王 剛 ,王芝玉 ,安榮榮 ,滕玉婷 ,古 梅 ,劉 霞 ,高慧娟,3,董瑞麗

（1.攀西釩鈦檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 攀枝花 617000；2.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省河西走廊特色資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000）

納豆激酶 (Nattokinase) 來(lái)源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品——納豆，納豆中含有豐富的納豆激酶，具有高效的溶栓作用[1]，很好的穩(wěn)定性[2]，療效不會(huì)受人體的胃腸等特殊環(huán)境影響。納豆激酶在人體內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)，無(wú)需大量服藥，由于其特殊的溶栓機(jī)理[3-4]，病人服用后不會(huì)引發(fā)體內(nèi)出血現(xiàn)象。由于目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的溶栓劑如尿激酶、鏈激酶重組纖溶酶原激活劑等存在半衰期短、副作用大與價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)[5]。納豆激酶生產(chǎn)成本較低，安全性好，具有開(kāi)發(fā)為新一代溶栓藥物的潛力[6]。

目前納豆激酶的生產(chǎn)方法主要通過(guò)液體深層發(fā)酵等獲得[7]。具有發(fā)酵周期短、易于控制發(fā)酵條件的優(yōu)點(diǎn)，但是成本高，污染大，現(xiàn)在逐漸被固態(tài)發(fā)酵技術(shù)取代。固態(tài)發(fā)酵具有生產(chǎn)成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、產(chǎn)酶活力高、易推廣的優(yōu)點(diǎn)[8]。通過(guò)A、B 兩株納豆芽孢桿菌在黃豆固體培養(yǎng)基產(chǎn)酶活性的研究，獲得最佳發(fā)酵條件，旨在為固體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶提供一定的理論依據(jù)[9]。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

A、B 納豆芽孢桿菌均由河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 儀器

HH-S28s 恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；V-1200 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；AL104 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；S70-CJ-18u 潔凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-50FBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY-200B 恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；FSD-100SA型電動(dòng)粉碎機(jī)，臺(tái)州市新恩精密糧儀有限公司。

1.2.2 試劑

酪蛋白分析純（上?；瘜W(xué)試劑廠），鎢酸鈉、鉑酸鈉、濃鹽酸、硫酸鋰、溴水、無(wú)水碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 福林-酚試劑配制方法

稱(chēng) 取50 g Na2WO4·2H2O、12.5 g Na2MoO4·2H2O，置于1 000 mL 圓底燒瓶中，加350 mL 水、25 mL85%磷酸、50 mL 濃鹽酸，文火微沸回流10 h，取下回流冷凝器，加50 g Li2SO4，25 mL 水，混勻后，加溴水脫色，直至溶液呈金黃色，再微沸15 min，驅(qū)除殘余的溴，冷卻，用水稀釋至500 mL 備用。

2.2 菌種活化

將A、B 兩種納豆芽孢桿菌粉接入新鮮的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于38 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，再轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)搖瓶中，在震蕩培養(yǎng)箱38 ℃培養(yǎng)24 h，配置為107CFU/mL 的菌懸液，置于4 ℃冰箱中備用。

2.3 納豆制備工藝

精選黃豆→清洗→浸泡→高壓蒸煮(121 ℃，30min)→晾置→接種→發(fā)酵→成熟納豆

①精選黃豆。選用顆粒飽滿、大小均勻、蛋白質(zhì)含量高的市售黃豆。②稱(chēng)重清洗。每份稱(chēng)取20 g，用清水沖洗。③浸泡。用1.5 倍的蒸餾水浸泡24 h，室溫，瀝干水分。④滅菌。把浸泡好的不同粒度的大豆裝入250 mL 的錐形瓶，包扎，在121 ℃下滅菌30 min。⑤接種。將滅菌的錐形瓶放在自然條件下晾置至30 ℃左右，在無(wú)菌條件下接入納豆桿菌，搖勻，使納豆芽孢桿菌充分與黃豆接觸。⑥發(fā)酵。放入38 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間后，即為納豆。

2.4 粉碎方式對(duì)納豆激酶活性的影響

精選黃豆，洗凈、浸泡過(guò)夜，除去多余水份后，將黃豆的整粒、1/2 粒、1/4 粒、1/8 粒和粉末50 g，分別置于250 mL 的錐形瓶中，在121 ℃滅菌30 min，自然冷卻，按固體培養(yǎng)基重量的9%比例接種A、B 兩種納豆芽孢桿菌菌液，在38 ℃下培養(yǎng)48 h，每種粉碎方式做3 次平行，將發(fā)酵好的納豆研碎，加入緩沖液提取粗酶液，測(cè)定納豆激酶的活性，以確定最佳的粉碎方式。

2.5 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響

在250 mL 錐形瓶中，加入50 g 浸泡過(guò)夜的黃豆，包扎，在121 ℃下滅菌30 min，待其冷卻至30 ℃后，接入A、B 兩種納豆芽孢桿菌菌液，按固體培養(yǎng)基重量的5%、7%、9%、11%和13%接種量分別接種，每個(gè)平行設(shè)定3 次重復(fù)。置于38 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h 后取出，將發(fā)酵好的納豆研碎，加入緩沖液提取粗酶液，測(cè)定納豆激酶的活性，以確定最佳的接種量。

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活性的影響

在250 mL 錐形瓶中，加入50 g 浸泡過(guò)夜的黃豆，包扎，在121 ℃下滅菌30 min，待其冷卻至30 ℃后接入A、B 兩種納豆芽孢桿菌菌液，按固體培養(yǎng)基重量的9%接種量接種，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 和60 h 后，每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間3 次重復(fù)，將發(fā)酵好納豆研碎，加入緩沖液提取粗酶液，測(cè)定納豆激酶活性，以確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.7 納豆桿菌發(fā)酵黃豆產(chǎn)酶活性的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了獲得納豆桿菌產(chǎn)酶活性最高的工藝條件，采用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以粉碎度、接種量和發(fā)酵時(shí)間為變量，分別以A1、B2和C3表示，并以-1，0，1 分別代表變量的水平，以測(cè)得提取液酶活性(Y)為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)曲面分析進(jìn)行制備條件的優(yōu)化，從而得到最優(yōu)發(fā)酵條件。Box -Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1，采用Design Expert 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平

2.8 納豆激酶活性的測(cè)定方法

2.8.1 粗酶液的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g 納豆，放入酒精消毒后的研缽中研磨，研成糊狀物后，加入50 mL 的pH 7.2 磷酸緩沖液，用水定容至200 mL，于常溫下浸取30 min，隨時(shí)搖動(dòng)，在5 000 r/min 下離心10 min，取上清液，即為粗酶提取液。

2.8.2 水解液的制備

取1 mL 的1%酪蛋白溶液，于40 ℃水中預(yù)熱5 min，加1 mL 粗酶液，于40 ℃水中反應(yīng)20 min，加2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液，于40 ℃水中沉淀10 min，在5 000 r/min 下離心10 min 后取上清液為水解液。

空白液先加2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液，后加1 mL 的粗酶液，其余操作同上。

2.8.3 酶液比色測(cè)定

取5 mL 的0.4 mol/L 碳酸鈉溶液，加1 mL 水解液，最后加1 mL 的1∶3 稀釋的福林-酚試劑，于40℃水浴20 min，以不加酶液為空白，在680 nm，1 cm比色皿，V-1200 型分光光度計(jì)測(cè)定光密度。

2.8.4 酶活力的計(jì)算

蛋白酶活力的定義：在30 ℃，pH 7.2 的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生酪氨酸1 μg 為1 個(gè)酶活力單位。

式中：E 為樣品吸光度，K 為吸收系數(shù)，4 為水解液總體積，mL；10 為反應(yīng)時(shí)間，min;N為稀釋倍數(shù)，W 為納豆取量,g；吸收系數(shù)K 值取100 μg[10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 粉碎方式對(duì)納豆激酶活性的影響

在不同顆粒度的固體培養(yǎng)基上接種9%的A、B兩種納豆芽孢桿菌后，38 ℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生的納豆激酶活性隨著顆粒度粉碎度的增加，出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，變化不大，在黃豆為整粒時(shí)，兩種菌產(chǎn)生的激酶活性最大，分別為836 U/g 和920 U/g，較徐強(qiáng)[11]用液體發(fā)酵法得到的納豆激酶酶活720.7 U/g 分別高出15.9%和27.6%，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 粉碎方式對(duì)納豆激酶活性的影響

3.2 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響

在黃豆固體培養(yǎng)基中接入發(fā)酵后的A、B 兩種菌種，隨著接種量的增加，納豆激酶活性先增加，后出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在接種濃度為9%時(shí)，A、B 兩種菌液產(chǎn)生的酶活性最強(qiáng)，分別達(dá)到852 U/g 和1 128 U/g，其中B 菌種產(chǎn)生的酶活性比A 菌種高32.3%，確定9%為兩種菌產(chǎn)生納豆激酶的最佳接種量，并且B菌種在相同接種濃度下的產(chǎn)酶活性比A 菌種高，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 接種量對(duì)納豆激酶活性的影響

3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活性的影響

在黃豆固體培養(yǎng)基質(zhì)量一定時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，納豆激酶活性呈現(xiàn)先緩慢增加后急劇下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h 時(shí)，A、B 兩種菌種的產(chǎn)酶活性最強(qiáng)，分別為1 140 U/g 和1 448 U/g，B 菌種的產(chǎn)酶活性比A 菌種高27%，確定48 h 為兩種菌液產(chǎn)生納豆激酶的最佳發(fā)酵時(shí)間，并且得知B 菌種在相同發(fā)酵時(shí)間下產(chǎn)酶活性比A 菌種高，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活性的影響

3.4 響應(yīng)面曲面法優(yōu)化發(fā)酵條件

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，可以清楚地看到在相同條件下，B 菌種的產(chǎn)酶活性高于A 菌種，選取B 菌種進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平共17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2 中的數(shù)據(jù)經(jīng)Design-Expert 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，所得的主要分析結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)方差分析，方程一次項(xiàng)A 和C，以及二次項(xiàng)影響都是顯著的，失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說(shuō)明方程擬合較好，模型穩(wěn)定。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果

利用軟件Design Expert8.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得到多元二次回歸方程：Y1=1366.40-24A+143B-15.00C+12.00AC-10BC-182.2A2-100.2B2-140.2C2。式中Y1為納豆芽孢桿菌酶活性，A、B 和C 為上述3個(gè)變量的編碼值?；貧w系數(shù)R2=0.9875 說(shuō)明回歸擬合程度較好。P＜0.0001，說(shuō)明此方程極顯著，模型中的B、A2、B2、C2達(dá)到極顯著水平，A 達(dá)到顯著水平，C、AB、AC、BC 影響不顯著。由F 值可知，影響納豆激酶酶活的主要因素依次為B＞A＞C，即接種量＞粉碎方式＞發(fā)酵時(shí)間。

利用Design Expert8.0 軟件可以得到3 個(gè)因子之間的響應(yīng)面分析圖和相應(yīng)的等高圖。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

從表3 方差分析結(jié)果可看出，模型的F=61.65403，P＜0.01，表明實(shí)驗(yàn)所采用二次模型是高度顯著的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。失擬項(xiàng)用來(lái)表示所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度，即二者差異的程度。本實(shí)驗(yàn)失擬項(xiàng)P=0.1316＞0.05，對(duì)模型有利，無(wú)失擬因素存在。同時(shí)線性項(xiàng)不顯著，平方項(xiàng)極顯著，交互作用項(xiàng)顯著，表明曲線彎曲度較高，該模型已在最優(yōu)區(qū)域進(jìn)行擬合。表明該二次回歸模型能擬合粉碎方式、接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶影響。

圖4a 顯示接種量與粉碎方式的交互作用，隨著粉碎程度的增加，產(chǎn)生的酶活力逐漸下降，所以為了簡(jiǎn)化納豆桿菌的固體發(fā)酵工藝，選擇粉碎方式應(yīng)該為整粒時(shí)，納豆桿菌的酶活性最高；圖4b 顯示發(fā)酵時(shí)間與粉碎度的交互作用，隨著發(fā)酵時(shí)間和粉碎程度的升高，酶活性也逐步提高，發(fā)酵時(shí)間和粉碎程度似乎存在著協(xié)同效應(yīng)；圖4c 顯示的是接種量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用，隨著納豆桿菌接種量的增加，酶活力越高，但接種量達(dá)到9%時(shí)，隨著接種量的增加，酶活力不再增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在48 h 左右時(shí)，酶活力提高，從經(jīng)濟(jì)方面認(rèn)為，發(fā)酵48 h，這個(gè)時(shí)間段是最佳效益時(shí)間。

圖4 各因素交互作用對(duì)納豆激酶活性影響的響應(yīng)面圖

對(duì)回歸方差進(jìn)行嶺跡分析，可得到響應(yīng)面最佳條件為，A=1/2-0.307×1/8，B=9%+0.9885×2%，C=48-0.2322×12，在最佳條件基礎(chǔ)之上將優(yōu)化條件調(diào)整為：顆粒度A=1/2，接種量B=11%，發(fā)酵時(shí)間C=45 h，對(duì)優(yōu)化條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在該條件下所測(cè)得納豆激酶活性為1 408 U/g，與發(fā)酵時(shí)間為48 h 時(shí)納豆激酶活性相同，從優(yōu)化的角度選擇45 h。而理論預(yù)測(cè)值為1 399 U/g，預(yù)測(cè)值較實(shí)測(cè)值低9 U/g，兩者之間相差較小，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間良好的擬合性證實(shí)了模型的有效性。

4 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法進(jìn)行納豆芽孢桿菌固態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)化，結(jié)合理論模型和實(shí)驗(yàn)得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成為：粉碎方式1/2 粒、接種量11%和發(fā)酵時(shí)間45 h 時(shí)，在121 ℃下滅菌30 min，經(jīng)培養(yǎng)優(yōu)化后納豆激酶酶活性最高為1 408 U/g 較未優(yōu)化之前提高了688 U/g。