韓 倩,蔣翠萍,李玥瑤,高程海,夏家朗,李 蜜,劉永宏,米順利,易湘茜*
(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200;2.廣西海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530200)
1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞由廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。SD 大鼠72 只,健康雄性,體質(zhì)量(180±20)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)2019-0004,飼養(yǎng)溫度為25~26 ℃,期間自由進(jìn)食進(jìn)水。
1.2 藥物與試劑 奇異海蟑螂于2019 年7 月采集于廣西欽州犀牛鎮(zhèn)漁港,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院劉昕明副研究員鑒定為奇異海蟑螂科動(dòng)物奇異海蟑螂(Ligia exotica);水合氯醛(常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,批號(hào)20170715);硫化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào)20200813);超氧化物歧化酶(SOD,貨號(hào)RA20004)、丙二醛(MDA,貨號(hào)RA20003)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β,貨號(hào)RA20020)、前列腺素E2(PGE2,貨號(hào)RA20013)試劑盒均由武漢貝茵萊生物科技有限公司提供;4%多聚甲醛(蘭杰柯科技有限公司,批號(hào)20200815);扶他林(中美天津史克制藥有限公司,貨號(hào)UN8R);DMEM 高糖培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司,批號(hào)8120493);胎牛血清(蘇州雙洳生物科技有限公司,貨號(hào)S711-001S);一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào)A012-1-2);脂多糖[LPS,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司,貨號(hào)L2880];磷酸鹽緩沖液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號(hào)20201214);胰蛋白酶(賽默飛世爾科技公司,批號(hào)20201216);噻唑藍(lán)(MTT,上海源葉生物科技有限公司,貨號(hào)309E054);二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)D8370);乙醇、乙酸乙酯、正丁醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號(hào)分別為20201019、20190812、20201031)。
1.3 儀器 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer公司,型號(hào)EnVisonXcite);高速冷凍離心機(jī)(南寧愛(ài)普儀器設(shè)備維修有限公司,型號(hào)Eppendorf 5810R);分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,型號(hào)ml2047);高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司,型號(hào)KZ-III-F);生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司,型號(hào)HR-1500-ⅡB2);臺(tái)式高速離心機(jī)[日立科學(xué)儀器(北京)有限公司,型號(hào)CT15E];倒置顯微鏡(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司,型號(hào)ICX4I);恒溫水浴鍋(常州金壇良友儀器有限公司,型號(hào)LVF6);多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(瑞士TECAN 公司,型號(hào)Infinate 2000pro);立式恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠(chéng)分析儀器公司,型號(hào)ZWYR-2102);超凈工作臺(tái)(上海智誠(chéng)分析儀器公司,型號(hào)ZHJH-1109C);筋傷造模工具(自制)。
2.1 奇異海蟑螂提取物的制備 稱取奇異海蟑螂樣品2.5 kg,搗碎后用85%乙醇冷浸提取,重復(fù)3 次,每次冷浸7 d,將提取液合并、濃縮后得到奇異海蟑螂乙醇提取物289 g。取乙醇提取物適量,依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取,濃縮萃取液后分別得到乙酸乙酯提取物10 g、正丁醇提取物60 g。
2.2 體外抗炎活性測(cè)定
2.2.1 藥液的配置 取奇異海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物各適量,分別加入適量生物級(jí)二甲基亞砜(DMSO),溶解后用DMEM 高糖培養(yǎng)基將上述藥物稀釋至濃度為100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml 的藥液,于4 ℃密封保存,用于體外抗炎活性檢測(cè)。
2.2.2 RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng) 將預(yù)先置于-80 ℃中凍存的RAW264.7細(xì)胞解凍,并迅速轉(zhuǎn)移至離心管,在1 000 r/min 下離心3 min,棄去上清液。用1% DMEM高糖培養(yǎng)基約5~10 ml 將細(xì)胞混合均勻,在37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,備用。
在最佳反應(yīng)條件下:總反應(yīng)時(shí)間為1.5 h,pH為3,間隔投加時(shí)間為20 min,采取1.5%,1.2%,0.9%的加藥量進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
2.2.3 細(xì)胞毒活性的測(cè)定(MTT 法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,接種于96 孔板中,每孔100 μl,培養(yǎng)12 h 后棄去上清液,換入含藥培養(yǎng)液100 μl,奇異海蟑螂乙醇提取物組(J 組)、奇異海蟑螂乙酸乙酯提取物組(E 組)、奇異海蟑螂正丁醇提取物組(B 組)分別設(shè)置3 個(gè)濃度(100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml),同時(shí)設(shè)置空白組作對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去上清液,每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清液,每孔加入DMSO溶液150 μl,震蕩10 min后,在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(給藥組A490值/空白組A490值)×100%。
2.2.4 NO 含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,并接種于96孔板中,每孔100 μl。培養(yǎng)12 h 后棄去上清液,加入經(jīng)測(cè)試無(wú)細(xì)胞毒活性的藥液100 μl,預(yù)處理1 h 后加入濃度為1 μg/ml 的LPS 繼續(xù)培養(yǎng)24 h,誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型的建立。后吸取細(xì)胞上清液,使用試劑盒測(cè)定不同奇異海蟑螂提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞釋放NO的含量。
2.3 體內(nèi)改善筋傷效果評(píng)價(jià)
2.3.1 動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,按體質(zhì)量隨機(jī)分為9組:空白組、模型組、扶他林組、奇異海蟑螂乙醇提取物高劑量組(JH組)、奇異海蟑螂乙醇提取物低劑量組(JL 組)、奇異海蟑螂乙酸乙酯提取物高劑量組(EH 組)、奇異海蟑螂乙酸乙酯提取物低劑量組(EL組)、奇異海蟑螂正丁醇提取物高劑量組(BH 組)和奇異海蟑螂正丁醇提取物低劑量組(BL組),每組8只。
2.3.2 筋傷大鼠模型的建立與給藥 參照文獻(xiàn)[10]方法建立筋傷大鼠模型。用剃毛器脫去大鼠的右后肢腿毛,再用8%硫化鈉脫去細(xì)毛,麻醉后將大鼠固定在自制擊打器上,將200 g 砝碼從塑料管(直徑2 cm、高50 cm)頂部垂直自由落體沖擊大鼠大腿外側(cè)肌肉豐厚處,連續(xù)擊打3 次,擊打面積為2 cm2。當(dāng)大鼠的右后肢肌肉出現(xiàn)腫脹,肌肉表面可見(jiàn)紫暗色,大鼠明顯跛行,皮膚完整無(wú)破損且無(wú)骨折則視為成功建立筋傷大鼠模型。造模成功24 h 后開(kāi)始給藥,空白組與模型組分別每天涂抹生理鹽水,扶他林組涂抹陽(yáng)性藥物扶他林(劑量為2 g/kg),其他給藥組分別涂抹對(duì)應(yīng)的奇異海蟑螂提取物,高劑量均為2 g/kg,低劑量均為1 g/kg。每天1次,連續(xù)給藥5 d。
2.3.3 取材 給藥5 d 后,禁食禁水12 h,將各組大鼠用10%水合氯醛(劑量為4 ml/kg)麻醉,腹主動(dòng)脈取血5~10 ml 于肝素抗凝真空采血管中,用于檢測(cè)血液中的纖維蛋白原含量、血漿黏度和全血黏液。隨后以打擊部位為中心,沿?fù)p傷處切取肌肉組織。用生理鹽水沖洗干凈,分裝在凍存管中并標(biāo)記,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3.4 指標(biāo)測(cè)定 使用試劑盒對(duì)血液進(jìn)行全血黏度、血漿黏度、纖維蛋白原等血液流變學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)[11]。取肌肉組織用PBS 緩沖液(1∶9)制成勻漿,在4 ℃下3 500 r/min 低溫離心20 min,收集上清液備用,檢測(cè)損傷處組織的PGE2、IL-1β、MDA、SOD 等指標(biāo)[12-13],操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。此外,另一部分肌肉組織用于HE染色[14],觀察組織形態(tài)。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為有顯著性差異。
3.1 奇異海蟑螂不同提取物的體外抗炎活性分析
3.1.1 奇異海蟑螂不同提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 當(dāng)濃度為200 μg/ml 和400 μg/ml 時(shí),奇異海蟑螂乙醇提取物或乙酸乙酯提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞有不同程度的細(xì)胞毒性。當(dāng)濃度為100 μg/ml 時(shí),與空白組相比,奇異海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率無(wú)明顯抑制作用(P>0.05),由此可見(jiàn),100 μg/ml 的奇異海蟑螂不同提取物均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性,均未對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力造成影響,該藥物濃度可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 奇異海蟑螂提取物不同濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響(%,)
表1 奇異海蟑螂提取物不同濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響(%,)
注:與空白組比較,①P<0.05
組 別空白組J組E組B組n6 6 6 6不同濃度的細(xì)胞存活率100 μg/ml 100.00±4.09 97.75±4.69 99.68±7.35 156.30±8.60 200 μg/ml 100.00±4.09 84.04±6.32①91.57±1.89 156.00±18.01 400 μg/ml 100.00±4.09 78.71±6.48①74.40±5.32①162.2±11.24
3.1.2 奇異海蟑螂不同提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO 的影響 與空白組相比,經(jīng)過(guò)LPS 誘導(dǎo)的模型組RAW264.7細(xì)胞,其釋放NO的含量顯著增加(P<0.01)。相較于模型組,給予濃度為100 μg/ml的奇異海蟑螂乙醇提取物、奇異海蟑螂乙酸乙酯提取物和奇異海蟑螂正丁醇提取物均可顯著降低RAW264.7細(xì)胞釋放NO 的含量(P<0.01),表明奇異海蟑螂乙醇、乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有一定的體外抗炎活性,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 奇異海蟑螂不同提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響(μmol/L,,n=6)
表2 奇異海蟑螂不同提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響(μmol/L,,n=6)
注:與空白組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.01
images/BZ_65_275_1846_516_1940.pngNO含量空白組42.20±3.05模型組52.79±2.85①J組40.93±3.40②E組36.94±4.81②B組36.90±7.53②
3.2 奇異海蟑螂不同提取物體內(nèi)改善筋傷模型大鼠效果評(píng)價(jià)
3.2.1 各組大鼠受損組織中MDA和SOD含量比較 與空白組相比,模型組大鼠肌肉組織中MDA 含量顯著升高(P<0.01),SOD 含量顯著降低(P<0.01)。相較于模型組,給予扶他林、奇異海蟑螂高劑量的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均能顯著降低組織中的MDA含量(P<0.05或P<0.01),同時(shí)顯著增加肌肉組織中的SOD含量(P<0.05或P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠受損組織中MDA和SOD含量比較(nmol/L,)
表3 各組大鼠受損組織中MDA和SOD含量比較(nmol/L,)
注:與空白組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05,③P<0.01
組 別空白組模型組扶他林組JH組JL組EH組EL組BH組BL組n8 8 8 8 8 8 8 8 8 MDA 912.99±9.35 1 344.40±58.71①1 178.69±51.62②1 121.45±37.94③1 224.66±58.35 1 177.78±50.61②1 283.01±28.41 1 165.55±28.80②1 334.97±80.30 SOD 675.17±23.83 585.62±39.38①646.89±25.66③672.57±36.59③601.11±22.95 654.46±17.55②613.95±34.78 676.93±26.93③609.38±33.51
3.2.2 各組大鼠受損組織中PGE2和1L-1β 含量比較 與空白組相比,模型組大鼠肌肉組織中PGE2和1L-1β 含量均顯著升高(P<0.01)。相較于模型組,給予扶他林、奇異海蟑螂高劑量的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均能顯著降低組織中的PGE2和1L-1β 含量(P<0.05 或P<0.01)。此外,低劑量的奇異海蟑螂乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物也能分別降低組織中的PGE2和1L-1β 含量(P<0.05 或P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 各組大鼠受損組織中PGE2和1L-1β含量比較(pg/ml,)
注:與空白組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05,③P<0.01
組 別空白組模型組扶他林組JH組JL組EH組EL組BH組BL組n8 8 8 8 8 8 8 8 8 PGE2 492.47±31.34 584.20±11.75①509.13±12.83③528.32±25.53③564.04±24.62 513.28±17.35③507.27±21.03③511.68±21.00③549.26±24.67 1L-1β 152.16±10.89 179.87±5.03①162.86±3.77③160.95±6.61②172.31±14.81 167.07±3.70②170.97±14.92 164.56±5.53②165.26±4.95②
3.2.3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較 與空白組對(duì)比,模型組大鼠的全血高切、中切、低切黏度,血漿黏度和纖維蛋白原含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,扶他林組和奇異海蟑螂不同提取物的高、低劑量組的全血低切黏度、血漿黏度和纖維蛋白原含量均顯著降低(P<0.05 或P<0.01);除奇異海蟑螂乙醇提取物低劑量組外,扶他林組和奇異海蟑螂不同提取物組的全血高切黏度和全血中切黏度亦顯著降低(P<0.05或P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較()
表5 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較()
注:與空白組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05,③P<0.01
組 別空白組模型組扶他林組JH組JL組EH組EL組BH組BL組n8 8 8 8 8 8 8 8 8全血高切黏度(mPa.s)4.84±0.23 5.46±0.60①4.91±0.16③4.96±0.25③5.14±0.32 4.96±0.13③4.91±0.20③4.86±0.18③4.98±0.26③全血中切黏度(mPa.s)6.93±0.36 7.64±0.32①7.05±0.28③7.28±0.30②7.57±0.32 6.99±0.24③7.31±0.17②7.13±0.44③7.13±0.09③全血低切黏度(mPa.s)33.45±1.63 37.90±0.73①34.20±1.14③34.13±1.01③34.74±1.27③35.00±1.39③35.19±0.86③34.99±0.98③36.53±0.96②血漿黏度(mPa.s)1.13±0.10 1.48±0.19①1.18±0.16③1.19±0.23③1.18±0.17③1.21±0.19③1.24±0.11②1.20±0.14③1.26±0.20②纖維蛋白原含量(g/L)2.39±0.29 3.01±0.34①2.46±0.34③2.50±0.26③2.51±0.34③2.54±0.35③2.64±0.30②2.53±0.33③2.58±0.24②
3.2.4 各組大鼠肌肉組織病理學(xué)形態(tài) 空白組大鼠肌肉組織形態(tài)正常,肌細(xì)胞和肌纖維排列整齊有序,無(wú)變性、無(wú)壞死、無(wú)充血、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。模型組肌纖維出現(xiàn)明顯斷裂,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并出現(xiàn)大量充血現(xiàn)象等。與模型組對(duì)比,扶他林組的充血現(xiàn)象消失,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),斷裂的纖維間距縮短。奇異海蟑螂乙醇提取物高劑量(JH)組無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),新肌纖維開(kāi)始生成;乙酸乙酯提取物高劑量(EH)組可見(jiàn)大量正常肌肉組織纖維,僅有較少炎性細(xì)胞;正丁醇提取物高劑量(BH)組無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肌纖維有輕微的斷裂。而奇異海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物的低劑量組均仍有出血現(xiàn)象,結(jié)果表明高劑量的奇異海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)筋傷模型大鼠的肌肉組織均有不同程度的改善作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 各組大鼠肌肉組織病理切片(×40)
筋傷通常會(huì)伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生[15-16],RAW264.7 巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一種重要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞,在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[17]。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,能刺激RAW264.7 細(xì)胞釋放炎癥因子,引發(fā)炎癥反應(yīng)及導(dǎo)致炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生[18-19]。NO 是參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的一種重要介質(zhì),廣泛存在于各種生物體內(nèi),當(dāng)生物體內(nèi)NO 濃度過(guò)高時(shí)可導(dǎo)致局部組織損傷,從而加重炎癥反應(yīng)[20]。本研究通過(guò)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞構(gòu)建體外細(xì)胞炎癥模型,結(jié)果顯示,與模型組比較,奇異海蟑螂乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物均能顯著抑制NO 的生成,表現(xiàn)出顯著的體外抗炎活性,為進(jìn)一步指導(dǎo)奇異海蟑螂提取物治療筋傷提供了藥理依據(jù)。
采用重物自由落體擊打組織造成損傷,其所致病理表現(xiàn)與臨床筋傷相似,因而被廣泛用于研究藥物抗炎作用及藥物對(duì)筋傷的治療效果[21]。筋傷主要病理基礎(chǔ)為創(chuàng)傷性無(wú)菌性炎癥,會(huì)同時(shí)伴隨著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、局部軟組織損傷、肌纖維撕裂等癥狀,進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致諸多病理變化的出現(xiàn),如氧化應(yīng)激、局部炎癥和組織修復(fù)等[22-23],故本研究通過(guò)氧化應(yīng)激、炎癥因子、血液流變學(xué)及病理切片等多方面探究奇異海蟑螂提取物對(duì)筋傷模型大鼠的體內(nèi)治療效果。MDA 和SOD 是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志物,能直觀地反映氧化應(yīng)激程度。MDA 含量能夠反映組織中的自由基含量和細(xì)胞損傷程度[24],SOD活力可間接反映機(jī)體清除自由基的能力[25]。此外,當(dāng)機(jī)體受到損傷會(huì)引起局部炎癥反應(yīng),釋放一系列炎癥因子,PGE2和IL-1β 均為重要的炎癥介質(zhì),是判斷炎癥是否得到緩解的重要指標(biāo)[26-27]。本研究結(jié)果顯示,相較于低劑量組,高劑量組的奇異海蟑螂乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物能夠更為顯著地降低組織中的MDA 含量,增加組織中的SOD 含量,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平,同時(shí)降低組織中的PGE2和1L-1β 的含量,緩解炎癥反應(yīng),進(jìn)而達(dá)到改善模型大鼠的筋傷效果。
“外治內(nèi)應(yīng)”是外敷藥物治療筋傷的療效評(píng)價(jià)之一,血液流變學(xué)[28]及病理切片[29]能通過(guò)藥物對(duì)血液微循環(huán)和損傷組織的改善作用,更為直觀地證實(shí)藥物治療筋傷的效果。本研究結(jié)果顯示,相較于低劑量,高劑量的奇異海蟑螂提取物均能更為顯著地降低筋傷模型大鼠的全血(低/中/高切)黏度和纖維原蛋白含量,改善局部損傷組織的微循環(huán),調(diào)節(jié)血液黏度。
綜上所述,奇異海蟑螂提取物具有顯著的體外抗炎活性,其中高劑量組的奇異海蟑螂提取物能更好地改善筋傷模型大鼠的治療效果,其作用機(jī)制可能是通過(guò)增加SOD 含量和降低MDA 含量,改善組織的氧化應(yīng)激反應(yīng),降低PGE2和1L-1β 含量,改善組織中的炎癥因子,降低全血(高/中/低切)黏度、血漿黏度和纖維蛋白原含量,從而改善血液流變學(xué)等途徑起效。