張俊平，蔣鳳英，張春玲，王瑞陽(yáng)，趙本進(jìn)，丁衛(wèi)星，楊惠萍，李春華*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

鴿Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus 1，PPMV-Ⅰ)病俗稱鴿瘟或鴿新城疫，是一種由禽Ⅰ型副黏病毒引起的、流行于鴿群的急性、熱性、高度接觸性傳染病，以腸炎、嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征，迄今為止，鴿新城疫仍然是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要病毒性傳染病之一[1-4]。Dortmans 等[5]認(rèn)為，PPMV-Ⅰ是適應(yīng)了宿主鴿的新城疫病毒(Newcastle disease viruse，NDV) 變異株。PPMV-Ⅰ與雞的NDV具有一定的同源性，也有一定的血清學(xué)交叉反應(yīng)，但PPMV-Ⅰ經(jīng)在鴿體內(nèi)傳代，已適應(yīng)鴿體內(nèi)寄生和增殖，使PPMV-Ⅰ與雞NDV 在抗原性上有了很大差異，因此在使用新城疫疫苗免疫鴿群后，出現(xiàn)抗體水平不高，保護(hù)率低，免疫期短，不能完全抵抗強(qiáng)毒的攻擊[6]。因此，分離、培育出免疫原性良好的毒株，研制出具有良好免疫原性的鴿Ⅰ型副黏病毒滅活疫苗，對(duì)預(yù)防該病至關(guān)重要[7]。本實(shí)驗(yàn)室在分離鑒定的基礎(chǔ)上研制了鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株)滅活疫苗，并對(duì)疫苗進(jìn)行了前期研究，現(xiàn)對(duì)該疫苗進(jìn)行不同保存條件、不同保存時(shí)間的物理性狀、安全性和免疫效力的測(cè)定，為鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1株)滅活疫苗的保存期提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)疫苗

鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株) 滅活疫苗的批號(hào)分別為20200801、20200802 和20200803，均由上海佳牧生物制品有限公司制備。按照《鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株) 滅活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》制造和檢驗(yàn)，符合要求。

1.2 試驗(yàn)儀器

TDZ4-WS 低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DVNXLVCJC 黏度計(jì)購(gòu)自美國(guó)博勒飛公司；DNP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BPC-250F 生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPF 雞隔離器購(gòu)自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(fluid thioglycollate medium，TG)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(tryplic soy broth，TSB)、酪胨瓊脂培養(yǎng)基(casein peptone agar medium，GA)均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

30 日齡非免疫銀王幼鴿(HI 抗體水平≤2log2)由上海申裕鴿業(yè)養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.5 攻毒毒株

鴿Ⅰ型副黏病毒強(qiáng)毒株(川沙株E5 代)由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存，病毒含量為107.5ELD50/0.1 mL。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

將鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株) 滅活疫苗樣本分別保存在冷藏(2～8 ℃)、室溫(25 ℃左右)溫度條件下，按以下時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)物理性狀、安全性和免疫效力。

冷藏保存，分別在保存3、6、9、12、15個(gè)月后抽取樣本進(jìn)行檢測(cè)；室溫保存，分別在保存1、2、3、6、9 個(gè)月后抽取樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 疫苗物理性狀檢驗(yàn)

按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》三部[8]中常規(guī)油乳劑滅活疫苗檢驗(yàn)方法進(jìn)行。

2.3 疫苗安全性檢驗(yàn)

給10 羽試驗(yàn)幼鴿分別接種在不同溫度下保存不同時(shí)間的疫苗，每羽肌內(nèi)注射疫苗1.0 mL，觀察14 d，記錄試驗(yàn)鴿的臨床反應(yīng)情況。

2.4 疫苗免疫效力檢驗(yàn)

給10 羽試驗(yàn)幼鴿分別接種下不同溫度下保存不同時(shí)間的疫苗，每羽肌內(nèi)注射疫苗50 μL。接種后28 d，每羽采血，分離血清，進(jìn)行HI 抗體效價(jià)測(cè)定，統(tǒng)計(jì)抗體效價(jià)的幾何平均值。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株)滅活疫苗冷藏保存試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室試制的3 批(生產(chǎn)批號(hào)分別為：20200801、20200802、20200803) 鴿Ⅰ型 副黏病毒(S-1 株)滅活疫苗冷藏保存12 個(gè)月，疫苗的物理性狀、安全性和免疫效力檢驗(yàn)均合格；保存15 個(gè)月，生產(chǎn)批號(hào)為20200802 的疫苗免疫效力檢驗(yàn)不合格。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株) 滅活疫苗冷藏保存期為12 個(gè)月。具體試驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.2 鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株)滅活疫苗室溫保存試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室試制的3 批鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1株)滅活疫苗室溫保存6 個(gè)月，疫苗的物理性狀、安全性和免疫效力檢驗(yàn)均合格，保存9 個(gè)月的生產(chǎn)批號(hào)為20200802 的疫苗經(jīng)物理性狀和免疫效力檢驗(yàn)均不合格，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株) 滅活疫苗室溫保存期為6 個(gè)月。具體試驗(yàn)結(jié)果見表2。

4 分析與討論

鴿Ⅰ型副黏病毒病是危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要疾病之一，迄今尚無(wú)有效治療藥物，接種疫苗是預(yù)防該病的關(guān)鍵。盡管鴿副黏病毒與雞新城疫病毒為同一屬，但兩種病毒在抗原性上有一定差異，在致病性上也有一定區(qū)別，許多報(bào)道表明，用現(xiàn)有的雞新城疫疫苗接種鴿子雖具有一定的效果，但保護(hù)率并不理想[9-10]。因此，研制一種安全有效的鴿Ⅰ型副黏病毒滅活疫苗迫在眉睫。疫苗研制過(guò)程中疫苗保存期的確定是必不可少的環(huán)節(jié)。

本研究是在鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株) 滅活疫苗前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行的不同保存條件、不同保存時(shí)間的鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1株) 滅活疫苗的物理性狀、安全性和免疫效力檢測(cè)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定，疫苗冷藏(2～8 ℃)可保存12 個(gè)月，室溫(25 ℃左右)可保存6 個(gè)月?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)及疫苗運(yùn)輸過(guò)程中存在很多影響因素，并且目前絕大部分生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、使用單位都具備冷藏(2～8 ℃)保存條件。因此，將鴿Ⅰ型副黏病毒(S-1 株)滅活疫苗保存期定為：冷藏(2～8 ℃)保存，保存期為12 個(gè)月。