馬燕斌，李換麗，文晉，周仙婷,2，秦欣，王霞，王新勝，李燕娥

轉基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鑒定

馬燕斌1，李換麗1，文晉1，周仙婷1,2，秦欣1，王霞3，王新勝1，李燕娥1

1山西農(nóng)業(yè)大學棉花研究所，山西運城 044000；2山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030800；3運城學院生命科學系，山西運城 044000

【目的】通過轉化抗草甘膦除草劑基因獲得抗草甘膦除草劑的棉花轉基因株系，對其進行分子特征鑒定分析，為今后棉花育種利用該株系提供必要的分子依據(jù)。【方法】利用農(nóng)桿菌介導法，在草甘膦篩選條件下，通過組織培養(yǎng)獲得棉花再生株系，利用Western blot對轉基因棉花株系不同組織的外源蛋白表達進行檢測；通過Southern blot確定株系中外源整合位點的拷貝數(shù)；利用TAIL-PCR擴增外源基因整合位點側翼序列，并通過NCBI BLAST工具比較分析其定位的染色體位置?！窘Y果】通過草甘膦篩選，利用組織培養(yǎng)獲得R1-3棉花再生株系；Western blot結果表明，外源基因在葉、苞葉、花、莖中均可正常表達，其蛋白大小約為46 kDa，與預期目標條帶一致；基因組DNA酶切后雜交結果顯示，R1-3株系外源序列的整合位點為單拷貝插入，其中，Ⅰ酶切的雜交條帶位于約6 557 bp處，RⅠ酶切的2條雜交帶位于略大于4 316 bp處；側翼序列比對結果顯示，外源序列融合到陸地棉A或D基因組的第11號染色體上，且在交換插入的過程中，左右邊界的融合位點分別位于該染色體47 525 303和47 525 449處。另外，利用特異引物進行PCR鑒定，可知左側融合位點可擴增出約300 bp的預期特定目標條帶，右側融合位點可擴增出約600 bp的預期特定目標條帶?！窘Y論】獲得具有穩(wěn)定遺傳特征的R1-3轉基因棉花株系，不同組織中外源基因編碼的蛋白均有表達，提高了該株系對草甘膦的高抗性。含有的外源序列為單個位點插入，融合位點位于陸地棉A或D基因組第11號染色體上，該融合位點處缺失約146 bp的核苷酸序列。

陸地棉；抗草甘膦棉花；拷貝數(shù)；融合位點；分子特征

0 引言

【研究意義】田間雜草可導致作物減產(chǎn)，利用除草劑進行田間雜草去除是較為簡便的管理方式?？共莞熟⒊輨┟藁ǚN植可有效提高棉田雜草的去除，達到降低人工投入和簡化種植的目標。從近幾十年來抗除草劑作物發(fā)展趨勢可知，抗草甘膦除草劑的玉米、大豆、棉花及油菜等作物具有經(jīng)濟效益顯著的商業(yè)化價值，研究培育抗草甘膦棉花等作物有助于應對今后我國農(nóng)業(yè)發(fā)展在國際市場的競爭。同時，在轉化獲得抗草甘膦棉花的基礎上，進一步鑒定轉基因棉花外源基因相關分子的特征，對滿足轉基因生物安全評價中環(huán)境釋放條件等具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】草甘膦具有廣譜除草特性，可抑制5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase，EPSPS）活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，最終導致植株死亡[1-3]。利用過表達抗草甘膦基因改良作物的抗草甘膦特性是重要的途徑之一，國內(nèi)外抗草甘膦等除草劑作物研究較多[4-5]。近年來，科研人員從不同生物克隆、人工設計等途徑獲得了編碼EPSPS酶的基因，經(jīng)不同方式驗證，這些基因?qū)Σ莞熟⒕哂休^好的耐受性[6-9]，且利用基因編輯技術替換不同位點的氨基酸獲得具有草甘膦抗性的木薯和水稻[10-11]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)在水稻自然進化中存在比野生型更具抗草甘膦特性的突變體[12]。但也有在抗蟲棉花中直接轉入抗草甘膦基因的研究，在保留抗蟲特性的同時達到便捷實現(xiàn)棉花的抗草甘膦特性[13]，同時，國內(nèi)在玉米、棉花等作物中也獲得了具有極高耐受草甘膦除草劑的轉基因作物[14-15]。綜上所述，目前，抗草甘膦基因及相關抗除草劑作物的研究取得了較大進展，抗草甘膦轉基因等作物在今后的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可能具有重要的應用潛力。【本研究切入點】抗草甘膦除草劑棉花品種培育有助于促進棉花的輕簡化栽培，具有自主知識產(chǎn)權的優(yōu)良的抗草甘膦棉花品種亟待培育。研究人員在獲得高抗草甘膦的轉基因棉花材料后，為滿足國內(nèi)轉基因作物環(huán)境釋放要求，抗性材料的遺傳穩(wěn)定性、單個位點插入及整合位點側翼序列等是需要提交的分子特征，同時也是國內(nèi)自主培育作物產(chǎn)權的要求之一。【擬解決的關鍵問題】本研究利用農(nóng)桿菌介導法轉化獲得的抗草甘膦棉花材料R1-3，檢測不同組織中外源蛋白的表達，利用Southern blot、TAIL-PCR等方法分別鑒定轉基因棉花R1-3材料中外源序列的拷貝數(shù)、側翼序列，以及分析融合位點處序列的特征，為后續(xù)該轉基因材料環(huán)境釋放、育種利用及生物安全檢測等方面提供較詳實的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物表達載體及棉花受體材料

棉花受體為山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花所選育材料陸地棉R15（L.），植物表達載體為含抗草甘膦基因的pCAMBIA 1300（圖1）。

圖1 G10aroA的pCAMBIA1300載體構建示意圖

1.2 外源G10aroA的棉花轉化及再生株系R1-3的獲得

LB液體培育含有植物轉化載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404，培養(yǎng)基中加入抗生素卡那霉素和利福平，28 ℃搖床懸浮過夜培養(yǎng)，離心倒去上清液收集農(nóng)桿菌，沉淀用30 g·L-1的葡萄糖重新懸浮，調(diào)整OD值為0.6，浸染棉花下胚軸切段后，22 ℃黑暗共培養(yǎng)48 h，在草甘膦濃度為2.5 mmol·L-1的MS培養(yǎng)基上進行愈傷誘導，按照常規(guī)轉化方法進行棉花轉基因[14,16]，獲得再生植株后，PCR檢測確定陽性植株，自交后收獲種子，多年自交繁育獲得純合穩(wěn)定的轉基因抗草甘膦株系R1-3。

1.3 棉花DNA提取與Southern blot分析

試驗轉基因材料種植于隔離棚內(nèi)。取幼嫩棉花葉片放入離心管內(nèi)，液氮快速冷凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎酶牧嫉腃TAB法[17]提取轉基因棉花植株等試驗樣品DNA，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，利用內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ分別進行酶切，電泳轉膜后，采用地高辛標記法進行Southern blot分析，探針為擴增特異片段序列后標記，擴增引物為779F：5′-GCGTGGATATGTCCTGCGGG-3′；1481R：5′-TCT ACACAGCCATCGGTCCAG-3′。

1.4 外源基因融合插入位點鑒定

利用TAIL-PCR進行擴增，根據(jù)pCAMBIA 1300植物轉化載體左右邊界序列設計特異引物后擴增。隨機引物設計及擴增程序參照Liu等[18]，引物見表1。

表1 R1-3轉基因棉花R1-3整合位點的TAIL-PCR與側翼序列擴增特異引物

LP：左邊界特異引物；RP：右邊界特異引物 LP: specific primers for left boundary; RP: specific primers for right boundary

1.5 側翼序列分析

通過對TAIL-PCR克隆的序列進行測序，利用DNAMAN軟件，將測序結果分別與引物、載體邊界序列進行比較，結果相匹配后，利用NCBI網(wǎng)站Blast分析工具，輸入測序結果進行融合位點預測分析。

1.6 Western blot免疫印跡分析

取R1-3棉花株系的不同組織，液氮研磨樣品，取約0.1 g樣品加磷酸緩沖液后轉入2 ml滅菌離心管中，離心提取上清液后，用分光光度計檢測提取的樣品蛋白濃度，濃度均一化處理。蛋白電泳上樣前加入1×loading buffer，樣品煮沸變性10 min，取等量樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，經(jīng)轉膜、封閉、抗體雜交，二抗為編碼的EPSPS蛋白特異抗體[15]，直接顯影后對雜交膜拍照。

2 結果

2.1 外源G10aroA的轉化及轉基因植株的獲得

用農(nóng)桿菌菌液浸染切好的棉花無菌苗莖段，經(jīng)共培養(yǎng)后，在含有草甘膦的培養(yǎng)基上進行愈傷誘導（圖2-A），持續(xù)誘導待形成塊狀愈傷（圖2-B）。塊狀愈傷單獨分離后培養(yǎng)增殖，轉入分化培養(yǎng)基誘導后繼續(xù)誘導形成胚性愈傷（圖2-C）。持續(xù)培養(yǎng)后轉入分化培養(yǎng)基再生并生成完整幼苗植株（圖2-D—E）。選取生長正常的幼苗嫁接成活后移入盆中溫室種植（圖2-F），待轉基因植株開花自交棉鈴成熟后收獲種子。

A：農(nóng)桿菌侵染后的棉花下胚軸外植體愈傷誘導；B：下胚軸誘導的愈傷；C：愈傷增殖；D：胚性愈傷分化；E：分化后生成的幼苗；F：再生植株

2.2 外源蛋白在不同組織中表達分析

通過對轉基因植株噴施草甘膦進行抗性篩選和多個世代的分離純化，獲得純合轉基因R1-3等轉基因植株，為進一步鑒定優(yōu)良的轉基因抗性植株，提取轉基因株系R1-3的葉、苞葉、花、莖等不同組織中的總蛋白，利用特異抗體對外源EPSPS蛋白表達進行鑒定分析。Western blot雜交結果表明，與陰性對照相比，在轉基因株系R1-3的不同組織中，均檢測到EPSPS蛋白的表達（圖3），表明外源基因在葉、苞葉、花、莖中均可正常翻譯表達，其中，外源蛋白預期大小約為46 kDa。因此，可確定外源抗草甘膦基因在棉花株系R1-3中可正常表達。

2.3 外源基因在棉花基因組插入拷貝數(shù)鑒定

根據(jù)外源基因序列設計特異探針引物，擴增特異序列后，利用地高辛標記探針，提取轉基因植株等試驗材料的基因組DNA純化后，分別加入內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ進行酶切消化，其中，前期分析已知抗草甘膦基因中不含有該內(nèi)切酶位點；電泳轉膜后進行Southern blot雜交，結果（圖4）表明，受體R15無雜交條帶信號，pCAMBIA1300載體陽性質(zhì)粒雜交在小于23 130 bp的位置有明顯的雜交條帶，表明該特異探針雜交效果可滿足目標基因檢測；同時，為選擇具有單拷貝的轉基因植株，對轉基因株系R1-3進行雜交分析，結果顯示，雜交條帶清晰，條帶位置約介于Marker標記的4 316—23 130 bp；其中，由于構建載體的2個序列之間存在RⅠ酶切位點，雜交結果顯示，有緊密相鄰的2條雜交帶，而Ⅰ酶切的R1-3雜交條帶顯示為單拷貝插入，這些條帶分別位于Marker標記約4 316 bp和略小于6 557 bp位置處。

-：陰性對照R15；M：蛋白Marker，46 kDa為R1-3棉花株系中EPSPS蛋白條帶大小

左側2條帶分別為R1-3被EcoRⅠ和KpnⅠ酶切的雜交結果；-：R15陰性對照結果，內(nèi)切酶EcoRⅠ消化；M：DNA Marker；+：內(nèi)切酶EcoRⅠ消化的含外源基因G10aroA的pCAMBIA1300載體，箭頭指示雜交條帶的位置

2.4 外源基因在棉花基因組融合位點及側翼序列鑒定

提取R1-3株系DNA，分別利用轉基因載體左右邊界序列設計特異引物和基因組隨機引物進行TAIL-PCR擴增，進行三輪擴增后，選擇特異條帶回收并克隆轉化，測序后得到核苷酸序列信息。首先利用DNAMAN軟件比較測序結果與引物、載體邊界序列的一致性，結果顯示，克隆的部分測序序列可與擴增引物和載體邊界序列相匹配。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對測序序列進行Blast分析，結果顯示，與載體邊界相融合的克隆序列，分別與棉花TM1參考基因組A11和D11染色體基因組序列相一致。由于陸地棉A、D基因組相似性較高，以A基因組序列參考分析可知（圖5-A），載體左邊插入位置為棉花A（D）基因組第11號染色體47 525 303處（圖5-B，L位置），載體右邊界插入位置為染色體47 525 449處（圖5-B，R位置），由序列比較可知，左右邊界序列插入染色體位置缺失約146 bp核苷酸序列。同時，從插入邊界的序列分析可知，外源基因插入染色體編碼方向為由L到R。另外，利用融合插入位點附近比較一致的序列分別設計左右兩端的特異引物（表1），PCR擴增驗證結果表明，左側融合位點可擴增出約300 bp特異目標條帶（圖5-C），右側融合位點可擴增出約600 bp特異目標條帶（圖5-D）。

3 討論

3.1 抗除草劑棉花具有潛在的種植優(yōu)勢

抗除草劑作物的種植在田間雜草防治、生產(chǎn)管理簡化、防止作物減產(chǎn)等方面均具有突出的優(yōu)勢[19-20]。棉花是世界上重要的纖維類經(jīng)濟作物之一，當前除新疆棉區(qū)外其他棉區(qū)均面臨棉花種植面積逐漸減少的趨勢。因此，提高棉花種植經(jīng)濟效益和簡化種植模式是當前棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的亟需要求。同時，為滿足潛在的棉花種植輕簡化發(fā)展需求，培育具有自主知識產(chǎn)權的抗除草劑棉花是理想的途徑之一。

3.2 培育具有自主產(chǎn)權的抗草甘膦除草劑棉花有利于國內(nèi)棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展

世界上種植轉基因作物80%以上面積為單一抗草甘膦作物，其中，這些作物抗草甘膦基因受專利保護，被利用最多的是[21]，潛在的利用價值也促進了不同單位對新的抗草甘膦基因的研究[22-23]。本研究在通過草甘膦篩選的基礎上獲得一批抗草甘膦轉基因棉花株系。通過自交選育和噴施草甘膦分離鑒定獲得純合的轉基因植株后，選育抗性和農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系用于后續(xù)的分子鑒定。通過Western blot雜交分析R1-3植株不同組織外源蛋白表達可知，各組織中均可以檢測到編碼的EPSPS外源蛋白，這與田間噴施草甘膦R1-3植株葉、花、蕾等各組織可正常生長發(fā)育的表現(xiàn)相一致，不同組織對草甘膦的高耐受性也是轉基因植株所必需的性狀[15, 24]，在種植時處理田間雜草會達到較好的殺滅效果。另外，該外源基因編碼蛋白在轉基因植株中具有明顯的雜交條帶，受體植株R15檢測不到該蛋白的表達，因此，在轉基因檢測中利用抗體檢測也是識別該轉基因植株特異性的方法之一。此外，從國內(nèi)抗草甘膦棉花的相關研究脈絡可知，不同單位從較早的抗性基因克隆、轉基因植株獲得、田間抗性鑒定到生物安全評價等各方面均有較多研究[25-26]；這些自主研究的積累將有助于促進我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的國際競爭力。

A：R1-3株系中外源序列的融合位點兩側側翼序列經(jīng)TAIL-PCR擴增后測序結果與TM-1基因組的一致性比較，L為pCAMBIA 1300載體左邊界插入位置，R為pCAMBIA 1300載體右邊界插入位置；B：外源序列整合到R15基因組中的示意圖；C：左邊界融合側翼序列的特異PCR擴增；D：右邊界融合側翼序列的特異PCR擴增

3.3 轉基因植株分子信息鑒定是后續(xù)安全評價利用重要參考數(shù)據(jù)

本研究在抗草甘膦除草劑中間試驗的基礎上，鑒定提供可靠的R1-3植株中外源基因融合位點、外源序列拷貝數(shù)以及側翼序列等特征是該材料安全利用的必要科學證據(jù)。從基因拷貝數(shù)分析結果看，RⅠ和Ⅰ酶避開了外源基因內(nèi)插入?yún)^(qū)域的酶切位點，整合到染色體上后，RⅠ酶切的R1-3條帶與構建載體酶切后的雜交條帶均為2條，而Ⅰ酶切條帶為單一條帶，這兩個酶切結果可相互驗證表明，該外源基因區(qū)域的插入染色體為單一融合位點，該融合位點具有穩(wěn)定遺傳特性。另外，T-DNA位點的分子特征信息為公共風險評估和監(jiān)測所提供了必要的依據(jù)，同時也用于分析相關內(nèi)源性基因的表達是否受影響[27-28]。本研究根據(jù)整合位點序列比對結果預測為棉花A基因組第11號染色體，由于陸地棉為異源四倍體，含有A、D 2個染色體組且具有高度的核苷酸序列一致性，Blast序列比較時結果顯示，與D染色體組第11號染色體也具有極高的一致性，因此，從結果上不排除該外源基因整合到D11染色體的可能性，后續(xù)有待進一步驗證。在此基礎上，分析外源基因整合位點側翼序列可知，整合位點區(qū)及上下游區(qū)域附近的基因組核苷酸序列沒有任何假定或注釋的基因，表明該外源基因插入對棉花基因組表達的影響較小，后續(xù)該側翼序列的分子特征將為驗證利用提供必要的科學依據(jù)。

4 結論

R1-3轉基因棉花植株的不同組織中均可檢測到約46 kDa大小的目標蛋白。含有抗草甘膦基因的外源序列為單個位點插入，左邊界融合位點位于棉花基因組A或D的第11號染色體47 525 303處，載體右邊界融合插入位置為染色體47 525 449處。表明獲得外源序列為單個整合位點的、可穩(wěn)定遺傳的高抗草甘膦轉基因棉花植株。

[1] Duke S O. The history and current status of glyphosate. Pest Management Science, 2018, 74(5): 1027-1034.

[2] Powell H A, KerBby N W, Rowell P. Natural tolerance of cyanobacteria to the herbicide glyphosate. New Phytologist, 1991, 119(3): 421-426.

[3] Funke T, Han H, Healy-Fried M L, Fischer M, Sch?nbrunnE. Molecular basis for the herbicide resistance of roundup ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(35): 13010-13015.

[4] Comai L, Facciotti D, Hiatt W R, Thompson G, Rose R E, Stalker D M. Expression in plants of a mutant aroA gene fromconfers tolerance to glyphosateNature, 1985, 317(6039): 741-744.

[5] Ye G N, Hajdukiewicz P T J, Broyles D, Rodriguez D, Xu C W, Nehra N, Staub J M. Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate -3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco. The Plant Journal, 2001, 25(3): 261-270.

[6] Yi S Y, Cui Y, Zhao Y, Liu ZD, Lin YJ, Zhou F. A novel naturally occurring class I 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Janibacter sp. confers high glyphosate tolerance to rice.Scientific Reports, 2016, 6: 19104.

[7] Liu F, Cao Y P. Cloning and characterization of 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase fromsp. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(4): 19233-19241.

[8] Cui Y, Huang S Q, Liu Z D, Yi S Y, Zhou F, Chen H, Lin Y J. Development of novel glyphosate-tolerantrice lines: a step toward commercial release.Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1218.

[9] Han J, Tian YS, Xu J, Wang LJ, Wang B, Peng RH, Yao QH. Functional characterization of aroAfromwith significant glyphosate tolerance in transgenic. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014, 24(9): 1162-1169.

[10] Hummel AW, Chauhan RD, Cermak T, Mutka AM, Vijayaraghavan A, Boyher A, Starker CG, Bart R, Voytas DF, Taylor NJ. Allele exchange at the EPSPS locus confers glyphosate tolerance in cassava. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(7): 1275-1282.

[11] Li J, Meng X B, Zong Y, Chen K L, Zhang H W, Liu J X, Li J Y, Gao C X. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9.Nature Plants, 2016, 2: 16139.

[12] Yu Q, Jalaludin A, Han H P, Chen M, Sammons R D, Powles S B. Evolution of a double amino acid substitution in the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Eleusine indica conferring high-level glyphosate resistance.Plant Physiology, 2015, 167(4): 1440-1447.

[13] Latif A, Rao A Q, Khan M A, Shahid N, Bajwa K S, Ashraf M A, Abbas M A, Azam M, Shahid A A, Nasir I A, Husnain T. Herbicide-resistant cotton () plants: an alternative way of manual weed removal. BMC Research Notes, 2015, 8: 453.

[14] 王霞, 馬燕斌, 吳霞, 沈志成, 林朝陽, 李朋波, 孫璇, 王新勝, 李燕娥, 李貴全. 轉G10aroA棉花株系的獲得及分子生物學鑒定. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2014, 47(6): 1051-1057.

Wang X, Ma Y B, Wu X, Shen Z C, Lin C Y, Li P B, Sun X, Wang X S, Li Y E, Li G Q. Molecular biology identification of transgenic cotton lines expressing exogenous G10aroA gene. Scientia Agricultura Sinica,2014, 47(6): 1051-1057. (in Chinese)

[15] Liu M M, Zhang X J, Gao Y, Shen Z C, Lin C Y. Molecular characterization and efficacy evaluation of a transgenic corn event for insect resistance and glyphosate tolerance. Journal of Zhejiang University Science B, 2018, 19(8): 610-619.

[16] 李燕娥, 朱禎, 陳志賢, 吳霞, 王偉, 李淑君, 朱玉, 焦改麗, 吳家和, 徐鴻林, 范小平, 孟晉紅, 肖桂芳, 李向輝. 豇豆胰蛋白酶抑制劑轉基因棉花的獲得. 棉花學報, 1998, 10(5): 237-243.

Li Y E, Zhu Z, Chen Z X, Wu X, Wang W, Li S J, Zhu Y, Jiao G L, Wu J H, Xu H L, Fan X P, Meng J H, Xiao G F, Li X H. Obtaining transgenic cotton plants with cowpea trypsin inhibitor gene. Acta Gossypii Sinica,1998, 10(5): 237-243. (in Chinese)

[17] Paterson A H, Brubaker C L, Wendel J F. A rapid method for extraction of cotton (spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.Plant Molecular Biology Reporter,1993, 11(2): 122-127.

[18] Liu Y G, Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques, 2007, 43(5): 649-650, 652, 654 passim.

[19] ZABLOTOWICZ R M, REDDY K N. Impact of glyphosate on thesymbiosis with glyphosate-resistant transgenic soybean: A minireview. Journal of environmental quality,2004, 33(3): 825-831.

[20] Heard M S, Hawes C, Champion G T, Clark S J, Firbank L G, Haughton A J, Parish A M, Perry J N, Rothery P, Scott R J, Skellern M P, Squire G R, Hill M O. Weeds in fields with contrasting conventional and genetically modified herbicide-tolerant crops: I. Effects on abundance and diversity. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 2003, 358(1439): 1819-1832.

[21] Bonny S. Genetically modified herbicide-tolerant crops, weeds, and herbicides: Overview and impact. Environmental Management, 2016, 57(1): 31-48.

[22] Tan X L, Othman R Y, Teo C H. Isolation and functional characterization of 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase gene from glyphosate-tolerantstrains FY43 and FY47. 3 Biotech, 2020, 10(4): 183.

[23] Ghaderitabar H, Mousavi A, Hatef S A, Hadi F. Novel aroA of Glyphosate-tolerant bacterium Pseudomonas sp. strain HA-09 isolated from roundup-contaminated garden soils in iran. Iranian journal of biotechnology, 2020, 18(3): e2597.

[24] WENDY A P, ANDREW J P, JOHN W W, KEITH L E, RANDY W. Absorption and translocation of glyphosate in glyphosate-resistant cotton as influenced by application method and growth stage.Weed Science, 2001, 49(4): 460-467.

[25] 趙福永, 謝龍旭, 田穎川, 徐培林. 抗草甘膦基因aroAM12及抗蟲基因Bts1m的轉基因棉株. 作物學報, 2005, 31(1): 108-113.

ZHAO F Y, XIE L X, TIAN Y C, XU P L. Glyphosate-resistant and bollworm-resistant transgenic cotton plants with the aroAM12 and Bts1m genes. Acta Agronomica Sinica, 2005, 31(1): 108-113. (in Chinese)

[26] 劉錫娟, 劉昱輝, 王志興, 王旭靜, 張永強. 轉5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因抗草甘膦煙草和棉花的獲得. 農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2007, 15(6): 958-963.

Liu X J, Liu Y H, Wang Z X, Wang X J, Zhang Y Q. Generation of glyphosate-tolerant transgenic tobacco and cotton by transformation with a 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene. Journal of Agricultural Biotechnology, 2007, 15(6): 958-963. (in Chinese)

[27] Chen X H, Dong Y, Huang Y L, Fan J M, Yang M S, Zhang J. Whole-genome resequencing using next-generation and Nanopore sequencing for molecular characterization of T-DNA integration in transgenic poplar 741. BMC Genomics, 2021, 22(1): 329-342.

[28] Tang G X, Zhong X B, Hong W, Li J F, Shu Y, Liu L L. Generation and identification of the number of copies of exogenous genes and the T-DNA insertion site in SCN-resistance transformation event ZHs1-2. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(12): 6849.

Identification of Molecular Characterizations for Transgenic Cotton R1-3 Line of Glyphosate Tolerance

1Institute of Cotton Research, Shanxi Agriculture University, Yuncheng 044000, Shanxi;2College of Agronomy, Shanxi Agriculture University, Taigu 030800, Shanxi;3Department of Life Science, Yuncheng University, Yuncheng 044000, Shanxi

【Objective】To obtain the transgenic cotton by-mediated method was the purpose using the new genewith high glyphosate tolerance in our laboratory. Meanwhile, it was necessary to provide molecular characteristics of genomic integration of the exogenous gene for breeding utilization in future. 【Method】The-mediated method was used for transgenic cotton plants obtained via tissue culture with glyphosate herbicide. Western blot was utilized to detect the expression of exogenous proteins in different organs of transgenic cotton R1-3. The number of loci in cotton genomes were evaluated by Southern blot for detecting integration of the exogenous sequence from the pCAMBIA1300construct. The flanking sequence near the insertion site was amplified by TAIL-PCR, which the extractions of DNA were cloned and sequenced. The location of the chromosome for the flanking sequences were compared and analyzed on the website of NCBI blast. 【Result】Regenerated R1-3 cotton plants were successfully obtained by tissue culture depending on glyphosate screening. the specific protein coded by exogenousgene could be detected normally via Western blotting in the leaves, bracts, flowers and stems separately, and the size of the exogenous protein around 46 kDa were also observed in this experiment. In addition, the result of Southern-blot confirmed that the exogenous fragment containingsequences was single integration in the genome of transgenic cotton R1-3, in which the bands digested severally byⅠ andRⅠ endonucleases were distinctly observed near the position of 6 557 bp and 4 316 bp strips on the nylon membrane respectively. The analysis of flanking sequence alignment for the integration site was predicted to be located on the 11th chromosome of either cotton A or D genome, and the left and right boundaries of the insertion site were further located between 47 525 303 and 47 525 449 of the chromosomes. In addition, the specific identification for the fusion site showed that the target band of approximately 300 bp for testing left border junction, and a specific target band can be amplified about 600 bp for testing the right border fusion site.【Conclusion】In this study, we obtained R1-3 transgenic cotton plants that also have exhibited stable genetic characteristics of glyphosate resistance during the process of self-crossing breeding. The protein coded bygene was about the size of 46 kDa that could be detected in different tissues of transgenic cotton R1-3 plant. Furthermore, the exogenous fragment includinggene was identified with a single location by southern blot in the cotton genomes, and the integration site was located at the 11th chromosome. The results of comparative analysis were predicted that a nucleotide sequence about 146 bp length was deleted at the integration of the genome.

L.; glyphosate-tolerance cotton; copy number; integration site; molecular characterization

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.004

2023-02-01；

2023-07-05

轉基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08010-003）、山西省應用基礎研究面上項目（202103021224145）、山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YGJPY2007）

通信作者馬燕斌，E-mail：myb0517@163.com

（責任編輯 李莉）