李 玲，韋忠瓊，周 梅，韋子琪，李銓香，吳玉珍，李曉龍，3*

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；3.長(zhǎng)壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，5 年生存率僅為18%［1］。尋找肝癌的有效治療方法受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，然而肝癌是一種多基因疾病，具有復(fù)雜的機(jī)理和信號(hào)途徑，單一的治療方式很難達(dá)到滿意的治療效果，且其發(fā)生過(guò)程緩慢，癥狀由輕變重，當(dāng)患者察覺(jué)時(shí)已錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)治療的時(shí)間，因此，使用靶向劑調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路已成為肝癌治療的研究熱點(diǎn)［2］。

γ-倒捻子素（Mangosin），也稱γ-山竹黃酮、γ-山酮，其含有氧雜蒽酮結(jié)構(gòu)，具有抗癌、抗菌、抗氧化與抗炎等多種生物活性，在醫(yī)學(xué)與食品領(lǐng)域的應(yīng)用很普遍［3］。絕大部分γ-Mangosin 提取分離自藤黃科藤黃屬植物山竹果殼內(nèi)［4］。研究表明，山竹果殼中具有多種化學(xué)成分，如α-Mangosin、γ-Mangosin 等［5］，這些化學(xué)物質(zhì)存在諸多疾病靶點(diǎn)，可有效用于抗菌、抗腫瘤、抗氧化與抗HIV［6-10］。此外，其果殼已被廣泛用作抗過(guò)敏劑和抗炎劑［11］。在國(guó)內(nèi)外的研究中，對(duì)于山竹果殼的成分分析提取與生物功能已開展了較深入的分析，然而其藥理作用機(jī)制的研究較少。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段預(yù)測(cè)γ-Mangosin 治療肝癌的多通路與多靶標(biāo)的協(xié)同效應(yīng)，及其治療肝癌的可能機(jī)制。

1 方 法

1.1 γ-倒捻子素的鑒定 查閱文獻(xiàn)獲取γ-倒捻子素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖片［5］，使用SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)［12］繪制γ-倒捻子素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，查看此物質(zhì)的GI absorption 及Druglikeness 前5 項(xiàng)，分別為Muegge 、Lipinski、Egan、Veber 與Ghose。GI absorption 結(jié)果顯示為High且Druglikeness 的前5 項(xiàng)中有2 項(xiàng)內(nèi)容結(jié)果顯示為Yes，表明可使用該藥物活性成分進(jìn)行研究［13］。

1.2 γ-倒捻子素靶標(biāo)預(yù)測(cè)及作用靶基因篩選 經(jīng)由STP 數(shù)據(jù)庫(kù)（SwissTargetPrediction，http：//www.swisstarget prediction.ch/）［14-15］，繪制γ-Mangosin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并對(duì)其靶基因進(jìn)行搜索，同時(shí)向Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）內(nèi)輸入，通過(guò)限定物種為“human”，選擇已經(jīng)驗(yàn)證的基因，匹配出與靶基因?qū)?yīng)的Gene Symbol（基因符號(hào)），以方便與肝癌對(duì)應(yīng)靶基因的Gene Symbol 進(jìn)行比對(duì)。未配對(duì)出的靶基因則剔除。

1.3 獲取肝細(xì)胞癌相關(guān)疾病靶標(biāo) 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）［16］，輸入“Liver Cancer”獲取疾病作用靶點(diǎn)，并以Relevance score≥9.17為參考值，篩選后獲取肝癌相關(guān)疾病的基因。

1.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選 在Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）分別錄入γ-倒捻子素與肝癌的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò) 利用Cytoscape 3.8.0 軟件［17］，導(dǎo)入γ-Mangosin 與LC 相關(guān)的核心靶點(diǎn)基因，由此完成“藥物-共活性物質(zhì)-核心靶點(diǎn)基因”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

1.6 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及篩選核心靶標(biāo) 利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（https：//string-db.org/）［18］預(yù)測(cè)蛋白相互作用關(guān)系。將γ-倒捻子治療肝癌的潛在靶標(biāo)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“human”，得到蛋白相互作用關(guān)系，再將其以TSV 格式保存下來(lái)［19］。利用Cytoscape 3.8.0 軟件［17］，根據(jù)degree 值篩選γ-倒捻子素治療肝癌的核心靶標(biāo)。把提取自數(shù)據(jù)庫(kù)String 的TSV 格式文件向Cytoscape 3.8.0 軟件內(nèi)導(dǎo)入，完成PPI網(wǎng)絡(luò)的繪制，同時(shí)開展網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，基于Degree 值高低依次分布，利用Excel 軟件制作核心靶標(biāo)條形圖，篩選出排名前5的靶標(biāo)作為核心靶標(biāo)［20］。

1.7 共同靶標(biāo)通路與功能富集分析 把前文所明確的共同靶標(biāo)向數(shù)據(jù)庫(kù)Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）內(nèi)導(dǎo)入，開展基因本體論（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）兩項(xiàng)富集分析，搜集P＜0.05、最小計(jì)數(shù)是3 同時(shí)富集因子（EFs）在1.5 以上（EFs 即觀察所得計(jì)數(shù)同偶然預(yù)期計(jì)數(shù)之比）的項(xiàng)，同時(shí)經(jīng)由微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_gopathway_enrichment_bubbleplot_081）繪制富集分析圖。

1.8 分子對(duì)接方法 使用分子對(duì)接技術(shù)研究γ-倒捻子素與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用，即分別自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載γ-倒捻子素關(guān)鍵成分的3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）進(jìn)行基因靶蛋白結(jié)構(gòu)的下載，再運(yùn)用AutoDock將γ-倒捻子素分別對(duì)接至蛋白交互網(wǎng)絡(luò)Degree 值排名前5 的核心靶標(biāo)的活性口袋，AutoDock 可自動(dòng)識(shí)別蛋白潛在結(jié)合位點(diǎn)，計(jì)算中心和大小后自定義對(duì)接口袋大小。對(duì)接后，借助軟件AutoDockVina對(duì)所得復(fù)合物進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分愈小，說(shuō)明受體親和配體能力愈強(qiáng)。完成上述操作后，使用R語(yǔ)言的pheatmap 包繪制熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 γ-倒捻子素鑒定及其靶標(biāo)篩選結(jié)果 由STP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得100 個(gè)γ-Mangosin 相關(guān)靶基因，這些靶點(diǎn)名稱經(jīng)由Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的基因名，同時(shí)對(duì)非人類、重復(fù)靶點(diǎn)作剔除處理，最后得到潛在靶點(diǎn)100個(gè)。γ-Mangosin化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 γ-倒捻子素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2 肝細(xì)胞癌作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“Liver Cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點(diǎn)共16 730 個(gè)。將“Relevance score≥9.17”設(shè)成參考值，篩選后獲得與肝細(xì)胞癌相關(guān)的靶點(diǎn)共2 092個(gè)。

2.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)篩選結(jié)果 將γ-倒捻子素對(duì)應(yīng)基因及肝細(xì)胞癌靶基因相匹配，得到66個(gè)交集靶標(biāo)，維恩圖如圖2所示。

圖2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)維恩圖

2.4 “藥物成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 向軟件Cytoscape內(nèi)導(dǎo)入γ-Mangosin和LC相關(guān)的核心靶點(diǎn)基因，完成“藥物成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，如圖3所示。γ-倒捻子素的主要作用靶點(diǎn)有66個(gè)，具體靶標(biāo)如下：CYP19A1、IDH1、PTGS1、PTGS2、FASN、ALOX12、NFKB1、RELA、PLK1、HSP90B1、F10、CTNNB1、HSP90AA1、NOS2、HSP90AB1、MELK、PRKCI、TNF、PIM1、SIRT1、AGTR1、CHEK2、CHEK1、MTOR、PIK3CA、IKBKB、CXCR2、IGF1R、AURKB、KDR、MET、ERBB2、KLK2、AKT1、PLAU、FBP1、CALCA、CCR5、ALK、PRKCB、PRKCE、PLG、PRSS1、CDK4、CA9、PRKCD、PRKCA、CDK2、CHUK、EP300、RPS6KA3、SRD5A1、ERN1、ABL1、CSF1R、PDGFRB、PDGFRA、RET、MAPK3、CASP1、DHFR、AXL、RARA、RYR1、FLT4、TEK。

圖3 “藥物成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶標(biāo) 向String 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)導(dǎo)入γ-Mangosin 治療LC 的潛在靶標(biāo)，將“human”作為限定物種，獲得PPI 圖（見(jiàn)圖4）。對(duì)無(wú)互作蛋白（單獨(dú)游離蛋白）做排除處理，圓圈（節(jié)點(diǎn)）的顏色與大小反映出Degree值高低，圓圈面積越大，Degree值越大，其顏色從紅轉(zhuǎn)藍(lán)對(duì)應(yīng)的Degree 值越大。邊的粗細(xì)反映出Combine score值高低，邊越粗，提示Combine score值越大［19］。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)1（PPI 1）

再將由String 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的蛋白相互作用關(guān)系圖以TSV 格式保存后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖5）。其中，橘色圓形節(jié)點(diǎn)表示潛在靶標(biāo)，連線表示不同靶標(biāo)間的聯(lián)系。經(jīng)由Network Analyzer 實(shí)施網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，再基于Degree 值對(duì)節(jié)點(diǎn)顏色程度作調(diào)節(jié)，顏色越深，提示此靶標(biāo)和其它靶標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性越顯著，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)。把Degree值為14及以上的節(jié)點(diǎn)，利用Excel 軟件制作出前30 個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)條形圖（如圖6所示）。其中，Degree值排名前5的核心靶標(biāo)為MTOR、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、TNF［20］。

圖6 中藥-疾病核心靶標(biāo)條形圖

2.6 GO 功能富集分析結(jié)果 針對(duì)以上潛在靶點(diǎn)基因，經(jīng)由GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，-log10（pvalue）值排名前20條的通路為蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、蛋白激酶B 信號(hào)、脂質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、老化、氧氣含量反應(yīng)、激酶結(jié)合、細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、傷口愈合、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、組蛋白磷酸化、對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)、趨向性、細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)、對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)。如圖7所示。

圖7 GO功能富集分析圖

2.7 KEGG 通路富集分析 對(duì)以上潛在靶點(diǎn)基因，經(jīng)由KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，-log10（pvalue）值排名前20 條的通路為癌癥通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAG 信號(hào)通路、癌癥中的微小RNA、FoxO 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、病毒致癌作用、VEGF 信號(hào)通路、Apelin 信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、鈣信號(hào)通路、粘附連接、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、血清素突觸、胰高血糖素信號(hào)通路、卵巢類固醇生成、膀胱癌、致病性大腸桿菌感染、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、TGF-β 信號(hào)通路。見(jiàn)圖8。

圖8 γ-倒捻子素潛在靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

2.8 分子對(duì)接結(jié)果 根據(jù)Vina 得分?jǐn)?shù)據(jù)繪制熱圖，見(jiàn)圖9。分子對(duì)接結(jié)果顯示，γ-倒捻子素與MTOR、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、TNF 等5 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接共產(chǎn)生45 對(duì)結(jié)合復(fù)合物，其中對(duì)接的Vina 分值≤-7.0 的有27 對(duì)，表明大部分關(guān)鍵靶點(diǎn)與γ-倒捻子素的結(jié)合能力較強(qiáng)，而TNF 基因的6q00 與γ-倒捻子素相互作用的Vina 分值（即結(jié)合能）最佳，是-9.10 kcal/mol。

圖9 Vina得分圖

3 討 論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)出γ-倒捻子素治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。經(jīng)由數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards 確定了2 092 個(gè)與肝細(xì)胞癌有關(guān)的靶點(diǎn)，藥物靶點(diǎn)同疾病靶點(diǎn)兩者的交集靶標(biāo)合計(jì)66 個(gè)。通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選出Degree 值排名前5 的核心靶標(biāo)為MTOR、MAPK3、AKT1、HSP90AA1、TNF。

由分子對(duì)接結(jié)果可知，藥物與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合性，藥物與MAPK3、TNF 靶點(diǎn)的親和力較高，預(yù)測(cè)γ-Mangosin 有助于LC 的治療。TNF 具有多重特點(diǎn)和多重功能，一方面TNF 可特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞且不傷害體內(nèi)正常細(xì)胞；另一方面TNF 參與免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在重型肝炎中，TNF 具有雙重作用，一方面促進(jìn)正常肝組織再生，另一方面可增強(qiáng)TNF 介導(dǎo)的被病毒感染細(xì)胞的溶解作用。吳瑋等［21］研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 單抗作用后，HepG2 細(xì)胞表達(dá)的NF-κB核蛋白大幅下調(diào)，HepG2 細(xì)胞的凋亡率大幅提高，兩者的劑量與時(shí)間依賴性表現(xiàn)明顯，所以TNF-α介導(dǎo)的信號(hào)途徑NF-κB 同LC 的形成、進(jìn)行、遷移與耐藥有著緊密聯(lián)系。在介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)方面，MAPK 作為信號(hào)系統(tǒng)起著關(guān)鍵作用，表達(dá)于所有的真核細(xì)胞中。研究表明，信號(hào)途徑MAPK 可磷酸化NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子）、酶類與細(xì)胞骨架蛋白等，由此參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)化與凋亡，同時(shí)和腫瘤、炎癥等諸多疾病的出現(xiàn)存在緊密聯(lián)系［22］。張芬等［23］研究發(fā)現(xiàn)，MAPK1/MAPK3 的活化可促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌（PTC）的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。鄧志華等［24］研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平升高，可作為腫瘤啟動(dòng)子起作用。因此MAPK 介導(dǎo)的信號(hào)通路可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。

KEGG 富集分析表明，γ-倒捻子素治療肝癌主要通過(guò)FoxO、VEGF 等信號(hào)通路發(fā)揮作用。對(duì)于諸多生理與病理活動(dòng)，信號(hào)途徑FoxO 起著重要作用，在哺乳動(dòng)物內(nèi)已檢出以下4個(gè)亞科：FoxoO1、3、4、6，目前已有越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明FoxO 信號(hào)通路可能在癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制的作用［25］。另外，Gong 等［26］通過(guò)使用綜合生物信息學(xué)分析確定，MAPK8/FoxO 信號(hào)通路對(duì)癌癥和脂肪肝的發(fā)展具有重要意義，并可以證實(shí)TAM 可以通過(guò)MAPK8/FoxO 信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、T47D、ZR-75 和MDA-MB-231）和肝細(xì)胞（LO2）中發(fā)揮作用。孫巖巖等［27］研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮可通過(guò)抑制VEGF/VEGFR 信號(hào)通路，阻滯LC 細(xì)胞分裂，使其停滯于G0/G1 期，從而抑制肝癌的增殖，表明VEGF信號(hào)通路在肝癌發(fā)生、惡化中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，對(duì)γ-Mangosini 治療肝癌的核心靶點(diǎn)與核心信號(hào)途徑加以預(yù)測(cè)，建立“藥物成分-靶點(diǎn)-通路”的生物網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)，從而在理論上為γ-Mangosin 治療肝癌提供參考，但其治療肝癌的作用機(jī)制仍需開展進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。