代，為綜合利用基因組數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)鑒定新型抗除草劑基因和開發(fā)新作用機(jī)制的除草劑提供了新的方法和思路。

針對已知的除草劑抗性基因，一方面研究者利用clustered regularly interspaced palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins system（CRISPR/Cas）系統(tǒng)對作物內(nèi)源的除草劑抗性基因進(jìn)行定向的飽和突變，發(fā)現(xiàn)了大量新的抗除草劑基因型[26-27]。如：有研究者利用基于prime editors系統(tǒng)的prime editing library-mediated saturation mutagenesis（PLSM）方法，對水稻ACCase基因CT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了飽和突變，篩選出16種具有不同氨基酸替換類型的新型抗除草劑基因[28]。另一方面，針對單一除草劑抗藥性的問題，可以利用基因編輯技術(shù)在作物中同時(shí)聚合多個(gè)除草劑抗性，創(chuàng)制多抗除草劑作物，通過多種除草劑的復(fù)合交替使用，可以有效避免單一抗性的弊端。如，基于單堿基編輯技術(shù)的發(fā)展，周煥斌團(tuán)隊(duì)利用開發(fā)出的TadA9腺嘌呤單堿基編輯器，成功對水稻主栽品種南粳46中的4個(gè)除草劑靶標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn)了一次性的同時(shí)改造，4個(gè)靶點(diǎn)共編輯效率高達(dá)56.25%[29]。除此之外，日本埼玉大學(xué)首次鑒定出的水稻廣譜抗除草劑基因HIS1（HPPD inhibitor sensitive 1，HPPD抑制劑敏感1），賦予了水稻對雙環(huán)磺草酮（benzobicyclon，BBC）和其他β-三酮類除草劑的抗性，為抗除草劑基因的挖掘也帶來了希望與啟發(fā)[30]。

據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全球已發(fā)現(xiàn)268種（154種雙子葉，114種單子葉）雜草的521個(gè)生物型，雜草已經(jīng)進(jìn)化出對31種已知除草劑作用位點(diǎn)中的21種和165種不同除草劑的抗性（國際抗除草劑雜草數(shù)據(jù)庫，https://weedscience.org/Home.aspx）。因此，研制新型抗除草劑基因與除草劑系統(tǒng)，就顯得十分迫切。研究表明，天然產(chǎn)物與生物體在自然界中存在共同進(jìn)化理論，該理論認(rèn)為天然產(chǎn)物和生物之間存在共進(jìn)化關(guān)系，該理論已經(jīng)在醫(yī)藥健康及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用[17]。據(jù)此，研究者提出了基于抗性基因?qū)蚍椒ㄍ诰蛐滦妥饔脵C(jī)制的除草劑系統(tǒng)的方法。如，研究者以支鏈氨基酸通路中的關(guān)鍵酶DHAD為研究對象，利用已公布的真菌基因組數(shù)據(jù)，篩選獲得含有天然產(chǎn)物（可轉(zhuǎn)化成除草劑）合成基因與DHAD同源基因（astD）的保守基因簇[17]。在保守基因簇中的DHAD基因型和產(chǎn)生的天然產(chǎn)物構(gòu)成了潛在的新型作用機(jī)制除草劑系統(tǒng)。接著研究者試驗(yàn)證明天然產(chǎn)物aspterric acid可以作用于DHAD抑制植物生長，利用真菌自身的抗性基因可培育具有抗aspterric acid的抗性植物。最終證明天然產(chǎn)物aspterric acid可以作為除草劑且鑒定到其抗性基因（astD）[16]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所從海洋真菌中篩選到除草活性顯著的Xanthone類化合物，對以反枝莧、綠莧等為代表的莧屬雜草的最小抑草濃度達(dá)到8 μg·ml-1，活性達(dá)到傳統(tǒng)草甘膦的4倍，是一種新型的天然產(chǎn)物除草劑[31]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)從海洋細(xì)菌sp. YM12中克隆到抗草銨膦基因，編碼的蛋白在體外酶活試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與bar基因或pat基因編碼的蛋白具有不同的酶學(xué)特征，氨基酸序列同源性僅為37%，屬于一種全新的抗草銨膦基因[32]，該團(tuán)隊(duì)同時(shí)從中克隆得到新型抗性基因Ⅰvariabilis- EPSPS，其編碼的蛋白對草甘膦具有一定的抗性，且與Ⅱ類EPSPS基因同源性較低，是一種新型的草甘膦抗性基因[33]。這種基于基因組學(xué)與生物信息學(xué)的挖掘方法大大提高了發(fā)現(xiàn)新型除草劑系統(tǒng)的有效性與高效性。基于化學(xué)工程技術(shù)，利用氮化碳納米材料可實(shí)現(xiàn)多種磺酰脲類除草劑的可見光催化降解，通過單原子修飾可顯著提高納米材料的性能，使目標(biāo)除草劑降解速率提高4倍，有效地減輕磺酰脲類除草劑對后茬敏感作物的藥害，為環(huán)境友好型除草劑的開發(fā)提供了新的思路[34]?；诮Y(jié)構(gòu)生物學(xué)，已有研究者對乙酰羥酸合成酶AHAS突變體（W574L和P197T）與除草劑CE或BS結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)這些突變可降低除草劑與AHAS的結(jié)合親和力，并阻礙除草劑對乙酰羥酸合成酶的時(shí)間性氧化失活，進(jìn)一步揭示了雜草通過AHAS突變獲得除草劑抗藥性的結(jié)構(gòu)機(jī)制，為新型除草劑的設(shè)計(jì)與開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)[35]。

3 抗除草劑作物的培育

目前，創(chuàng)制抗除草劑作物的主要途徑包含常規(guī)育種、轉(zhuǎn)基因育種和基于CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)育種。

3.1 常規(guī)育種培育抗除草劑作物

常規(guī)培育抗除草劑作物新品種的方法主要有雜交選育法、自然選擇培育法、物理或者化學(xué)手段（輻射、花粉誘變、種子誘變、體細(xì)胞誘變和化學(xué)誘變劑等）組織培養(yǎng)法等。雜交選育主要是育種家在獲得抗性作物材料后，通過將其與優(yōu)良的栽培品系進(jìn)行雜交，從中篩選聚集雙親優(yōu)良性狀的抗除草劑品種。誘變育種是指通過化學(xué)、物理（紫外線和X射線等）或可移動(dòng)的遺傳因子等因素誘發(fā)生物體的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生遺傳變異，并篩選出具有目標(biāo)性狀突變個(gè)體進(jìn)行新品種培育的過程。利用突變育種技術(shù)已經(jīng)在玉米、小麥、水稻、油菜、向日葵等作物中培育了許多抗除草劑作物，如：抗磺酰脲的小麥[36]，抗咪唑啉類和磺酰脲類的向日葵[37]和抗磺酰脲類除草劑大豆[38]等。誘變育種培育的抗除草劑作物為非轉(zhuǎn)基因作物，推廣應(yīng)用阻力較小[26]。綜上，這些方法操作簡單，可獲得的突變范圍相對較大，但獲得抗性作物的周期較長，工作量較大，突變的低概率和隨機(jī)性使得培育過程變得低效，且?guī)缀醪豢赡芡瑫r(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生多個(gè)特定突變體材料[39]。

3.2 轉(zhuǎn)基因育種培育抗除草劑作物

轉(zhuǎn)基因育種是指通過引入一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良基因，來改良目標(biāo)農(nóng)藝性狀的育種方法。目前，大部分商業(yè)化的抗除草劑作物均是通過這種技術(shù)獲得，約占全部轉(zhuǎn)基因作物的25%[39]。針對靶標(biāo)抗性主要是通過超量表達(dá)外源抗性靶標(biāo)基因或修飾除草劑靶標(biāo)蛋白（降低酶與除草劑的結(jié)合親和力）的方式來創(chuàng)制抗除草劑作物。目前，超量表達(dá)外源抗性靶標(biāo)基因主要有CP4菌株的、（，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽）等變體、草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glyphosate N-acetyltransferase，GAT）基因和草甘膦氧化還原酶（glyphosate oxidoreductase，GOX）基因等[34, 40-42]，并成功培育了抗溴苯腈棉花、抗草胺膦的油菜和抗草甘膦大豆等[43-44]，在大豆、油菜、玉米、苜蓿、水稻和棉花等農(nóng)作物中得到了廣泛應(yīng)用[45-46]。如：在大豆中超表達(dá)G2-EPSPS和GAT基因，創(chuàng)制了既能抗草甘膦又能夠以排毒機(jī)制降解體內(nèi)殘留草甘膦的大豆材料[47]。針對非靶標(biāo)抗性的引入降解/轉(zhuǎn)移除草劑的酶或酶系統(tǒng)方式，包括膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）基因、雙丙氨磷抗性（Bar）基因和細(xì)胞色素P450等[48]。此外，也有過表達(dá)外源抗性靶標(biāo)基因和非靶標(biāo)抗性基因相結(jié)合的應(yīng)用[49]。然而，轉(zhuǎn)基因育種培育抗除草劑作物受限于操作繁瑣、勞動(dòng)密集型、成本高和食品、環(huán)境與生物安全監(jiān)管程序繁瑣等因素。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的數(shù)據(jù)（http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/ spxx/index.htm），目前，我國獲得轉(zhuǎn)基因生物安全證書的抗除草劑作物只有玉米（、、和、和、和、、、maroACC基因）和大豆（、和）。

3.3 基于CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)培育抗除草劑作物

基因組編輯技術(shù)是一種以插入、缺失或堿基替代的方式在目標(biāo)序列中產(chǎn)生突變以實(shí)現(xiàn)DNA修飾的技術(shù)?；蚪M編輯由多種基本技術(shù)組成，如ZFNs（鋅指核酸酶）、TALENs（轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶）和CRISPR/Cas9（聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白9）系統(tǒng)。目前，基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)正以前所未有的速度、深度和廣度影響著生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究及人類健康等領(lǐng)域，使精確和高效地編輯目標(biāo)基因序列由可能變成了現(xiàn)實(shí)。CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種獲得性免疫系統(tǒng)，由單鏈RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶可以在基因組的特定靶標(biāo)位點(diǎn)引起變異，經(jīng)過人工改造后主要包含向?qū)NA（gRNA）和Cas蛋白兩部分[50-51]。

3.3.1 基于CIRSPR/Cas系統(tǒng)培育抗除草劑作物 Cas蛋白在切割DNA雙鏈后會(huì)造成雙鏈斷裂（double- strand break，DSB），緊接著引發(fā)生物體內(nèi)存在的修復(fù)機(jī)制來修復(fù)損傷DNA：一種是非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），這種修復(fù)機(jī)制不精確，在修復(fù)過程不可避免地發(fā)生堿基插入或缺失，引起基因的移碼突變；另一種是同源重組修復(fù)（homology-directed repair，HDR），以供體DNA作為模板進(jìn)行修復(fù)，借助這種修復(fù)機(jī)制可以根據(jù)所提供DNA模板的不同實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)基因插入或堿基修飾等[52]。在高等動(dòng)植物中，以NHEJ機(jī)制進(jìn)行修復(fù)的頻率顯著高于以HDR的頻率，因?yàn)镹HEJ機(jī)制可在細(xì)胞處于任何時(shí)期時(shí)發(fā)生，而HDR機(jī)制則僅在特定的細(xì)胞周期（S及G2期）發(fā)生[53]。

目前，應(yīng)用范圍廣泛、高效的基因編輯工具主要包括CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a[54]2種，這兩種系統(tǒng)目前已經(jīng)在水稻、小麥、煙草、玉米、馬鈴薯、番茄、向日葵、大豆、苜蓿等多種作物中得到了廣泛的應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，基于NHEJ修復(fù)方式，以為靶點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)突變，成功在水稻中篩選獲得一個(gè)新的除草劑（咪唑乙煙酸）耐受性等位基因[55]。但另一方面，基于HDR的技術(shù)挑戰(zhàn)性更大，相對于動(dòng)物細(xì)胞和人類細(xì)胞，植物中存在細(xì)胞壁的阻礙，在進(jìn)行HDR過程中面臨的巨大挑戰(zhàn)就是如何把足夠的供體分子輸送到細(xì)胞中去，且保證供體分子在植物細(xì)胞中不被降解或被轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中[56]。但也有一些成功的案例值得借鑒。目前，已經(jīng)開發(fā)了不同的方法提高HDR的效率，包括細(xì)胞周期的調(diào)控[57]、修復(fù)途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)、提高修復(fù)模板的供應(yīng)量[58]、優(yōu)化供體修復(fù)模板（donor repair template，DRT）的設(shè)計(jì)[59]。例如，在玉米中，利用單鏈寡核苷酸（single stranded oligonucleotide，SSON）或雙鏈DNA載體作為DRT，實(shí)現(xiàn)了ALS2中P165S的氨基酸精準(zhǔn)替換，獲得了對氯磺隆抗性的玉米編輯植物。Sun等[60]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了2個(gè)sgRNA（small guide RNA）和一個(gè)供體修復(fù)模板，通過在供體兩端添加靶標(biāo)序列來增加游離的供體數(shù)量，以基因槍轟擊的方式在水稻中實(shí)現(xiàn)了ALS基因中W548L和S627I 2個(gè)氨基酸殘基的同時(shí)精確替換；2018年，該團(tuán)隊(duì)又利用CRISPR/Cas12a基因編輯系統(tǒng)，以DNA作為HDR的模板，實(shí)現(xiàn)了ALS中相同氨基酸位點(diǎn)的精確替換[61]；2019年，夏蘭琴團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)，以RNA作為HDR的模板，對ALS的2個(gè)氨基酸位點(diǎn)（W548L和S627I）進(jìn)行定點(diǎn)替換，成功獲得無轉(zhuǎn)基因成分的抗ALS抑制劑類除草劑水稻植株[56]。該研究是在植物中首次成功利用RNA作為同源重組修復(fù)模板，開辟了利用植物RNA作為同源供體模板進(jìn)行同源修復(fù)的新思路。以上都是基于基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制抗除草劑作物的成功案例，除此之外，在方法創(chuàng)新上，通過改造小麥矮縮病毒（wheat dwarf virus，WDV），利用其能侵染大多數(shù)單子葉和雙子葉植物，以及病毒能夠大量復(fù)制的特性，轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織發(fā)現(xiàn)其提供供體分子的數(shù)量是傳統(tǒng)T-DNA的數(shù)百倍。該研究進(jìn)一步把CRISPR/Cas9系統(tǒng)和WDV系統(tǒng)整合，輔以定向篩選的方式，對水稻內(nèi)源的ACT1和GST位點(diǎn)定點(diǎn)插入GFP標(biāo)記，對轉(zhuǎn)化植株的鑒定表明外源基因定向敲入的效率最高可達(dá)到19%[58]；2020年，朱健康院士團(tuán)隊(duì)又在基因打靶方面取得新的進(jìn)展，使用化學(xué)修飾的DNA為供體模板，通過粒子轟擊法將多達(dá)2 049個(gè)堿基對的序列以25%的效率插入水稻基因組。同時(shí)，還報(bào)道了一種巧妙的基因替換方法，該方法依賴于同源導(dǎo)向修復(fù)、化學(xué)修飾的供體DNA和靶位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列的存在，以6.1%的效率實(shí)現(xiàn)了高達(dá)130 bp序列的替換[62]。

3.3.2 基于堿基編輯技術(shù)培育抗除草劑作物 基于CRISPR-Cas9發(fā)展而來的堿基編輯系統(tǒng)在創(chuàng)制抗除草劑材料方面發(fā)揮了重要作用。單堿基編輯系統(tǒng)元件主要包含nCas9或dCas9與相應(yīng)的脫氨酶，能夠在不引入DNA雙鏈斷裂也不需要重組修復(fù)模板的情況下實(shí)現(xiàn)高效、精準(zhǔn)的單堿基水平修飾，主要有3種類型：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE，C-to-T）[63]、腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE，A-to-G）[64]和糖基化酶堿基編輯器（glycosylase base editor，GBE，C-to-G）[65]。LI等[66]利用堿基編輯技術(shù)對玉米乙酰乳酸合成酶ZmALS1和ZmALS2基因進(jìn)行靶向突變，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)單堿基雙突變體可以達(dá)到并超過轉(zhuǎn)基因同類產(chǎn)品的抗性水平，除草劑抗性水平達(dá)到大田生產(chǎn)推薦上限15倍劑量或一般推薦35倍劑量水平；揚(yáng)州大學(xué)王幼平團(tuán)隊(duì)利用適用于油菜的堿基編輯系統(tǒng)成功對BnALS1基因Pro197進(jìn)行靶向突變，共獲得BnALS1基因的2種類型（P197F和P197S）突變體，噴施苯磺隆在3倍田間推薦噴施劑量的濃度下均未表現(xiàn)任何藥害癥狀[67]。李家洋團(tuán)隊(duì)通過堿基編輯小麥的乙酰乳酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶基因，生成了具有除草劑耐受性突變的無轉(zhuǎn)基因小麥種質(zhì)，賦予對磺酰脲類，咪唑啉酮類和芳氧基苯氧基丙酸酯類除草劑的耐受性[68]。利用腺嘌呤堿基編輯器對小麥的α類tubulin基因Met-268位點(diǎn)進(jìn)行編輯，成功地獲得了有效耐受二硝基苯胺類除草劑的小麥種質(zhì)材料[69]。

現(xiàn)有的單堿基編輯器CBE和ABE只能催化單一類型堿基的轉(zhuǎn)換，不能實(shí)現(xiàn)2種類型的同時(shí)轉(zhuǎn)換。2020年，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞、李家洋課題組將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ABE7.10同時(shí)融合在nCas9的N端，構(gòu)建了4種形式的新型飽和靶向內(nèi)源基因突變的雙堿基編輯器STEME-1—STEME-4（saturated targeted endogenous mutagenesis editors），新型雙堿基編輯器可以只在一個(gè)sgRNA引導(dǎo)下誘導(dǎo)靶位點(diǎn)C-T和A-G的同時(shí)突變，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及突變類型的多樣性。利用STEME-1系統(tǒng)成功對水稻進(jìn)行飽和突變，擴(kuò)大了基因編輯的范圍，成功地創(chuàng)制了抗除草劑材料，同時(shí)，也加速了抗除草劑基因的定向進(jìn)化[70]。

3.3.3 基于Prime-editing系統(tǒng)培育抗除草劑作物 Prime-editing系統(tǒng)是一種基于CRISPR的新型編輯器，在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下，無須添加外的供體模板，在活細(xì)胞DNA中就可實(shí)現(xiàn)幾乎任何替換（substitution）、微小插入（micro insertion）和微小缺失（microdeletion）。該系統(tǒng)包含Cas9-逆轉(zhuǎn)錄酶（nCas9與逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白）和pegRNA（包含目標(biāo)序列逆轉(zhuǎn)錄模板），具有編輯精準(zhǔn)、位置靈活、類型多樣等特點(diǎn)，有極為重要的應(yīng)用潛力[71]。Prime editing系統(tǒng)自被開發(fā)利用以來，經(jīng)歷了多代的優(yōu)化升級，主要包括使用增強(qiáng)的prime editors效應(yīng)蛋白[72]、優(yōu)化改進(jìn)pegRNAs的設(shè)計(jì)[73-74]、減少prime editing的副產(chǎn)物，改進(jìn)DNA修復(fù)[75]。其中，pegRNA的設(shè)計(jì)合理與否對于精準(zhǔn)編輯的影響似乎更大。pegRNA的切點(diǎn)選擇、元件長度乃至序列堿基構(gòu)成都會(huì)對prime editing效率造成重大影響。這也暗示在沒有有效指導(dǎo)方法的情況下，植物基因組prime editing系統(tǒng)可能需要構(gòu)建由不同參數(shù)元件組成的pegRNA陣列并加以試驗(yàn)篩選才可能實(shí)現(xiàn)有效編輯（development of a plant prime editing system for precise editing in the rice genome）。對于pegRNAs的設(shè)計(jì)，高彩霞老師課題組已經(jīng)開發(fā)了高效的pegRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站PlantPegDesigner（http://www.plantgenomeediting.net/）及脫靶評估系統(tǒng)，為高效PE系統(tǒng)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[76]。另一方面，在pegRNA設(shè)計(jì)方面效果比較好的是通過在pegRNA的3′末端添加RNA motifs，一方面可以對3′進(jìn)行保護(hù)，另一方面可以阻礙pegRNA的降解，這種策略將PE的編輯效率提升到原來的3—4倍[74]。目前，已有研究利用prime-editing系統(tǒng)對進(jìn)行定向氨基酸替換，創(chuàng)制了具有咪唑啉酮和雙草醚抗性的水稻材料[43, 45]。通過刪除M-MLV-RT的RNase H結(jié)構(gòu)域或在M-MLV-RT的N端融合病毒核衣殼蛋白（nucleocapsid，NC），開發(fā)出了升級版新型引導(dǎo)編輯器ePPE，成功創(chuàng)制了可抗甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆2種除草劑的水稻新材料[77]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍課題組在玉米中測試了3種優(yōu)化策略的PE系統(tǒng)，結(jié)果表明，優(yōu)化的PE能夠高效誘導(dǎo)產(chǎn)生可遺傳的純合和雜合玉米突變株系，為培育抗除草劑玉米品種奠定了基礎(chǔ)[78]?；赑E系統(tǒng)的不斷優(yōu)化與改造，將為基因編輯工具的開發(fā)以及抗除草劑種質(zhì)的創(chuàng)制提供穩(wěn)固的技術(shù)支持。

綜上，在以上所描述的利用生物技術(shù)創(chuàng)制抗除草劑作物的類型中，抗ALS抑制類的除草劑作物材料最豐富，在水稻、小麥、玉米、油菜和煙草等均有相關(guān)報(bào)道（表1）。

4 機(jī)遇與挑戰(zhàn)

目前，我國采用化學(xué)除草的面積已達(dá)到播種面積的60%，基本上形成了以化學(xué)藥劑防除為主的田間雜草防除技術(shù)體系[99]。轉(zhuǎn)基因作物自1996年開始商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積總體上呈逐年攀升趨勢。2019年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積超過1.9億hm2，是1996年種植面積170萬hm2的112倍?？钩輨┦寝D(zhuǎn)基因大豆、油菜、玉米、苜蓿和棉花的主要性狀，單一抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的種植面積為8 150萬hm2，約占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的43%，這就意味著抗除草劑作物有著巨大的市場發(fā)展?jié)摿εc占有率[100]。

隨著除草劑的大面積使用，抗性雜草的產(chǎn)生是當(dāng)前化學(xué)防治雜草面臨的主要挑戰(zhàn)，培育復(fù)合抗除草劑作物、優(yōu)化除草劑配套使用方法是解決該問題的有效途徑。同時(shí)，基因逃逸以及環(huán)境安全問題也是面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)。如果一些作物的近緣種植株獲得了抗除草劑基因而變成了“超級雜草”，或者是農(nóng)民為了快速達(dá)到消除雜草的目的加大藥劑的使用量，甚至是隨意丟棄廢棄的農(nóng)藥包裝，都將會(huì)對農(nóng)田雜草的防治、環(huán)境安全帶來新的難題?；诖?，研制開發(fā)一種新型安全的生物型除草劑及其抗除草劑作物系統(tǒng)將有助于問題的解決。

CRISPR-Cas系統(tǒng)與誘變育種相比可節(jié)省大量的人力物力，且更高效和精準(zhǔn)。相較于轉(zhuǎn)基因作物，目前，已經(jīng)有國家逐漸出臺(tái)了對于基因編輯作物的監(jiān)管政策，相較于對轉(zhuǎn)基因作物的嚴(yán)格管控，美國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對基因編輯作物的態(tài)度相對“溫和”，讓人感到欣喜的是經(jīng)基因編輯的西紅柿和魚已經(jīng)正式在日本上市。對于抗除草劑作物的創(chuàng)制，結(jié)合已有的研究表明，大多數(shù)抗除草劑作物的作用機(jī)理主要是某一位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生特定突變，導(dǎo)致與除草劑的結(jié)合活性降低，基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)展的堿基編輯技術(shù)和Prime editing技術(shù)在創(chuàng)制抗除草劑作物上就作出了重要貢獻(xiàn)，創(chuàng)制了不同類型的單抗除草劑材料，以及具有復(fù)合性狀的多抗除草劑材料。同時(shí)，CRISPR-Cas系統(tǒng)也存在著一些局限性，主要包括（1）PAM位點(diǎn)的限制：目前，常用的Cas9和Cas12a主要識(shí)別的PAM是NGG和TTTV，但是針對一些特定的除草劑突變位點(diǎn)卻沒有合適的PAM，因此，就需要開發(fā)一些無PAM限制的Cas變體，拓寬全基因組編輯的范圍；（2）轉(zhuǎn)化受體材料和轉(zhuǎn)化方法的限制：目前，植物中常用的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法及PEG轉(zhuǎn)化法（polyethylene glycol，PEG），其中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最成熟的轉(zhuǎn)化途徑，但由于宿主范圍的限制，只適用于部分植物物種。對于受體材料具有較強(qiáng)的基因型的差異，如：在棉花中只有JIN668、YZ-1和中棉24具有較強(qiáng)的再生能力，其余的棉花種質(zhì)例如海島棉則難再生，限制了基因編輯的廣泛應(yīng)用；（3）脫靶問題：基因編輯工具除了要具備高效性之外，還應(yīng)具有一定的精準(zhǔn)性，盡可能提高DNA識(shí)別的特異性，減少在全基因組范圍內(nèi)的脫靶；（4）原創(chuàng)性以及專利問題：在我國科學(xué)研究中所使用的基因編輯技術(shù)體系，其相關(guān)核心專利大都掌握在歐美相關(guān)研究機(jī)構(gòu)和公司手中，博德研究所的張峰團(tuán)隊(duì)已經(jīng)申請了CRISPR/Cas9的專利，未來我國如果要利用其進(jìn)行分子育種、醫(yī)療診斷等商業(yè)化應(yīng)用的話，存在被“卡脖子”的巨大風(fēng)險(xiǎn)。但目前隨著基因組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、宏基因組學(xué)、生物信息學(xué)的快速發(fā)展，基因編輯技術(shù)也在以前所未有的態(tài)勢不斷發(fā)展，新型的基因編輯工具不斷被發(fā)掘，基因編輯技術(shù)將為抗除草劑作物的培育提供更多的技術(shù)手段。

表1 基于基因編輯培育抗除草劑作物

HDR：同源重組修復(fù)；NHEJ：非同源末端連接；ABE：腺嘌呤堿基編輯；CBE：胞嘧啶堿基編輯

HDR: homology-directed repair; NHEJ: Non-homologous end joining; ABE: adenine base editing; CBE: cytidine base editing

5 展望

目前，抗除草劑作物的種植一方面減少了勞動(dòng)力和財(cái)力的投入，降低了生產(chǎn)成本，另一方面，這也促進(jìn)了規(guī)?；c機(jī)械化的發(fā)展，為大規(guī)模、集約化的現(xiàn)代化農(nóng)場的建設(shè)創(chuàng)造了條件。但隨之而來的是除草劑的大量施用和抗除草劑作物大面積推廣，導(dǎo)致雜草對除草劑抗性，更有甚者部分雜草對多種除草劑產(chǎn)生了多重抗性，這就為雜草管理和抗除草劑作物的發(fā)展提出了新的挑戰(zhàn)。針對這一挑戰(zhàn)，需要進(jìn)行科學(xué)的雜草管理、合理的種植制度、挖掘與現(xiàn)有除草劑沒有交叉抗性的新型除草劑基因并研究其作用模式、借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因編輯技術(shù)創(chuàng)制滿足生產(chǎn)需要的抗除草劑新種質(zhì)[101]。尋找新型的生物除草劑及其抗性基因與作用機(jī)制也是未來一個(gè)重要的發(fā)展方向，這樣既能夠最大限度地發(fā)揮現(xiàn)有除草劑的經(jīng)濟(jì)效益，也能優(yōu)化現(xiàn)有的雜草防治體系和普及保水、保土及低投入的少耕、免耕、密植的耕種模式，同時(shí)優(yōu)化抗除草劑作物的種植方式。此外，基于環(huán)境友好與可持續(xù)性的考慮（綠水青山就是金山銀山），就要求新型除草劑應(yīng)該具有高效，可持續(xù)，安全無公害和適應(yīng)環(huán)境等特性。現(xiàn)在，也出現(xiàn)了一些解決這些問題的方法。如：基于抗性基因?qū)蚍椒ㄍ诰蛐滦妥饔脵C(jī)制的除草劑系統(tǒng)的方法[16]；綜合運(yùn)用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)的方法為發(fā)現(xiàn)除草劑原始靶標(biāo)提供了便利?；谶@些方法，還開發(fā)出一些新型除草劑標(biāo)靶基因，如：SPS、HST、DHODH、FAT和DHAD等[102]。目前，全球已經(jīng)成功商業(yè)化或正式獲得登記的生物除草劑產(chǎn)品已經(jīng)有20余種[21]。其中利用生物活體的生物除草劑類型，由于需要較為嚴(yán)格的環(huán)境條件才能起作用，限制了其應(yīng)用。這些問題的解決均有賴于功能基因組學(xué)研究、生物基因工程技術(shù)和生產(chǎn)工藝的創(chuàng)新[3]。因此，為了克服生物除草劑產(chǎn)品發(fā)展的成本與環(huán)境制約因素，應(yīng)加大力度研制和發(fā)展生物除草劑生產(chǎn)工藝、新劑型及應(yīng)用技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯技術(shù)是創(chuàng)制抗除草劑材料的2種最優(yōu)方法，但兩者之間存在著本質(zhì)的區(qū)別?；蚓庉嬜魑镉N用于編輯作物內(nèi)源基因，且后代可分離出外源調(diào)控基因序列，經(jīng)過連續(xù)多代分離后可以獲得完全不含外源基因、且具有目的性狀的目標(biāo)材料。面對基因編輯技術(shù)所存在的一些限制性問題，目前也有了一些應(yīng)對措施，例如，目前已經(jīng)挖掘了一些Cas蛋白的變體，既可以拓寬基因組編輯的范圍，又具有高效的靶向特異性，如xCas9[103]、Cas9-NG[104]、SpRY[105]、SpG[106]、ttLbCas12a[107]和enAsCas12a[108]等；轉(zhuǎn)化受限于基因型的植物，一方面可以運(yùn)用納米顆粒，或病毒載體進(jìn)行基因編輯元件的遞送方法打破基因型限制，目前在煙草[109]、小麥[110]、甘薯[111]中均有相關(guān)報(bào)道；另一方面，通過利用一些再生因子提高轉(zhuǎn)化的效率，比如BBM、WUS等關(guān)鍵再生因子[112]；在原創(chuàng)性的基因編輯工具挖掘方面我國也取得了一定的進(jìn)步，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的賴錦盛教授利用生物信息學(xué)成功挖掘到一種新的CRISPR/Cas12j基因編輯系統(tǒng)。目前，各國對于基因編輯技術(shù)的監(jiān)管問題也不盡相同。2022年1月24日，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定公布了《農(nóng)業(yè)用基因編輯植物安全評價(jià)指南（試行）》，主要針對沒有引入外源基因的基因編輯植物，依據(jù)可能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)申請安全評價(jià)。這對我國基因編輯技術(shù)從業(yè)者將是一個(gè)極大鼓舞。對于我國生物育種技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)業(yè)推動(dòng)意義重大。

基因編輯技術(shù)對于我國的作物改良具有重要的推動(dòng)作用，體現(xiàn)在作物的高產(chǎn)、抗逆、單倍體誘導(dǎo)、品質(zhì)改良等一系列角度，這對于抗除草劑作物的發(fā)展也將是里程碑式的。相信在后基因組時(shí)代，伴隨著基因編輯技術(shù)以及多種組學(xué)的發(fā)展，我國的抗除草劑育種將迎來一個(gè)嶄新的時(shí)代。

[1] Powles S B, Yu Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Review of Plant Biology,2010, 61: 317-347.

[2] 楊紅梅, 馮莉, 陳光輝. 作物田雜草種子庫研究進(jìn)展. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 35(10): 57-60, 67.

Yang H M, FENG L, Chen G H. Research development of crop field weed seed-bank. Guangdong Agricultural Sciences, 2008, 35(10): 57-60, 67. (in Chinese)

[3] 孫金秋, 任相亮, 胡紅巖, 姜偉麗, 馬亞杰, 王丹, 宋賢鵬, 馬艷, 馬小艷. 農(nóng)田雜草群落演替的影響因素綜述. 雜草學(xué)報(bào), 2019, 37(2): 1-9.

Sun J Q, Ren X L, Hu H Y, Jiang W L, Ma Y J, Wang D, Song X P, Ma Y, Ma X Y. The factors influencing weed community succession in the crop field. Journal of Weed Science, 2019, 37(2): 1-9. (in Chinese)

[4] Jin M, Chen L, Deng X W, Tang X Y. Development of herbicide resistance genes and their application in rice. The Crop Journal, 2022, 10(1): 26-35.

[5] 李揚(yáng)漢. 中國雜草志. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998.

Li Y H. Weeds of China. 北京: China Agriculture Press, 1998. (in Chinese)

[6] Oerke E C. Crop losses to pests. The Journal of Agricultural Science, 2006, 144(1): 31-43.

[7] 李香菊. 近年我國農(nóng)田雜草防控中的突出問題與治理對策. 植物保護(hù), 2018, 44(5): 77-84.

Li X j. Main problems and management strategies of weeds in agricultural fields in China in recent years. Plant Protection, 2018, 44(5): 77-84. (in Chinese)

[8] Burgos N R, Singh V, Tseng T M, Black H, Young N D, Huang Z, Hyma K E, Gealy D R, Caicedo A L. The impact of herbicide-resistant rice technology on phenotypic diversity and population structure of United States weedy rice. Plant Physiology, 2014, 166(3): 1208-1220.

[9] 檀琮萍, 江昌俊. 作物抗除草劑基因工程與抗除草劑轉(zhuǎn)基因小麥的研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 30(1): 27-33.

Tan C p, Jiang C j. Research progress on herbicide resistant gene engineering of crop and transgenic herbicide resistant wheat. Journal of Anhui Agricultural University, 2003, 30(1): 27-33. (in Chinese)

[10] 強(qiáng)勝, 宋小玲, 戴偉民. 抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn)及其發(fā)展策略. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2010, 18(1): 114-125.

Qiang S, Song X l, Dai W M.The opportunity and challenge faced by transgenic herbicide-resistant crops and their development strategy. Journal of Agricultural Biotechnology, 2010, 18(1): 114-125. (in Chinese)

[11] Zhang D B, Shi J X, Yang X J. Role of lipid metabolism in plant pollen exine development. Sub-cellular Biochemistry,2016, 86: 315-337.

[12] Pichersky E, Lewinsohn E. Convergent evolution in plant specialized metabolism. Annual Review of Plant Biology, 2011, 62: 549-566.

[13] Nakka S, Jugulam M, Peterson D, Asif M. Herbicide resistance: Development of wheat production systems and current status of resistant weeds in wheat cropping systems. The Crop Journal, 2019, 7(6): 750-760.

[14] Galili G, Amir R, Fernie A R. The regulation of essential amino acid synthesis and accumulation in plants. Annual Review of Plant Biology, 2016, 67: 153-178.

[15] Tan S Y, Evans R R, Dahmer M L, Singh B K, Shaner D L. Imidazolinone-tolerant crops: history, current status and future. Pest Management Science, 2005, 61(3): 246-257.

[16] Yan Y, Liu Q K, Zang X, Yuan S G, Bat-Erdene U, Nguyen C, Gan J H, Zhou J H, Jacobsen S E, Tang Y. Resistance-gene-directed discovery of a natural-product herbicide with a new mode of action. Nature, 2018, 559(7714): 415-418.

[17] Amrhein N, Deus B, Gehrke P, Steinrucken H C. The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate: II. Interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant Physiology, 1980, 66(5): 830-834.

[18] Duke S O, Powles S B. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest Management Science,2008, 64(4): 319-325.

[19] Dill G M. Glyphosate-resistant crops: history, status and future. Pest Management Science, 2005, 61(3): 219-224.

[20] 陳世國, 強(qiáng)勝. 生物除草劑研究與開發(fā)的現(xiàn)狀及未來的發(fā)展趨勢. 中國生物防治學(xué)報(bào), 2015, 31(5): 770-779.

Chen S G, Qiang S. The status and future directions of bioherbicide study and development. Chinese Journal of Biological Control, 2015, 31(5): 770-779. (in Chinese)

[21] James D, Borphukan B, Fartyal D, Ram B, Singh J, Manna M, Sheri V, Panditi V, Yadav R, REDDY M K. Concurrent overexpression of OsGS1;1 and OsGS2 genes in transgenic rice (L.): impact on tolerance to abiotic stresses. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 786.

[22] Tang W, Zhou F Y, Chen J, Zhou X G. Resistance to ACCase-inhibiting herbicides in an Asia minor bluegrass () population in China. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2014, 108: 16-20.

[23] Ndikuryayo F, Moosavi B, Yang W C, Yang G F. 4- hydroxyphenylpyruvate dioxygenase inhibitors: From chemical biology to agrochemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(39): 8523-8537.

[24] Comai L, Sen L C, Stalker D M. An altered aroa gene product confers resistance to the herbicide glyphosate. Science, 1983, 221(4608): 370-371.

[25] Miki B, McHugh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety. Journal of Biotechnology,2004, 107(3): 193-232.

[26] Dong H R, Huang Y, Wang K J. The development of herbicide resistance crop plants using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Genes, 2021, 12(6): 912.

[27] Hussain A, Ding X, Alariqi M, Manghwar H, Hui F J, Li Y P, Cheng J Q, Wu C L, Cao J L, Jin S X. Herbicide resistance: another hot agronomic trait for plant genome editing. Plants, 2021, 10(4): 621.

[28] Xu R F, Liu X S, Li J, Qin R Y, Wei P C. Identification of herbicide resistance OsACC1 mutations via in planta prime-editing-library screening in rice. Nature Plants, 2021, 7(7): 888-892.

[29] Yan D R, Ren B, Liu L, Yan F, Li S F, Wang G R, Sun W X, Zhou X P, Zhou H B. High-efficiency and multiplex adenine base editing in plants using new TadA variants. Molecular Plant, 2021, 14(5): 722-731.

[30] Maeda H, Murata K, Sakuma N, Takei S, Yamazaki A, AHIRm M R, Kawata M, Hirose S, Kawagishi-Kobayashi M, Taniguchi Y, SUZUKI S, SEKINO K, OHSHIMA M, KATO H, YOSHIDA H, TOZAWA Y. A rice gene that confers broad-spectrum resistance to β-triketone herbicides. Science, 2019, 365(6451): 393-396.

[31] Zhao D L, Han X B, Wang M, Zeng Y T, Li Y Q, Ma G Y, Liu J, Zheng C J, Wen M X, Zhang Z F, ZHANG P, ZHANG C S. Herbicidal and antifungal xanthone derivatives from the-derived fungusD5. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2020, 68(40): 11207-11214.

[32] Wu G B, Yuan M R, Wei L, Zhang Y, Lin Y J, Zhang L L, Liu Z D. Characterization of a novel cold-adapted phosphinothricin N-acetyltransferase from the marine bacteriumsp. strain YM12. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2014, 104: 23-28.

[33] Yi S y, Wu G b, Lin Y j, Hu N, Liu Z d. Characterization of a new type of glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2015, 111: 1-8.

[34] Liu X, Wang S J, Yu W S, Zhang J Q, Fang S, Zhang J G, Qiu J, Kong F Y, Duan X G. Single platinum atoms anchored on holy carbon nitride for efficient photodegradation of sulfonylurea herbicide. Chemical Engineering Journal, 2022, 446: 137426.

[35] Lonhienne T, Cheng Y, Garcia M D, Hu S H, Low Y S, Schenk G, Williams C M, Guddat L W. Structural basis of resistance to herbicides that target acetohydroxyacid synthase. Nature Communications, 2022, 13(1): 3368.

[36] NEWHOUSE K E, SMITH W A, STARRETT M A, SCHAEFER T J, SINGH B K. Tolerance to imidazolinone herbicides in wheat. Plant physiology, 1992, 100(2): 882-886.

[37] Sala C A, Bulos M, Altieri E, Ramos M l. Genetics and breeding of herbicide tolerance in sunflower. Helia, 2012, 35(57): 57-69.

[38] Sebastian S A, Fader G M, Ulrich J F, Forney D R, Chaleff R S. Semidominant soybean mutation for resistance to sulfonylurea herbicides. Crop Science, 1989, 29(6): 1403-1408.

[39] Endo M, Toki S. Creation of herbicide-tolerant crops by gene targeting. Journal of Pesticide Science, 2013, 38(2): 49-59.

[40] Castle L A, Siehl D L, Gorton R, Patten P A, Chen Y H, Bertain S, Cho H J, Duck N, Wong J, Liu D L, LASSNER M W. Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene. Science, 2004, 304(5674): 1151-1154.

[41] Thompson C J, Movva N R, Tizard R, Crameri R, Davies J E, Lauwereys M, Botterman J. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from. The EMBO Journal, 1987, 6(9): 2519-2523.

[42] Cui Y, Liu Z D, Li Y, Zhou F, Chen H, Lin Y J. Application of a novel phosphinothricin N-acetyltransferase (RePAT) gene in developing glufosinate-resistant rice. Scientific Reports, 2016, 6(1): 21259.

[43] Beckie H J, Hall L M. Genetically-modified herbicide-resistant (GMHR) crops a two-edged sword? An Americas perspective on development and effect on weed management. Crop Protection, 2014, 66: 40-45.

[44] Dun B Q, Wang X J, Lu W, Chen M, Zhang W, Ping S Z, Wang Z X, Zhang B M, Lin M. Development of highly glyphosate-tolerant tobacco by coexpression of glyphosate acetyltransferase gat and EPSPS G2-aroA genes. The Crop Journal, 2014, 2(2/3): 164-169.

[45] Yi S Y, Cui Y, Zhao Y, Liu Z D, Lin Y J, Zhou F. A novel naturally occurring class I 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromsp. confers high glyphosate tolerance to rice. Scientific Reports, 2016, 6: 19104.

[46] 崔永禎, 楊曉云, 李紹祥, 浦秋紅, 楊忠慧, 李宏生, 丁明亮. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因編輯技術(shù)在抗除草劑農(nóng)作物上的應(yīng)用. 中國種業(yè), 2022(4): 19-22.

Cui Y Z, Yang X Y, Li S X, Pu Q H, Yang Z H, Li H S, Ding M L. Application of transgenic technology and gene editing technology in crops with herbicide resistants. China Seed Industry, 2022(4): 19-22. (in Chinese)

[47] Guo B F, Guo Y, Hong H L, Jin L G, Zhang L J, Chang R Z, Lu W, Lin M, Qiu L J. Co-expression of G2-EPSPS and glyphosate acetyltransferasegenes conferring high tolerance to glyphosate in soybean. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 847.

[48] 邱龍, 馬崇烈, 劉博林, 章旺根. 耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(12): 2357-2363.

Qiu L, Ma C L, Liu B L, Zhang W G. Current situation of research on transgenic crops with herbicide tolerance and development prospect. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(12): 2357-2363. (in Chinese)

[49] Fartyal D, Agarwal A, James D, Borphukan B, Ram B, Sheri V, Yadav R, Manna M, Varakumar P, REDDY M K. Co-expression of P173S mutant rice EPSPS andgenes results in higher glyphosate tolerance in transgenic rice. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 144.

[50] Manghwar H, Lindsey K, Zhang X L, Jin S X. CRISPR/Cas system: recent advances and future prospects for genome editing. Trends in plant science, 2019, 24(12): 1102-1125.

[51] Horvath P, Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science,2010, 327(5962): 167-170.

[52] Wang J Y, Doudna J A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning. Science, 2023, 379(6629): eadd8643.

[53] Puchta H, Fauser F. Synthetic nucleases for genome engineering in plants: prospects for a bright future. The Plant Journal, 2014, 78(5): 727-741.

[54] Zetsche B, Gootenberg J S, Abudayyeh O O, Slaymaker I M, Makarova K S, Essletzbichler P, Volz S E, Joung J, van der Oost J, Regev A, KOONIN E V, ZHANG F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163(3): 759-771.

[55] Wang F Q, Xu Y, Li W Q, Chen Z H, Wang J, Fan F J, Tao Y J, Jiang Y J, Zhu Q H, Yang J. Creating a novel herbicide-tolerance OsALS allele using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Crop Journal, 2021, 9(2): 305-312.

[56] Li S Y, Li J Y, He Y B, Xu M L, Zhang J H, Du W M, Zhao Y D, Xia L Q. Precise gene replacement in rice by RNA transcript- templated homologous recombination. Nature Biotechnology, 2019, 37(4): 445-450.

[57] Reiss B, Klemm M, Kosak H, Schell J. RecA protein stimulates homologous recombination in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(7): 3094-3098.

[58] Wang M g, Lu Y m, Botella J R, Mao Y f, Hua K, Zhu J k. Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system. Molecular plant, 2017, 10(7): 1007-1010.

[59] Song F, Stieger K. Optimizing the DNA donor template for homology-directed repair of double-strand breaks. Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2017, 7: 53-60.

[60] Sun Y w, Zhang X, Wu C y, He Y b, Ma Y z, Hou H, Guo X p, Du W m, Zhao Y d, Xia L q. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase. Molecular Plant, 2016, 9(4): 628-631.

[61] Li S y, Li J y, Zhang J h, Du W m, Fu J d, Sutar S, Zhao Y d, Xia L q. Synthesis-dependent repair of Cpf1-induced double strand DNA breaks enables targeted gene replacement in rice. Journal of Experimental Botany, 2018, 69(20): 4715-4721.

[62] Lu Y m, Tian Y f, Shen R d, Yao Q, Wang M g, Chen M, Dong J s, Zhang T e, Li F, Lei M g, zhu j k.Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice. Nature Biotechnology, 2020, 38(12): 1402-1407.

[63] Komor A C, Kim Y B, Packer M S, Zuris J A, Liu D R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420-424.

[64] Gaudelli N M, Komor A C, Rees H A, Packer M S, Badran A H, Bryson D I, Liu D R. Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 2017, 551(7681): 464-471.

[65] Tong H w, Wang X c, Liu Y h, Liu N n, Li Y, Luo J m, Ma Q, Wu D n, Li J y, Xu C l, yang h.Programmable A-to-Y base editing by fusing an adenine base editor with an N-methylpurine DNA glycosylase. Nature Biotechnology, 2023.

[66] Li Y m, Zhu J j, Wu H, Liu C l, Huang C l, Lan J h, Zhao Y m, Xie C x. Precise base editing of non-allelic acetolactate synthase genes confers sulfonylurea herbicide resistance in maize. The Crop Journal, 2020, 8(3): 449-456.

[67] Wu J, Chen C, Xian G y, Liu D x, Lin L, Yin S l, Sun Q f, Fang Y j, Zhang H, Wang Y p. Engineering herbicide-resistant oilseed rape by CRISPR/Cas9-mediated cytosine base-editing. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(9): 1857-1859.

[68] Zhang R, Liu J x, Chai Z z, Chen S, Bai Y, Zong Y, Chen K l, Li J y, Jiang L j, Gao C x. Generation of herbicide tolerance traits and a new selectable marker in wheat using base editing. Nature Plants, 2019, 5(5): 480-485.

[69] Han H n, Wu Z w, Zheng L, Han J y, Zhang Y, Li J h, Zhang S j, Li G y, Ma C l, Wang P p. Generation of a high-efficiency adenine base editor with TadA8e for developing wheat dinitroaniline-resistant germplasm. The Crop Journal, 2022, 10(2): 368-374.

[70] Li C, Zhang R, Meng X b, Chen S, Zong Y, Lu C j, Qiu J L, Chen Y H, Li J y, Gao C x. Targeted, random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors. Nature biotechnology, 2020, 38(7): 875-882.

[71] Anzalone A V, Randolph P B, Davis J R, Sousa A A, Koblan L W, Levy J M, Chen P J, Wilson C, Newby G A, Raguram A, liu d r. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature,2019, 576(7785): 149-157.

[72] Zhuang Y, Liu J l, Wu H, Zhu Q g, Yan Y c, Meng H w, Chen P R, Yi C q. Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs. Nature Chemical Biology, 2022, 18(1): 29-37.

[73] Li X s, Zhou L n, Gao B Q, Li G y, Wang X, Wang Y, Wei J, Han W y, Wang Z x, Li J F, GAO R Z, ZHU J J, XU W C, WU J, YANG B, SUN X D, YANG L, CHEN J. Highly efficient prime editing by introducing same-sense mutations in pegRNA or stabilizing its structure. Nature Communications, 2022, 13(1): 1669.

[74] Nelson J W, Randolph P B, Shen S P, Everette K A, Chen P J, Anzalone A V, An M, Newby G A, Chen J C, Hsu A, liu d r. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nature Biotechnology, 2022, 40(3): 402-410.

[75] CHEN P J, HUSSMANN J A, YAN J, KNIPPING F, RAVISANKAR P, CHEN P F, CHEN C D, NELSON J W, Newby G A, SAHIN M, OSBORN M J, WEISSMAN J S, ADAMSON B, LIU D R. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell,2021, 184(22): 5635-5652. e29.

[76] Jin S, Lin Q p, Gao Q, Gao C x. Optimized prime editing in monocot plants using PlantPegDesigner and engineered plant prime editors (ePPEs). Nature Protocols, 2023, 18(3): 831-853.

[77] Zong Y, Liu Y j, Xue C x, Li B s, Li X y, Wang Y p, Li J, Liu G w, Huang X x, Cao X f, gao c x.An engineered prime editor with enhanced editing efficiency in plants. Nature Biotechnology, 2022, 40(9): 1394-1402.

[78] Qiao D x, Wang J y, Lu M H, Xin C p, Chai Y p, Jiang Y y, Sun W, Cao Z h, Guo S y, Wang X C, chen q j. Optimized prime editing efficiently generates heritable mutations in maize. Journal of Integrative Plant Biology, 2023, 65(4): 900-906.

[79] Endo M, Mikami M, Toki S. Biallelic gene targeting in rice. Plant Physiology, 2016, 170(2): 667-677.

[80] Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, Terada R, Arazoe T, Ishii H, Teramura H, Yamamoto T, Komatsu H, Miura K, EZURA H, NISHIDA K, ARIIZUMI T, KONDO A. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nature Biotechnology, 2017, 35(5): 441-443.

[81] Shimatani Z, Fujikura U, Ishii H, Matsui Y, Suzuki M, Ueke Y, Taoka K i, Terada R, Nishida K, Kondo A. Inheritance of co-edited genes by CRISPR-based targeted nucleotide substitutions in rice. Plant Physiology and Biochemistry, 2018, 131: 78-83.

[82] Zhang R, Chen S, Meng X B, Chai Z Z, Wang D L, Yuan Y G, Chen K L, Jiang L J, Li J, Gao C X. Generating broad-spectrum tolerance to ALS-inhibiting herbicides in rice by base editing. Science China Life Sciences, 2021, 64(10): 1624-1633.

[83] Hua K, Jiang Y W, Tao X P, Zhu J K. Precision genome engineering in rice using prime editing system. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(11): 2167-2169.

[84] Butt H, Rao G S, Sedeek K, Aman R, Kamel R, Mahfouz M. Engineering herbicide resistance via prime editing in rice. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(12): 2370-2372.

[85] Kuang Y J, Li S F, Ren B, Yan F, Spetz C, Li X J, Zhou X P, Zhou H B. Base-editing-mediated artificial evolution of OsALS1 in planta to develop novel herbicide-tolerant rice germplasms. Molecular Plant, 2020, 13(4): 565-572.

[86] Liu X S, Qin R Y, Li J, Liao S X, Shan T F, Xu R F, Wu D X, Wei P C. A CRISPR-Cas9-mediated domain-specific base-editing screen enables functional assessment of ACCase variants in rice. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(9): 1845-1847.

[87] Xu R F, Li J, Liu X S, Shan T F, Qin R Y, Wei P C. Development of plant prime-editing systems for precise genome editing. Plant Communications, 2020, 1(3): 100043.

[88] Li J, Meng X B, Zong Y, Chen K L, Zhang H W, Liu J X, Li J Y, Gao C X. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nature Plants, 2016, 2(10): 16139.

[89] Liu L, Kuang Y J, Yan F, Li S F, Ren B, Gosavi G, Spetz C, Li X J, Wang X F, Zhou X P, ZHOU H B. Developing a novel artificial rice germplasm for dinitroaniline herbicide resistance by base editing of OsTubA2. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(1): 5-7.

[90] Tian S W, Jiang L J, Cui X X, Zhang J, Guo S G, Li M Y, Zhang H Y, Ren Y, Gong G Y, Zong M, LIU F, CHEN Q J, XU Y. Engineering herbicide-resistant watermelon variety through CRISPR/Cas9-mediated base-editing. Plant Cell Reports, 2018, 37(9): 1353-1356.

[91] Zong Y, Song Q N, Li C, Jin S, Zhang D B, Wang Y P, Qiu J L, Gao C X. Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion of nCas9 and human APOBEC3A. Nature Biotechnology, 2018, 36(10): 950-953.

[92] Svitashev S, Young J K, Schwartz C, Gao H R, Falco S C, Cigan A M. Targeted mutagenesis, precise gene editing, and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA. Plant Physiology, 2015, 169(2): 931-945.

[93] Kang B C, Woo J W, Kim S T, Bae S J, Choi M, Kim J S, Kim S G. Guidelines for C to T base editing in plants: base-editing window, guide RNA length, and efficient promoter. Plant Biotechnology Reports, 2019, 13(5): 533-541.

[94] Veillet F, Perrot L, Chauvin L, Kermarrec M P, Guyon-Debast A, Chauvin J E, Nogué F, Mazier M.Transgene-free genome editing in tomato and potato plants using-mediated delivery of a CRISPR/Cas9 cytidine base editor. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(2): 402.

[95] LiZ s, Liu Z B, Xing A q, Moon B P, Koellhoffer J P, Huang L x, Ward R T, Clifton E, Falco S C, Cigan A M.Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean. Plant Physiology, 2015, 169(2): 960-970.

[96] Sauer N J, Narváez-Vásquez J, Mozoruk J, Miller R B, Warburg Z J, Woodward M J, Mihiret Y A, Lincoln T A, Segami R E, Sanders S L, WALKER K A, BEETHAM P R, SCH?PKE C R, GOCAL G F W. Oligonucleotide-mediated genome editing provides precision and function to engineered nucleases and antibiotics in plants. Plant Physiology, 2016, 170(4): 1917-1928.

[97] Hummel A W, Chauhan R D, Cermak T, Mutka A M, Vijayaraghavan A, Boyher A, Starker C G, Bart R, Voytas D F, Taylor N J. Allele exchange at the EPSPS locus confers glyphosate tolerance in cassava. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(7): 1275-1282.

[98] BUTLER N M, BALTES N J, VOYTAS D F, DOUCHES D S. Geminivirus-mediated genome editing in potato (L.) using sequence-specific nucleases. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1045.

[99] 強(qiáng)勝, 陳世國. 生物除草劑研發(fā)現(xiàn)狀及其面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn). 雜草科學(xué), 2011, 29(1): 1-6.

Qiang S, Chen S g. Current status of bioherbicide research and development and its opportunities and challenges. Journal of Weed Science, 2011, 29(1): 1-6. (in Chinese)

[100] 蔣田田, 文君慧. 我國抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn). 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 49(22): 239-242.

Jiang T t, Wen J h. Opportunities and challenges facing genetically modified herbicide-resistant crops in china. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2021, 49(22): 239-242. (in Chinese)

[101] He B, Hu Y h, Wang W, Yan W, Ye Y h. The Progress towards novel herbicide modes of action and targeted herbicide development. Agronomy, 2022, 12(11): 2792.

[102] Duke S O, Stidham M A, Dayan F E. A novel genomic approach to herbicide and herbicide mode of action discovery. Pest Management Science, 2019, 75(2): 314-317.

[103] Hu J H, Miller S M, Geurts M H, Tang W, Chen L, Sun N, Zeina C M, Gao X, Rees H A, Lin Z, LIU D R. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature, 2018, 556(7699): 57-63.

[104] ZENG D C, LI X T, HUANG J F, LI Y Y, CAI S Q, YU W Z, LI Y L, HUANG Y P, XIE X R, GONG Q,TAN J T, ZHENG Z Y, GUO M H, LIU Y G, ZHU Q L. Engineered Cas9 variant tools expand targeting scope of genome and base editing in rice. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(6): 1348-1350.

[105] Christie K A, Guo J A, Silverstein R A, Doll R M, Mabuchi M, Stutzman H E, Lin J, Ma L, Walton R T, Pinello L, ROBB G B, KLEINSTIVER B P. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nature Biotechnology, 2023, 41(3): 409-416.

[106] WALTON R T, CHRISTIE K A, WHITTAKER M N, KLEINSTIVER B P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science, 2020, 368(6488): 290-296.

[107] Schindele P, Merker L, Schreiber T, Prange A, Tissier A, Puchta H. Enhancing gene editing and gene targeting efficiencies inby using an intron-containing version of ttLbCas12a. Plant Biotechnology Journal, 2023, 21(3): 457-459.

[108] KLEINSTIVER B P, SOUSA A A, WALTON R T, TAK Y E, HSU J Y, CLEMENT K, WELCH M M, Horng J E, MALAGON-LOPEZ J, SCARFò I, MAUS M V, PINELLO L, ARYEE M J, JOUNG J K. Engineered CRISPR-Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing. Nature Biotechnology, 2019, 37(3): 276-282.

[109] Liu Q, Zhao C L, Sun K, Deng Y L, Li Z H. Engineered biocontainable RNA virus vectors for non-transgenic genome editing across crop species and genotypes. Molecular Plant, 2023, 16(3): 616-631.

[110] Li T D, Hu J C, Sun Y, Li B S, Zhang D L, Li W L, Liu J X, Li D W, Gao C X, Zhang Y L, WANG Y P. Highly efficient heritable genome editing in wheat using an RNA virus and bypassing tissue culture. Molecular Plant, 2021, 14(11): 1787-1798.

[111] Cao X S, Xie H T, Song M L, Lu J H, Ma P, Huang B Y, Wang M G, Tian Y F, Chen F, Peng J, LANG Z B, LI G F, ZHU J K. Cut-dip-budding delivery system enables genetic modifications in plants without tissue culture. The Innovation, 2023, 4(1): 100345.

[112] Maher M F, Nasti R A, Vollbrecht M, Starker C G, Clark M D, Voytas D F. Plant gene editing through de novo induction of meristems. Nature Biotechnology, 2020, 38(1): 84-89.

Opportunities and challenges for developing herbicide-resistance crops in the post-genomic era

WU YuanLong1, HUI FengJiao2, PAN ZhenYuan1, YOU ChunYuan3, LIN HaiRong1, LI ZhiBo1, JIN ShuangXia2, NIE XinHui1

1Agricultural College, Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Ecology Agriculture, Xinjiang Production and Construction Corps, Shihezi 832003, Xinjiang;2College of Plant Sciences & Technology, Huazhong Agricultural University/National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan 430070;3Cotton Research Institute of Shihezi Academy of Agricultural Sciences, Shihezi 832011, Xinjiang

Global agriculture is facing severe challenges, and breeding technology is the foundation and key to the development of the seed industry. Gene editing technology refers to the precise modification of target genes to achieve deletion, insertion, and replacement of specific target gene fragments. It can precisely modify target genes or introduce certain excellent genes into crops to produce crops with excellent agronomic traits, which has great potential in molecular design breeding and is of great significance to ensuring food security. Weed damage has a huge impact on the yield and quality of crops. To control weed damage efficiently, safely and sustainably has always been a hot research topic. Currently, more than 200 types of chemical herbicides have emerged in the global market. Using chemical methods to control weeds has become an important part of modern agriculture, and the cost of weed control has been significantly reduced by promoting herbicide-resistant crops. However, with the large-scale promotion of herbicide-resistant crops and the long-term use of single herbicides, environmental safety problems such as weed resistance and escape of resistant genes have gradually been discovered. Currently, the development of functional genomics, bioinformatics and genetic engineering technology (especially the widespread application of gene editing technology in plants) has created conditions for the creation of herbicide-resistant crops and new efficient weed control systems. In this article, the main target genes of herbicides that inhibit amino acid biosynthesis, lipid metabolism, carotenoid, plastoquinone and tocopherol biosynthesis pathways and their action mechanisms are introduced at first. Secondly, two methods for mining new herbicide resistance genes and herbicide systems are introduced, including the directed mutation method of herbicide resistance genes within crops based on CRISPR/Cas system and the resistance gene guidance method based on the co-evolution theory of natural product and organisms in nature. Moreover, the research progress of three breeding methods for herbicide resistant crops was reviewed, including conventional breeding, transgenic breeding and CRISPR/Cas genome editing based breeding. Among them, the research progress of CIRSPR/Cas system, base editing technology, and prime editing system in cultivating herbicide resistant crops were highlighted. The main challenge faced by chemical control of weeds and herbicide resistant crops is resistant weeds and environmental safety issues, and gene escape, respectively. At present, the rapid development of genome editing technology provides new solutions and new opportunities for the development of herbicide resistant crops in the post genome era. Finally, the prospects for the future of herbicide-resistant crops were provided.

gene editing technology; herbicides; herbicide-resistant genes; breeding of herbicide-resistant crops

2023-05-03；

2023-06-25

兵團(tuán)科技創(chuàng)新人才計(jì)劃-科技特派員（S2019CB1877）、兵團(tuán)科技創(chuàng)新人才計(jì)劃-強(qiáng)青（2021CB028）、石河子大學(xué)青年創(chuàng)新拔尖人才計(jì)劃-拔尖人才（CXBJ202208）

吳元龍：wyl19880322@163.com?；蔌P嬌：17806278731@163.com。吳元龍和惠鳳嬌為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者金雙俠，E-mail：jsx@mail.hzau.edu.cn。通信作者聶新輝，E-mail：xjnxh2004130@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.005

（責(zé)任編輯 李莉）