劉曦，龔黎燕

基于急慢性疼痛的動物模型研究進(jìn)展

劉曦，龔黎燕

浙江省腫瘤醫(yī)院疼痛康復(fù)科，浙江杭州 310022

疼痛管理是臨床醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)研究內(nèi)容之一。目前，急慢性疼痛的機(jī)制尚未完全明確。為更深入地開展基礎(chǔ)研究，需建立更多且更有針對性的動物模型以模擬各類型疼痛。本文就近年來在疼痛基礎(chǔ)研究中常用的部分急慢性疼痛模型研究進(jìn)展作一綜述，為進(jìn)一步研究疼痛機(jī)制及篩選相關(guān)治療藥物提供理論參考。

動物模型；嗎啡耐受；急性疼痛；慢性疼痛；癌性疼痛

疼痛被列為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)第五大生命體征，疼痛管理是臨床關(guān)注的重點(diǎn)之一。按損傷持續(xù)的時間，疼痛可分為急性疼痛和慢性疼痛?！栋┌Y疼痛診療規(guī)范（2018版）》[1]對疼痛的定義：持續(xù)時間超過1個月的疼痛為慢性疼痛，新近產(chǎn)生、持續(xù)時間較短的疼痛為急性疼痛。動物模型廣泛應(yīng)用于疼痛的相關(guān)研究中，主要應(yīng)用于疼痛機(jī)制的研究及鎮(zhèn)痛藥物效能的評估中。本文就近年來在疼痛基礎(chǔ)研究中常用的部分急慢性疼痛模型研究進(jìn)展作一綜述，為進(jìn)一步研究疼痛機(jī)制及篩選相關(guān)治療藥物提供理論參考。

1 急性疼痛模型

根據(jù)疼痛的發(fā)生原理，急性疼痛可分為生理性和病理性。生理性疼痛是指增加的局部刺激使機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)性疼痛；病理性疼痛是由創(chuàng)傷或疾病狀態(tài)帶來的炎癥反應(yīng)或神經(jīng)損傷引起的，若遷延不愈可發(fā)展為慢性疼痛。目前更常見的分類方法是根據(jù)所模擬疾病的病理生理特點(diǎn)，將急性疼痛模型分為軀體痛模型和內(nèi)臟痛模型兩類。

研究認(rèn)為，軀體痛可通過福爾馬林模型進(jìn)行模擬[2]。將1%的福爾馬林液注射至實驗鼠右后爪背側(cè)，其可出現(xiàn)兩個不同時相的疼痛反應(yīng)。第一時相為注射后立刻出現(xiàn)的疼痛，持續(xù)時間約為10min；第二時相則從注射15～20min后開始，持續(xù)時間約為1h。在實驗研究中，常使用第二時相。兩時相疼痛的發(fā)生機(jī)制不同，如非甾體類鎮(zhèn)痛藥可減輕第二時相疼痛，但無法控制第一時相疼痛。大鼠和小鼠對福爾馬林注射的反應(yīng)也有所不同：大鼠表現(xiàn)為爪趾抽縮，小鼠表現(xiàn)為舔舐。目前認(rèn)為第二時相疼痛是周圍炎癥性疼痛，與中樞敏化作用相關(guān)，該模型可用于因組織損傷造成的痛覺過敏機(jī)制的探索。

內(nèi)臟痛動物模型主要通過炎性刺激觸發(fā)并建立。例如，扭體試驗是將刺激性化學(xué)物質(zhì)注入實驗動物體腔內(nèi)，從而引發(fā)炎性疼痛[3]。將乙酸、緩激肽等試劑注入動物腹腔，觀察動物隨之表現(xiàn)出的臀部位置不正、腹部收縮等扭體反應(yīng)，動物體位的改變幅度或收縮動作頻率數(shù)據(jù)可用于量化評估。該方法可制備相應(yīng)急性膀胱炎模型、潰瘍性結(jié)腸炎模型等。福爾馬林也可用于經(jīng)典急性內(nèi)臟痛模型的構(gòu)建，向大鼠結(jié)腸壁注射1.5%的福爾馬林，15min后大鼠會出現(xiàn)舔舐、身體收縮、扭頭等動作，從而證實建模成功。

2 疼痛行為學(xué)檢測

疼痛行為學(xué)檢測是對實驗動物施加急性、傷害性刺激，通過動物縮足或甩尾潛伏期、機(jī)械性刺激或溫度刺激閾值等反射行為學(xué)變化，評估動物是否出現(xiàn)觸誘發(fā)痛、機(jī)械性痛敏及冷熱刺激反應(yīng)。該類操作模擬生理性急性疼痛，無法使實驗動物產(chǎn)生病理改變，因此不能單獨(dú)用于模型制作，但常被用于各類疼痛動物模型中痛閾變化的驗證。

機(jī)械性痛覺反應(yīng)檢測通常采用Von Frey試驗[4]。該試驗方法最早于19世紀(jì)由Maximilian Von Frey提出。利用Von Frey纖維絲彎曲產(chǎn)生既定壓力，按壓力的小大順序刺激實驗動物腳底并記錄其機(jī)械縮足閾值；或以恒定壓力的Von Frey纖維絲以恒定的頻率反復(fù)刺激，測試實驗動物后腿收縮頻率，即機(jī)械縮足持續(xù)時間。其中，機(jī)械縮足閾值的測定標(biāo)準(zhǔn)后由Dixon和Chaplan等進(jìn)一步優(yōu)化[5-6]。目前，該方法已逐漸被更加便捷、精準(zhǔn)的Von Frey電子儀所取代，以保證纖維絲連續(xù)、均勻施力。

經(jīng)大鼠肛門插入可擴(kuò)張的氣囊，通過注氣擴(kuò)張結(jié)直腸可模擬內(nèi)臟痛，評估動物的誘發(fā)痛行為。痛閾可通過腹壁撤回反射評分進(jìn)行評價。該實驗評估標(biāo)準(zhǔn)為大鼠的行為模式改變程度，實驗結(jié)果主觀性較強(qiáng)。

冷熱刺激反應(yīng)是嚙齒類動物疼痛評估的常用方法。甩尾實驗是基于實驗鼠對熱刺激回避反應(yīng)的潛伏期進(jìn)行測量的實驗[7]。其操作方式為對實驗鼠尾部施加熱刺激，記錄實驗鼠尾巴甩動時間。相比于甩尾實驗，熱板實驗的優(yōu)點(diǎn)在于不用約束實驗鼠，從而減少因人為干擾可能形成應(yīng)激導(dǎo)致的疼痛。哈格里夫斯試驗通過小鼠后爪移開某一熱刺激所需的時間評估研究對象的疼痛反應(yīng)[8]。

將甩尾實驗中的遠(yuǎn)端熱水浴替換為冰水混合物即可用于檢測冷閾值，即冷刺激反應(yīng)。丙酮實驗通過將丙酮滴到實驗大鼠后肢局部造成冷刺激，這種刺激不會讓正常大鼠感到疼痛，但存在冷觸覺過敏大鼠則會有疼痛反應(yīng)[9]。因正常小鼠對丙酮相當(dāng)敏感，易產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，故小鼠不適合丙酮實驗；丙酮滴導(dǎo)致的抬足反應(yīng)可能是由于冷刺激，也可能是由于化學(xué)刺激，甚至是丙酮滴的機(jī)械刺激。目前，冷平板實驗多使用半導(dǎo)體制冷平板，適用于冷刺激痛及冷痛覺過敏的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制和藥物療效研究。相較于丙酮實驗，冷平板實驗受環(huán)境溫度和實驗動物體溫影響較小，但無法避免機(jī)械刺激的影響是其劣勢[10]。

上述經(jīng)典檢測方式的局限性在于所檢測到的反應(yīng)僅為健康實驗動物接受急性傷害性刺激后的變化，且因重復(fù)測試，動物可能會學(xué)習(xí)到行為反應(yīng)，從而導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不夠準(zhǔn)確[11]。

3 慢性疼痛模型

慢性疼痛即病理性疼痛，其機(jī)制較急性疼痛更為復(fù)雜。根據(jù)成因，其可分為神經(jīng)性疼痛、炎癥性疼痛和癌性疼痛，涉及機(jī)體的系統(tǒng)性病變，其特點(diǎn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和感覺異常[12]。神經(jīng)病理痛模型、慢性炎癥疼痛模型及骨癌痛模型、嗎啡耐受癌性疼痛模型等均是目前研究的熱點(diǎn)模型。

3.1 慢性非癌性疼痛動物模型

使用炎性物質(zhì)在實驗動物皮下、關(guān)節(jié)腔注射或通過機(jī)械、熱損傷組織，可在嚙齒動物中誘發(fā)炎癥損傷，從而構(gòu)建慢性炎癥疼痛模型。與急性期疼痛模型不同，為確保疼痛持續(xù)時間及相關(guān)炎性機(jī)制的觸發(fā)，需使用效用更長的化學(xué)試劑，最常用的是福氏佐劑足底內(nèi)注射，或肌內(nèi)、關(guān)節(jié)腔注射[13]。這是一種包含滅活丁酸分歧桿菌的油包水乳劑，易于誘發(fā)濃度依賴性損傷，產(chǎn)生的炎性疼痛反應(yīng)可持續(xù)2周，且有延長的超敏反應(yīng)期，可用于構(gòu)建慢性骨關(guān)節(jié)炎疼痛模型。類似的佐劑性關(guān)節(jié)炎也可通過四甲基十五烷、角叉菜膠、蛋白多糖等誘發(fā)[14]。

神經(jīng)病理性疼痛模型是慢性疼痛研究中的另一種經(jīng)典動物模型。最早的神經(jīng)痛模型是坐骨神經(jīng)慢性壓扎模型，用羊腸線輕度結(jié)扎大鼠坐骨神經(jīng)干，在術(shù)后3～5d引發(fā)疼痛反應(yīng)，并在5～7d左右達(dá)峰，可持續(xù)2個月以上[15]。該模型可進(jìn)一步優(yōu)化為脊神經(jīng)結(jié)扎模型和保留性神經(jīng)損傷模型，分別為結(jié)扎切斷L5脊神經(jīng)、結(jié)扎切斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，可避免坐骨神經(jīng)慢性壓扎模型中受羊腸線松緊度影響疼痛強(qiáng)度，甚至影響肢體運(yùn)動的情況；且保留性神經(jīng)損傷模型下大鼠對機(jī)械刺激更加敏感[16]。另外，可將炎性疼痛與神經(jīng)病理痛結(jié)合，在坐骨神經(jīng)周圍直接置管注入促炎分子酶原，制備坐骨神經(jīng)痛模型。

臨床上較為棘手的燒傷痛是一種由炎癥性疼痛、痛覺性疼痛和神經(jīng)性疼痛復(fù)合而成的特殊疼痛類型，可通過綜合上述疼痛模型進(jìn)行模擬，也可將小鼠置于中間流有熱水的空心金屬板上，控制燒傷厚度制備符合需求的燒傷疼痛模型[17]。此外還存在一些較為特殊的慢性神經(jīng)病理疼痛模型，如用于研究化療藥物致周圍神經(jīng)病理性疼痛的模型[16]。為制備該模型，Slivicki團(tuán)隊向小鼠腹腔內(nèi)每隔1d注射1次紫杉醇，用于引發(fā)小鼠對機(jī)械刺激和冷刺激的痛覺超敏。

3.2 慢性癌性疼痛動物模型

癌性疼痛發(fā)生于60%～80%的晚期惡性腫瘤中，其危害性極大，是目前疼痛康復(fù)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)癌性疼痛屬慢性疼痛，與非癌性疼痛的機(jī)制不同，尤其慢性癌性疼痛刺激下的大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活性明顯與非癌性不同[18]。因而用于研究癌性疼痛的動物模型與非癌性也有所區(qū)別。

癌癥引起的骨痛多見于晚期惡性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移中，以機(jī)械觸發(fā)痛和痛覺敏化為特征，但其機(jī)制目前尚不明確。小鼠骨癌痛模型于1999年被首次提出[19]。早期的骨癌痛模型集中于原發(fā)性骨癌痛的還原，所選細(xì)胞為可誘發(fā)骨肉瘤生長的纖維肉瘤。但事實上，乳腺癌與前列腺癌較多發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，激發(fā)骨癌性疼痛的現(xiàn)象更加常見。Medhurst將含MRMT細(xì)胞的Hank’s液注射到大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)，成功制備大鼠乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的骨癌痛模型[20]。使用Walker256大鼠腹水癌細(xì)胞對該模型進(jìn)一步完善，形成簡單、實用的骨癌痛大鼠模型[21]。與小鼠模型相比，大鼠體質(zhì)量大，腫瘤細(xì)胞數(shù)量上的可控范圍更大；同時大鼠骨骼粗，造模實驗操作更方便。早年研究者大多用小鼠造模的主要原因是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞系多來源于小鼠。

以嗎啡為代表的阿片類藥物是世界衛(wèi)生組織推薦的重度癌性疼痛的標(biāo)準(zhǔn)用藥[1]。嗎啡耐受會嚴(yán)重影響其鎮(zhèn)痛效果，易發(fā)展成為難治性疼痛，改善嗎啡的耐受性是癌性疼痛治療中亟待解決的問題。嗎啡耐受屬藥理學(xué)概念，是指重復(fù)應(yīng)用嗎啡后，機(jī)體對嗎啡的反應(yīng)性降低，導(dǎo)致鎮(zhèn)痛效力降低，藥效-劑量曲線右移[22]。臨床表現(xiàn)為持續(xù)給予嗎啡后鎮(zhèn)痛效果逐漸減弱甚至消失，需增加劑量才能獲得同等鎮(zhèn)痛效果。以嗎啡為代表的阿片類藥物的耐受機(jī)制至今未完全明確。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，各類炎癥細(xì)胞因子，尤其是與炎癥發(fā)展及腫瘤微環(huán)境息息相關(guān)的趨化因子家族受到廣泛關(guān)注[17-18,23]。臨床上常通過輪換阿片類藥物防治嗎啡耐受，研究推測阿片受體調(diào)控可能是其中的關(guān)鍵機(jī)制，而相關(guān)機(jī)制的深入研究需要建立有針對性的動物模型[20]。

最常用的慢性癌性疼痛嗎啡耐受前期模型是大/小鼠骨癌痛模型，建模成功后進(jìn)一步建立嗎啡耐受模型，連續(xù)6～10d給予實驗鼠固定量嗎啡。給藥形式各異，可通過皮下注射，也可采用鞘內(nèi)導(dǎo)管輸注[20]。疼痛模型建立的驗證可應(yīng)用簡易的熱板和Von Frey試驗，通過機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化充分反映嗎啡耐受的存在，可表現(xiàn)為劑量–反應(yīng)曲線右移，也可被進(jìn)一步量化為最大鎮(zhèn)痛效率[21]。建立該動物模型需要較多的實驗動物分組，以驗證誘導(dǎo)嗎啡耐受和接受實驗用藥、安慰劑的不同結(jié)果[20]。在操作中，實驗者需留意疼痛狀態(tài)下動物對其他類型刺激的敏感性，以避免干擾行為學(xué)參數(shù)的讀取[22]。目前的慢性癌性疼痛嗎啡耐受模型模擬疼痛性狀的能力較為成熟，模擬嗎啡耐受狀態(tài)的建模精度不足，部分實驗傾向于使用三重對照組（生理鹽水、嗎啡、嗎啡加實驗藥物），將重點(diǎn)置于比對實驗藥物對嗎啡耐受的影響，而對嗎啡耐受現(xiàn)象缺少足夠標(biāo)準(zhǔn)的驗證，存在對照組建立不完善、疼痛閾值測量間隔不統(tǒng)一等問題[24]。

4 模型動物的選擇

疼痛對嚙齒動物的行為具有顯著影響，基礎(chǔ)研究中常用的動物模型是雄性大鼠[25]。大鼠體型適中，行為訓(xùn)練期短，易操作、模擬損傷是其優(yōu)勢，小鼠飼養(yǎng)成本低、品系豐富。近年來，受轉(zhuǎn)基因小鼠、化學(xué)遺傳等因素影響，小鼠的應(yīng)用也越來越多。狗等哺乳動物存在使用和飼養(yǎng)成本高等問題而極少使用。

研究發(fā)現(xiàn)，不足10%的小鼠研究使用遠(yuǎn)交系小鼠；而大鼠研究中，超過80%均使用遠(yuǎn)交系[26]。應(yīng)用較多的C57BL/6近交系小鼠表現(xiàn)出對熱刺激的高敏感性及對損傷引起的超敏反應(yīng)的快速恢復(fù)性。在慢性疼痛的相關(guān)研究中，選擇遠(yuǎn)交系小鼠或許能更好地模擬患者的慢性疼痛，具有“廣泛性表型”的特征。慢性疼痛與復(fù)雜的生活史息息相關(guān)，應(yīng)考慮這些因素對嚙齒動物模型產(chǎn)生的影響，使用更具有異質(zhì)性的動物模型。目前，大部分研究中的建模動物選擇2～3月齡的大、小鼠，較適宜于急性疼痛的研究。綜上，疼痛研究中選用遠(yuǎn)交系大/小鼠更具針對性，且應(yīng)納入月齡較大且不同性別的動物。

5 小結(jié)與展望

在急慢性疼痛的機(jī)制研究和藥物篩選中，使用可靠的動物模型具有重要意義。然而，許多臨床疼痛是目前的動物模型僅通過行為學(xué)變化無法模仿的，如幻肢痛、頭痛、脊髓損傷導(dǎo)致的疼痛等。有學(xué)者提出，皮層可塑性可作為新的測量重點(diǎn)，補(bǔ)充行為學(xué)檢測的不足[27]。隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，各類疼痛動物模型將進(jìn)一步優(yōu)化，強(qiáng)調(diào)活體動物實驗結(jié)合人體組織的體外研究，得以雙向驗證新的疼痛靶點(diǎn)可能是動物疼痛模型臨床轉(zhuǎn)化的重點(diǎn)。

[1] 中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會. 癌癥疼痛診療規(guī)范(2018版)[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2018, 23(10): 937–944.

[2] 王紋紋, 雷靜, 尤浩軍. 內(nèi)臟痛實驗動物模型的研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2022, 49(5): 858–866.

[3] 趙媛, 孔高茵, 周搏, 等. 脊髓IL-33在關(guān)節(jié)炎大鼠痛覺過敏中的表達(dá)[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2020, 30(1): 8–12.

[4] JENNIFER R, LUCIE S, IRINA V R. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents[J]. Front Mol Neurosci, 2017, 10: 284.

[5] CHAPLAN S, BACH F, POGREL J, et al. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J]. J Neurosci Methods, 1994, 53(1): 55–63.

[6] DIXON W. The up-and-down method for small samples[J]. Journal of the American Statistical Association, 1965, 60(312): 967–978.

[7] MIZOGUCHI H, FUKUMOTO K, SAKAMOTO G, et al. Maternal separation as a risk factor for aggravation of neuropathic pain in later life in mice[J]. Behav Brain Res, 2019, 359: 942–949.

[8] MURALIDHARAN A, SOTOCINAL S G, AUSTIN J S, et al. The influence of aging and duration of nerve injury on the antiallodynic efficacy of analgesics in laboratory mice[J]. Pain Rep, 2020, 5(3): e824.

[9] 呂繼鵬, 冷玉芳, 范俊, 等. 內(nèi)臟痛動物模型的制備和特點(diǎn)[J]. 中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 27(2): 133–139.

[10] 彭皓, 黃東. 嚙齒類動物疼痛評估方法的研究進(jìn)展[J]. 中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 20(7): 505–508.

[11] 張昆龍, 朱慧, 王正梅, 等. 動物痛行為學(xué)檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志, 2020, 36(2): 215–220.

[12] DE CIANTIS P D, YASHPAL K, HENRY J, et al. Characterization of a rat model of metastatic prostate cancer bone pain[J]. Pain Res, 2010, 3: 213–221.

[13] ZHU X, XU Y, SHEN Z, et al. Rostral anterior cingulate cortex-ventrolateral periaqueductal gray circuit underlies electroacupuncture to alleviate hyperalgesia but not anxiety-like behaviors in mice with spared nerve injury[J]. Front Neurosci, 2022, 15: 757628.

[14] SLIVICKI R A, IYER V, MALI S S, et al. Positive allosteric modulation of CB1cannabinoid receptor signaling enhances morphine antinociception and attenuates morphine tolerance without enhancing morphine- induced dependence or reward[J]. Front Mol Neurosci, 2020, 13: 54.

[15] 黃軍凱, 陳祁青, 趙繼榮, 等. 根性神經(jīng)痛動物模型的研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2022, 32(21): 52–56.

[16] 張春鵬, 周慶輝. 骨癌痛模型研究進(jìn)展[J]. 中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2018, 24(10): 774–777.

[17] JI H, JIN X, ZHANG Q, et al. A mouse model of cancer induced bone pain: From pain to movement[J]. Front Behav Neurosci, 2022, 16: 873750.

[18] 馬超, 陳靜, 劉丹丹, 等. 癌痛治療中嗎啡耐受機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 國際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志, 2022, 43(7): 757–761.

[19] CURRIE G L, DELANEY A, BENNETT M I, et al. Animal models of bone cancer pain: Systematic review and Meta-analyses[J]. Pain, 2013, 154(6): 917–926.

[20] MEDHURST S J，WALKER K, BOWES M, et al. A rat model of bone cancer pain[J]. Pain, 2002, 72(1-2): 3–11.

[21] 代倩倩, 李心怡, 夏桂陽, 等. 慢性疼痛動物模型研究進(jìn)展及在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(24): 5866–5876.

[22] CORDER G, TAWFIK V L, WANG D, et al. Loss of μ opioid receptor signaling in nociceptors, but not microglia, abrogates morphine tolerance without disrupting analgesia[J]. Nat Med, 2017, 23(2): 164–173.

[23] LUO X, WANG X, XIA Z, et al. CXCL12/CXCR4 axis: An emerging neuromodulator in pathological pain[J]. Rev Neurosci, 2016, 27(1): 83–92.

[24] FORSTENPOINTNER J, RUSCHEWEYH R, ATTAL N, et al. No pain, still gain (of function): The relation between sensory profiles and the presence or absence of self-reported pain in a large multicenter cohort of patients with neuropathy[J]. Pain, 2021, 162(3): 718–727.

[25] AVONA A, BURGOS-VEGA C, BURTON M D, et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models[J]. J Neurosci, 2019, 39(22): 4323–4331.

[26] SADLER K E, MOGIL J S, STUCKY C L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals[J]. Nat Rev Neurosci, 2022, 23(2): 70–85.

[27] ZHUO M. Cortical plasticity as a new endpoint measurement for chronic pain[J]. Mol Pain, 2011, 7: 54.

（2023–03–03）

（2023–09–08）

R739.9

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.029

浙江省基礎(chǔ)公益研究計劃項目（LY19H290001）；浙江省康復(fù)醫(yī)學(xué)會科研基金項目（ZKKY2023005）

龔黎燕，電子信箱：1413472557@qq.com