黃 偉，黃熙榮，葉 金，伍先紹，劉珊珊，孫秀蘭，丁 麗，肖理文

（1.江蘇省糧油質(zhì)量監(jiān)測中心，南京 210000；2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100035；3.廣西壯族自治區(qū)糧油質(zhì)量檢驗(yàn)中心，南寧 537199；4.江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；5.南京微測生物科技有限公司，南京 210031）

近年來，隨著我國工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，糧食種植過程中大量農(nóng)藥、化肥的使用以及糧食在后續(xù)的生產(chǎn)加工過程中，都直接或者間接地存在重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)。目前，糧食中的重金屬鉛的污染主要存在于玉米、小麥及水稻中，長期使用被鉛污染的糧食，會造成人體內(nèi)重金屬鉛的富集，對神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼造血機(jī)能、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均有危害，特別是大腦處于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育敏感期的兒童，很容易造成發(fā)育遲緩等不良后果[1-2]。因此，對重金屬鉛含量進(jìn)行測定顯得尤為重要。

目前，重金屬鉛的檢測方法有原子熒光光譜法（AFS）、原子吸收光譜法（AAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）、高效液相色譜法（HPLC)等[3-8]。這些技術(shù)靈敏度高，重復(fù)性好，但是操作復(fù)雜，檢測費(fèi)用高，不適用于大批量樣本的快速篩查。常用的前處理方法主要有干法灰化、微波消解法、稀酸浸提法、濕法消化法等[13-15]，這些方法特點(diǎn)不同，有一定的應(yīng)用缺陷，如干法灰化的耗時(shí)長，會影響檢測樣品結(jié)果的精準(zhǔn)性；微波消解能力弱；濕法消解易受環(huán)境干擾導(dǎo)致樣品污染等。稀酸浸提法利用稀酸在溫和條件下不發(fā)生破壞的原理提取糧食谷物中的重金屬元素，它的優(yōu)點(diǎn)是檢測耗材少、樣品污染低、提取效果好，缺點(diǎn)是提取效率受鹽酸、硝酸溶劑酸度的影響比較大。

因此，建立一個(gè)快速、方便、準(zhǔn)確和低成本的檢測方法尤為重要。隨著免疫層析檢測技術(shù)的快速發(fā)展，酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品中鉛、鎘、汞等多種重金屬檢測[9-12]。但是該方法對試樣有一定的要求，只能在液態(tài)壞境中進(jìn)行，不僅需要前處理釋放食品中的重金屬離子，同時(shí)還需去除干擾離子的影響。因此基于時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)制備出重金屬鉛熒光定量檢測卡，樣品前處理采用稀酸浸提法，針對樣品前處理酸的種類及濃度進(jìn)行研究優(yōu)化，旨在提高提取效率，使其具有靈敏度高，準(zhǔn)確率高，重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食重金屬鉛的現(xiàn)場快速定量檢測。

1 材料及儀器

1.1 試劑

鹽酸，國藥集團(tuán)；硝酸，江南大學(xué)；1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸（ITCBE），東仁化學(xué)科技；重金屬鉛的標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁公司；重金屬大米、玉米和小麥樣品均為國家糧食與物資儲備局科學(xué)研究院于市場收集；除注明外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為UP 水。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-600 型熒光定量快速檢測儀和FD-2200 型檢測卡恒溫孵育器，上海飛測生物科技有限公司；移液槍，上海騰名生物科技有限公司；多孔振蕩混勻器，姜堰區(qū)精英實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子天平，昆山安特計(jì)量設(shè)備有限公司；粉碎機(jī)，成都瑞城時(shí)代科技公司。

2 樣品檢測步驟

取具有代表性的待測樣品500 g,用小型粉碎機(jī)粉碎1～2 min 后過40 目篩，收集過篩后的均勻細(xì)小樣品。稱取過篩后的樣品5.0±0.02 g 于50 mL 離心管中，加入15～25 mL 提取液，用旋渦混勻器振蕩2～10 min,提取后用離心機(jī)4 000 r/min 離心2～10 min,取100 μL 離心后上清液加入500 μl 樣品稀釋液中，混勻3～5 s，然后取100 μL 待測液滴加于重金屬鉛熒光定量檢測卡的加樣孔中，放置于恒溫孵育器上37 ℃溫育8 min,后將檢測卡插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)熒光值并進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)檢測值超過重金屬鉛熒光定量檢測卡定量上限時(shí)，可用提取液將離心上清液稀釋5 倍后再進(jìn)行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

3 檢測原理

采用免疫層析法，基于時(shí)間分辨熒光納米微球，利用二甲戊靈抗原抗體的免疫反應(yīng)原理實(shí)現(xiàn)檢測，熒光微球上偶聯(lián)二抗與Pb-EDTA 單抗，形成微球-二抗-Pb-EDTA 單抗的結(jié)合體，NC 膜上包被重金屬鉛合成抗原（檢測線T 線）和二抗（參考線C 線）。當(dāng)待測液滴加在檢測卡加樣孔時(shí)，樣品中重金屬鉛離子會先與熒光微球表面的抗體通過螯合作用結(jié)合，層析通過NC 膜時(shí)，熒光微球偶聯(lián)剩余未結(jié)合抗體先與NC 膜上重金屬鉛-BSA 合成抗原結(jié)合，樣品中重金屬鉛已與熒光微球偶聯(lián)結(jié)合抗體，再與NC 膜上二抗結(jié)合，使用熒光免疫分析儀讀取NC 膜上C、T 線熒光值，參考線C 線熒光值隨檢測線T 線熒光值的降低而升高，從而實(shí)現(xiàn)C、T 線聯(lián)動(dòng)效果。

4 重金屬鉛熒光定量檢測卡組成

重金屬鉛熒光定量檢測卡由樣品墊、結(jié)合墊、PVC 底板、硝酸纖維素膜、吸水紙及卡殼等組成。結(jié)合墊上噴涂有熒光納米微球標(biāo)記的Pb-EDTA 單抗與二抗，硝酸纖維素膜上包被有重金屬鉛-BSA 合成抗原與二抗。如圖1 所示。

圖1 重金屬鉛熒光定量檢測卡

5 樣品前處理優(yōu)化

5.1 提取液配制

在通風(fēng)櫥中配制0.5 mol/L HCl、1 mol/L HCl、0.5 mol/L HNO3、1mol/L HNO3各200mL,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2 樣品提取檢測結(jié)果

取無污染陰性玉米樣品、大米樣品、小麥樣品各2 份，分別添加重金屬鉛25、100、500 μg/kg 低、中、高三個(gè)濃度點(diǎn)，用0.5 moL/L、1 moL/L 的HCL 和HNO3提取液進(jìn)行提取檢測，每個(gè)濃度點(diǎn)檢測2 個(gè)平行樣，檢測結(jié)果見表1、表2。

表1 不同酸含量提取液檢測準(zhǔn)確度

表2 不同酸含量提取液檢測準(zhǔn)確度

通過表1、表2 檢測結(jié)果可知，0.5 mol/L HCl 整體檢測回收率為95.53%，濃度CV 為7.64%；1mol/L HCl 整體檢測回收率為98.53%，濃度CV 為5.61%；0.5 mol/L HNO3整體檢測回收率為102.42%，濃度CV 為2.40%；1 mol/L HNO3整體檢測回收率為80.18%，濃度CV 為24.83%；其中0.5 mol/L HCl、1mol/L HCl、0.5 mol/L HNO3檢測結(jié)果均較好，濃度為0.5～1 mol/L HCl 的整體提取效率更穩(wěn)定，其玉米、大米樣品的整體檢測濃度CV 值小于小麥樣品，小麥樣品的基質(zhì)干擾因素更強(qiáng)；濃度為0.5～1mol/L HNO3的整體提取效率與不同基質(zhì)樣本檢測濃度CV 波動(dòng)較大?；诓煌|(zhì)樣本檢測回收率與檢測濃度CV 值綜合對比，濃度為0.5～1 mol/L HCl 的提取液檢測效果更優(yōu)。

5.3 螯合劑配制

在通風(fēng)櫥中配制0.5 mmol/L、1mmol/L、2mmol/L ITCBE 各10 mL，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

5.4 螯合劑檢測結(jié)果

取1 個(gè)濃度值為238±20 μg/kg 玉米樣品、1 個(gè)濃度值為90±10 μg/kg 大米樣品、1 個(gè)濃度值為417±30 μg/kg 小麥樣品，選用1 mol/L HCl 提取液進(jìn)行提取，不同螯合劑濃度螯合檢測，每個(gè)濃度點(diǎn)檢測2 個(gè)平行樣，檢測結(jié)果見表3。

表3 不同螯合劑濃度檢測準(zhǔn)確度

通過表3 檢測結(jié)果可知，0.5 mmol/L ITCBE 整體檢測回收率為85.9%，濃度CV 為4.4%；1 mmol/L ITCBE 整體檢測回收率為102.2%，濃度CV 為1.6%；2 mmol/L ITCBE 整體檢測回收率為110.3%，濃度CV 為3.3%；不同濃度螯合劑檢測雙平行樣濃度CV 均小于5%，檢測均一性較好；1～2 mmol/L ITCBE 螯合劑檢測不同基質(zhì)樣品回收率為99.2%～120.7%，整體檢測回收率高，對于檢測結(jié)果更優(yōu)。

綜合不同酸種類及酸濃度與不同螯合劑濃度的對比，濃度為0.5～1 mol/L HCl 的提取液，1～2 mmol/L ITCBE 螯合劑檢測不同基質(zhì)樣本回收率高，均一性好，故選其中1 mol/L HCl 做提取液，1 mmol/L ITCBE 做螯合劑，對重金屬鉛熒光定量檢測卡做性能檢測。

6 重金屬鉛熒光定量檢測卡性能檢測

6.1 檢出限與定量限

取無污染陰性小麥樣品、玉米樣品、大米樣品各10 份，用重金屬鉛熒光定量快速檢測卡每個(gè)樣品檢測10 次，檢出限（LOD）為測定平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限（LOQ）為測定平均值加10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢測結(jié)果見表4。

表4 檢出限與定量限 μg/kg

通過表4 檢測結(jié)果可知，重金屬鉛熒光定量檢測卡檢測玉米的檢出限為8.343 μg/kg，定量限為21.381 μg/kg；檢測小麥的檢出限為7.428 μg/kg，定量限為20.830 μg/kg；檢測大米的檢出限為8.256 μg/kg，定量限為21.414 μg/kg。檢測玉米、小麥、大米三種基質(zhì)的檢出限與定量限相近。

6.2 線性范圍

取無污染陰性大米樣品、小麥樣品、玉米樣品各7 份，分別添加重金屬鉛25、50、100、250、500、1 000 μg/kg 濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，用重金屬鉛熒光定量快速檢測卡每個(gè)樣品檢測3 次，以添加濃度為縱坐標(biāo)，重金屬鉛熒光定量快速檢測卡檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)，擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，如圖2、圖3 和圖4。

圖2 大米中重金屬鉛添加量與重金屬鉛熒光定量快速檢測卡檢測值的線性關(guān)系

圖3 小麥中重金屬鉛添加量與重金屬鉛熒光定量快速檢測卡檢測值的線性關(guān)系

圖4 玉米中重金屬鉛添加量與重金屬鉛熒光定量快速檢測卡檢測值的線性關(guān)系

通過圖2、圖3 和圖4 結(jié)果可知，大米的線性范圍25～1 000 μg/kg (6 點(diǎn)），回歸方程：y=0.9926x+6.1687，相關(guān)系數(shù)R2=0.9988;小麥的線性范圍：25～1000 μg/kg (6 點(diǎn)），回歸方程：y=0.9974x+5.5996，相關(guān)系數(shù)R2=0.9988;玉米的線性范圍：25～1000 μg/kg(6 點(diǎn)），回歸方程：y=0.9909x-3.3094，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。大米、小麥、玉米可定量檢測范圍25～1 000 μg/kg。

6.3 準(zhǔn)確度與重復(fù)性

取1 個(gè)濃度值為238±20 μg/kg 玉米樣品、1 個(gè)濃度值為90±10 μg/kg 大米樣品、1 個(gè)濃度值為417±30 μg/kg 小麥樣品，用重金屬鉛熒光定量快速檢測卡每個(gè)樣品檢測5 次，檢測結(jié)果見表5。

表5 準(zhǔn)確性和重復(fù)性

通過表5 檢測結(jié)果可知，重金屬鉛熒光定量檢測卡檢測玉米、大米、小麥基質(zhì)樣本的整體回收率為96.43%～108.34%，整體濃度CV 為4.96%～8.02%，整體檢測回收率與濃度CV 均較好。

7 結(jié)果與展望

7.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稀酸浸提法是利用稀酸在溫和條件下不發(fā)生破壞的原理提取糧食谷物中的重金屬元素，其優(yōu)點(diǎn)是檢測耗材少、樣品污染小、提取效果好，缺點(diǎn)是提取效率受鹽酸、硝酸溶劑酸度的影響比較大。旨在基于時(shí)間分辨熒光重金屬鉛熒光定量檢測卡，針對其樣品前處理酸的種類及濃度進(jìn)行研究優(yōu)化，提高樣品前處理的提取效率，使其具有靈敏度高，準(zhǔn)確率高，重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食重金屬鉛的現(xiàn)場快速定量檢測。

通過不同酸種類與濃度對不同基質(zhì)樣品檢測回收率對比，濃度為0.5～1 mol/L HCl 的提取液檢測回收率范圍80.1%～114.1%，平均回收率范圍為95.53%～98.53%，樣品提取效率較好，不同螯合劑濃度對不同基質(zhì)樣品檢測回收率對比，1～2 mM ITCBE螯合劑檢測回收率范圍99.2%～120.7%，平均回收率范圍為102.2%～110.3%，整體回收率高。說明提取液與螯合劑的優(yōu)化篩選均有助于提高重金屬鉛在不同基質(zhì)樣品中的提取效率與檢測回收率。

針對優(yōu)化篩選的提取液與螯合劑，對重金屬鉛熒光定量檢測卡進(jìn)行性能研究，其重金屬鉛熒光定量檢測卡檢測玉米的檢出限為8.343 μg/kg，定量限為21.381 μg/kg；檢測小麥的檢出限為7.428 μg/kg，定量限為20.830 μg/kg；檢測大米的檢出限為8.256μg/kg，定量限為21.414 μg/kg。檢測玉米、小麥、大米三種基質(zhì)的檢出限與定量限相近。大米、小麥、玉米三種基質(zhì)可定量檢測范圍為25～1 000 μg/kg。玉米、大米、小麥基質(zhì)樣本的整體回收率為96.43%～108.34%，整體濃度CV 為4.96%～8.02%，整體檢測回收率與濃度CV 均較好。

7.2 展望

在食品安全檢測領(lǐng)域，檢測糧食谷物中重金屬離子濃度時(shí)，可以根據(jù)樣品種類選擇合理的樣品前處理技術(shù)，本文提供的稀酸浸提法提取糧食谷物中重金屬鉛離子簡單高效，可以提高樣品檢測準(zhǔn)確度，還可以降低檢測成本，并適用于樣品篩選與現(xiàn)場檢測，彌補(bǔ)了大型儀器設(shè)備檢測前處理復(fù)雜與設(shè)備價(jià)格昂貴缺陷，也彌補(bǔ)了快速檢測技術(shù)樣品前處理提取效率低的缺陷，為食品安全檢測保駕護(hù)航。