姜煒彥，張碧掎

(1.深圳市寵物協(xié)會(huì)，廣東 深圳 518000；2.澳門愛(ài)加倍動(dòng)物醫(yī)院，廣東 珠海 524000)

生殖激素在豬的繁殖中起著重要作用。精液中的激素水平對(duì)雄性動(dòng)物的精子生成能力、精液品質(zhì)好壞、精子的受精能力以及抗凍能力等有重要的影響，其中有緊密聯(lián)系的是生殖激素[1]。此外，在精液穿越雌性動(dòng)物生殖道的過(guò)程中，雌激素可能與精子相互作用，如生精上皮缺乏雌激素可導(dǎo)致精子細(xì)胞分化產(chǎn)生障礙[2]，從而影響精子的運(yùn)動(dòng)、獲能、受精的各項(xiàng)功能。其中黃體酮對(duì)子宮內(nèi)膜有著顯著的形態(tài)學(xué)影響，是一種維持妊娠的必需激素[3]。而雌二醇對(duì)精子的激活有著舉足輕重的作用，可以通過(guò)升高精子胞漿內(nèi)的Ca2+濃度維持精子的功能[4]。朱首倫[5]通過(guò)研究黃體酮注射液對(duì)人類精子的作用效果，發(fā)現(xiàn)精子膜上存在著一個(gè)孕酮門，可以激起Ca2+內(nèi)流，從而增強(qiáng)精子的活力。生殖激素在精液體外保存中扮演著至關(guān)重要的角色，給精液冷凍保存技術(shù)的研究帶來(lái)了新的突破點(diǎn)。本試驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用雌二醇和黃體酮這兩種生殖激素，研究其在豬精液冷凍保存中產(chǎn)生的影響效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 精液來(lái)源

新鮮公豬精液由湛江市遂溪縣建新鎮(zhèn)高豐種豬場(chǎng)提供，約一周對(duì)種公豬采精一次，用于試驗(yàn)的精子活力不低于70%。

1.1.2 主要試劑與藥物

葡萄糖、一水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉、丙三醇購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司，果糖購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司，硫酸阿米卡星購(gòu)自齊魯制藥有限公司，苯甲酸雌二醇、黃體酮購(gòu)自寧波第二激素廠，三羥甲基氨基甲烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氨基-鈉-十二烷硫酸酯購(gòu)自日本，卵黃取自于雞蛋，液氮購(gòu)自湛江市制氧廠。

1.1.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司，數(shù)顯恒溫電熱板購(gòu)自常州市金壇區(qū)白塔新寶儀器廠，電子分析天平購(gòu)自常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，Nanopure Life Science 超純水器購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，立式壓力蒸汽滅菌鍋購(gòu)自上海博迅有限公司，雙目生物顯微鏡購(gòu)自南京江南永新光學(xué)有限公司，數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自湖南赫西儀器裝備有限公司，離心管(1.5、15、50 mL)、一次性移液槍槍頭、移液槍(5、10、50、200、1 000 μL 均購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司，濾紙，蛋清分離器，冰箱。

1.2 方法

1.2.1 精液采集

本試驗(yàn)以手握法對(duì)種公豬進(jìn)行采精操作。為防止溫差過(guò)大造成精子死亡，在精液采集前35～37 ℃預(yù)熱采精杯，采精杯上覆蓋濾紙，濾紙微孔約100 μm，精子可通過(guò)并可濾去精液中的膠體物質(zhì)。采精時(shí)只收集中間濃厚乳白色的精液，棄去前面較稀的精清，以四層以上的紗布過(guò)濾掉膠粒物質(zhì)，但應(yīng)防止紗布中的棉屑脫落，以免破壞精液品質(zhì)[6]。檢查前需將精液放在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱。精液的品質(zhì)檢查包括外觀、氣味、活力三方面。然后用基礎(chǔ)稀釋液將精液稀釋至所需濃度，分裝于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 稀釋液配制

稀釋液Ⅰ的配制：精確稱取0.4 g 葡萄糖、1.59 g 一水合檸檬酸、2.9 g 三羥甲基氨基甲烷于燒杯中，加入200 μL 硫酸阿米卡星，然后加入20 mL 超純水進(jìn)行溶解。將卵黃與蛋清分離，用濾紙將卵黃上的蛋清吸干后，用移液槍吸取卵黃加入溶液中，其比例為基礎(chǔ)稀釋液配方的20%，最后用超純水定容至100 mL，輕輕混勻，避免產(chǎn)生過(guò)多泡沫。分裝后，3 000 r/min 離心20 min，留上層清液，5 ℃密封保存。

稀釋液Ⅱ的配制：取47 mL 稀釋液Ⅰ，加入3 mL 丙三醇和0.3%的氨基-鈉-十二烷硫酸酯，充分搖勻后，5 ℃密封保存。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與精液保存

試驗(yàn)共分三個(gè)組，分別為雌二醇組、黃體酮組和空白對(duì)照組，其中雌二醇組和黃體組各設(shè)三個(gè)重復(fù)。雌二醇組三個(gè)重復(fù)所用的稀釋液Ⅰ中分別添加5、10、20 μg/mL 的雌二醇，黃體酮組三個(gè)重復(fù)所用的稀釋Ⅰ中分別加入50、100、200 μg/mL 的黃體酮，空白對(duì)照組所用稀釋液中不添加任何生殖激素。

將稀釋液Ⅰ于30 ℃水浴鍋中預(yù)熱。將合格精液分裝于離心管，2 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，將下層精子集裝在廣口瓶中，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定精子濃度。用稀釋液Ⅰ將精子稀釋到2×108個(gè)/mL 左右，做好標(biāo)簽(命名為稀釋液Ⅰ-Ⅰ)，封口，5 ℃保存。15 min后將稀釋液Ⅰ-Ⅰ與稀釋液Ⅱ以1∶1 混合，5 ℃放置2 h，分裝入精液細(xì)管。準(zhǔn)備一個(gè)裝有液氮的泡沫箱，上漂浮一個(gè)泡沫板，將裝有精液的精液細(xì)管置于泡沫板上約15 min 后放入液氮，待凍后，迅速放入液氮罐中保存。

1.2.4 精液品質(zhì)檢測(cè)

● 精子活率

精子活率是指精液中活精子的比例，若精子活率低下，則無(wú)需進(jìn)行試驗(yàn)?；盥实臋z測(cè)可使用目測(cè)法，即觀察3 個(gè)視野內(nèi)活精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比，取平均值。

● 精子活力

精子活力是檢測(cè)精液品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。精子的運(yùn)動(dòng)狀況一般分為5 種：①快速直線運(yùn)動(dòng)，活力為100%，標(biāo)記為“+++”；②較為緩慢直線運(yùn)動(dòng)，活力為75%，標(biāo)記為“++”；③緩慢運(yùn)動(dòng)，活力為50%，標(biāo)記為“+”；④原地轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，活力為25%，標(biāo)記為“±”；⑤基本不動(dòng)或精子死亡，活力為0，標(biāo)記為“-”。精子對(duì)溫度十分敏感，檢查精子活力時(shí)，需要將精液細(xì)管同裝有液氮的廣口瓶一同從液氮罐中取出，放進(jìn)裝有液氮的泡沫箱中，以免造成溫差過(guò)大影響后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果。將精液細(xì)管放入39.5 ℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱3 s，取出，用剪刀先將下端剪開(kāi)，再剪開(kāi)上端，使細(xì)管中的精液流入水浴鍋中漂浮板上的1 mL 離心管，備用觀察。載破片和蓋破片預(yù)熱至39.5 ℃。吸取10 μL 待檢精液在載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察精子活力，約觀察3 個(gè)視野內(nèi)的精子活力，記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果取平均值。

● 精子細(xì)胞膜完整性

檢測(cè)精子細(xì)胞膜完整性常見(jiàn)的方法有常規(guī)染色法、熒光染色法以及低滲腫脹試驗(yàn)[7]。其中低滲腫脹試驗(yàn)因成本低廉、操作簡(jiǎn)單，廣為應(yīng)用。該方法可直觀反映精子細(xì)胞膜的功能狀態(tài)[8]。

配制HOST 低滲溶液。將裝在1 mL 離心管中的精液2 000 r/min 離心5 min，去上清液，加入90 μL 的HOST 低滲溶液，反復(fù)吹吸均勻，靜置10 min，取10 μL 待檢液于顯微鏡下觀察。隨機(jī)檢測(cè)3～5 個(gè)視野內(nèi)精子尾部腫脹情況，尾部卷曲表示細(xì)胞膜完整，視野內(nèi)精子數(shù)必須超過(guò)200 個(gè)，記錄數(shù)據(jù)，取平均值。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 雌二醇對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響

表1 顯示，稀釋液中添加不同濃度的雌二醇對(duì)豬精液冷凍保存后的精子活率和活力的維持均有有益的影響，與對(duì)照組精液相比差異顯著(P＜0.05)，其中雌二醇的最適濃度是10 μg/mL。但是雌二醇對(duì)豬精子細(xì)胞膜完整性的保護(hù)效果不顯著(P＞0.05)。

2.2 黃體酮對(duì)豬精液冷凍保存效果的影響

表2 顯示，稀釋液中添加不同濃度的黃體酮對(duì)豬精液冷凍保存后的精子活率和活力的維持均有有益的影響，與對(duì)照組精液相比差異顯著(P＜0.05)，其中黃體酮的最適濃度是200 μg/mL。但是黃體酮對(duì)豬精子細(xì)胞膜完整性的保護(hù)效果不顯著(P＞0.05)。

2.3 兩種激素對(duì)豬精液冷凍保存效果的對(duì)比

由圖1 可知，稀釋液中添加10 μg/mL 雌二醇或200 μg/mL 黃體酮均有利于維持豬精液冷凍保存后的精子活率，與對(duì)照組精液相比差異顯著(P＜0.05)，但兩種激素對(duì)精液冷凍后精子活力的保存效果差異不顯著。

由圖2 可知，稀釋液中添加10 μg/mL 雌二醇或200 μg/mL 黃體酮均有利于維持豬精液冷凍保存的精子活力，與對(duì)照組精液相比差異顯著(P＜0.05)，但兩種激素對(duì)精液冷凍后精子活力的保存效果差異不顯著。

3 討論

3.1 雌二醇保存效果的分析

精子在凍融過(guò)程中會(huì)形成冰晶，受到一定的損害，導(dǎo)致精子的超微結(jié)構(gòu)改變和新陳代謝紊亂。而雌激素可以增加精子細(xì)胞膜和線粒體膜的穩(wěn)定性，促進(jìn)精子細(xì)胞的分裂、增殖以及分化，減少細(xì)胞凋亡。研究證明，稀釋液中添加一定濃度的雌二醇可減少冷凍保存中精子細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，提高其運(yùn)動(dòng)能力和卵膜穿透力，使精子活力增強(qiáng)，對(duì)凍融后精子的各項(xiàng)功能恢復(fù)有有益作用。雌二醇還能作用于精子膜上的雌激素受體，提高精子內(nèi)Ca2+的濃度，激活腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)通路。在本試驗(yàn)中，稀釋液中加入雌二醇可明顯降低冷凍保存對(duì)精子質(zhì)量的損傷，證明雌二醇對(duì)凍融后精子激活、保護(hù)和功能的恢復(fù)有利。

3.2 黃體酮保存效果的分析

黃體酮是一種由卵巢黃體分泌的天然孕激素，能促進(jìn)精子獲能和誘導(dǎo)頂體反應(yīng)。有研究表明，精子膜上存在著一個(gè)由孕酮門控制的Ca2+通道，添加黃體酮能刺激Ca2+內(nèi)流，使精子內(nèi)Ca2+濃度增加。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，在精子各生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可以增強(qiáng)精子運(yùn)動(dòng)。精子尾部最敏感，凍融會(huì)導(dǎo)致鞭毛的軸絲結(jié)構(gòu)受到損傷，從而影響精子活力。精子尾部的Ca2+通道發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Ca2+可以調(diào)節(jié)精子鞭毛運(yùn)動(dòng)。鞭毛中的Ca2+可以影響動(dòng)力蛋白臂的滑動(dòng)，使鞭毛不斷地進(jìn)行擺動(dòng)運(yùn)動(dòng)。因此，黃體酮有助于精子凍融后功能的恢復(fù)。

4 結(jié)論

綜上所述，稀釋液中加入一定濃度的雌二醇或黃體酮對(duì)對(duì)冷凍保存精液中的精子具有一定的保護(hù)效果，有益于豬精液凍融后精子活率和活力的維持，但對(duì)豬精子細(xì)胞膜完整性的保護(hù)效果不顯著。雌二醇和黃體酮的最適濃度分別為10 μg/mL 和200 μg/mL，這為臨床上通過(guò)運(yùn)用生殖激素改善精子質(zhì)量來(lái)提高人工授精率提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。