王淑婷,朱 婷,馬浩森,李小鵬,牛 娜,馬翎健

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.渭南市農(nóng)資農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心,陜西渭南 714000)

基因家族由結(jié)構(gòu)和功能相似的多個(gè)基因組成,在特定的生物體中扮演著重要的角色。目前,在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種基因家族,如bHLH[1]、TCP[2]和Prx[3]等。SPL家族基因(AmSBP1和AmSBP2)在金魚草的花分生組織中首次被發(fā)現(xiàn),后在多種植物中被鑒定出。SPL蛋白均含有一個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域(也稱為SBP結(jié)構(gòu)域),由兩個(gè)獨(dú)立的鋅指結(jié)構(gòu)組成,其中包含Zn-1(Cys3His或Cys4)和Zn-2(Cys2HisCys)[6-7];每個(gè)鋅指位點(diǎn)由4個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)鋅離子,在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[8]。在SBP結(jié)構(gòu)域的C末端,有一個(gè)保守的核定位信號(hào)重疊在第二個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)上,將SBP蛋白引導(dǎo)到細(xì)胞核中,調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄[9]。

目前,SPL家族基因已經(jīng)在擬南芥[10-11]、水稻[7]、大豆[12]、矮牽牛[13]、棉花[14]、煙草[15]、泡桐[16]、藜麥[17]和水曲柳[18]中得到研究。但還沒(méi)有關(guān)于二穗短柄草SPL家族基因的報(bào)道。

研究表明,SPL家族基因由miR156/157調(diào)控,在植物生長(zhǎng)和生理的各個(gè)方面發(fā)揮著作用[11,19-20];在擬南芥17個(gè)SPLs中,有11個(gè)含有miR156/157識(shí)別位點(diǎn)[23-24]。Schwab等[25]發(fā)現(xiàn),擬南芥中過(guò)表達(dá)miR156使多個(gè)SPLs的表達(dá)下調(diào),這些SPLs都含有miR156/157識(shí)別位點(diǎn),而其他沒(méi)有該識(shí)別位點(diǎn)的SPLs不受影響;突變5個(gè)AtSPL3的miR156/157識(shí)別位點(diǎn)堿基后,AtSPL3的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。在番茄中,大部分SPL基因在莖尖、花序和果實(shí)中高表達(dá),而miR156/157在這三個(gè)組織中的表達(dá)較低, 表明miR156/157與SPLs的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。SPL基因參與植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),如AtSPL8可抑制促進(jìn)種子萌發(fā)和根生長(zhǎng)的下游基因的表達(dá)[27];VvSBP3和VvSBP5參與葡萄的低溫反應(yīng)[28]。二穗短柄草基因組較小,與糧食作物如小麥、大麥和水稻關(guān)系密切[29]。目前,關(guān)于擬南芥和水稻SPL家族基因的功能研究較多,但其在二穗短柄草中的信息還不清楚。本研究擬對(duì)二穗短柄草中的SPL家族基因進(jìn)行鑒定,分析其基因結(jié)構(gòu)、基序、順式元件、系統(tǒng)發(fā)育、基因復(fù)制、GO注釋和表達(dá)模式等,并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè),為糧食作物功能基因的發(fā)現(xiàn)與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 二穗短柄草中SPL基因的鑒定

從Ensembl plant數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/)下載二穗短柄草的全基因組數(shù)據(jù),包括基因組序列文件和蛋白序列文件。從PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載SBP結(jié)構(gòu)域 (PF03110);使用HMMER 3.0程序?qū)BP結(jié)構(gòu)域作為查詢序列,在二穗短柄草中尋找包含SBP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì);以水稻和擬南芥的SBP蛋白序列為查詢序列,利用BLASTP程序?qū)Χ攵瘫莸鞍仔蛄羞M(jìn)行檢索。分析HMM和BLASTP的結(jié)果,鑒定出BdSPL蛋白。利用NCBI-CDD網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)候選的BdSPL蛋白進(jìn)行鑒定。共得到17個(gè)BdSPL蛋白,其相應(yīng)基因依次命名為BdSPL1～BdSPL17。從ExPASY服務(wù)器(https://web.expasy.org/compute_pi/)[30]獲得BdSPL蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)(PI)和相對(duì)分子質(zhì)量(MW),并使用Cello Web服務(wù)器(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位。

1.2 BdSPL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

使用CluastX 2.0軟件[31]對(duì)二穗短柄草、水稻和擬南芥的SPL蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),利用MEGA 8.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,bootstrap參數(shù)設(shè)置為1 000[32]。

1.3 BdSPL基因的結(jié)構(gòu)及保守基序分析

利用Gene Structure Display Server (http://gsds.gao-lab.org/)對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和編碼序列(CDS)進(jìn)行分析[33]。利用MEME v4.9.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)分析BdSPL蛋白的保守基序,基序最佳氨基酸數(shù)10～250,最大基序數(shù)量設(shè)置為15個(gè)[34]。

1.4 二穗短柄草、水稻、小麥和玉米的SPLs共線性分析

利用MCScanX[35]軟件檢測(cè)二穗短柄草與水稻、玉米、小麥之間的SPL區(qū)域。使用Circos 0.67比較BdSPL與上述物種之間的共線性關(guān)系[36]。比較共線基因?qū)Φ腃DS和蛋白質(zhì)序列,使用KAKS_Calculator軟件計(jì)算KAKS比率[37]。用Wang[3]的方法計(jì)算共線基因?qū)Φ陌l(fā)散時(shí)間(T)。

1.5 SPL的GO注釋及其與其他蛋白質(zhì)相互作用分析

二穗短柄草中SPL蛋白的GO注釋來(lái)自PLAZA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v5_dicots/)[38]和Plant Transcriptional Regulatory Map數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plantregmap.gao-lab.org/)。使用ArenanNet V2[39]和Cytoscape軟件[40]構(gòu)建BdSPL與其他二穗短柄草蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6 BdSPLs的啟動(dòng)子分析

從Ensemblplant數(shù)據(jù)庫(kù)下載BdSPL基因上游1.5 kb的DNA序列,提交到PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/),預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件[41]。

1.7 BdSPLs的基因表達(dá)分析

從SRA數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)中獲得17個(gè)BdSPL基因在九種組織[42]和不同植物激素處理下[43]的數(shù)據(jù),分析其表達(dá)模式。

將二穗短柄草Bd21的種子鋪在有濾紙的培養(yǎng)皿中,使水輕微沒(méi)過(guò)種子,發(fā)芽3～5 d。將泥炭土、蛭石、營(yíng)養(yǎng)土按照1∶1∶1的比例充分混勻,裝到培養(yǎng)盆(10 cm×10 cm×8.5 cm)中。挑選長(zhǎng)勢(shì)一致且健壯的二穗短柄草幼苗移栽至培養(yǎng)盆中,每個(gè)培養(yǎng)盆3株,于16/8 h晝夜光周期、23 ℃、相對(duì)濕度55%～60%的溫室培養(yǎng);3～5 d澆水并施肥一次,在抽穗期采集根、葉、莖和花序進(jìn)行SPL基因表達(dá)分析。

同上述方法將二穗短柄草在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿培養(yǎng)至3周齡,分別用200 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1GA、100 μmol·L-1ABA和20%PEG600處理液沒(méi)過(guò)幼苗根部,并用相應(yīng)處理液噴濕莖和葉;同時(shí)設(shè)低溫(-4 ℃)處理[44],均保持2 h后用流水沖洗幼苗;將所有樣品用液氮速凍,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用艾科瑞公司的 RNA 提取試劑盒(AG21019)提取上述材料的總RNA;使用Evo M-MLV RT-PCR試劑盒(Accurate Biology,中國(guó)湖南)合成cDNA,使用 PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)17個(gè)BdSPL基因的qRT-PCR 特異性引物(表1)。使用艾科瑞公司的Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(含ROX)(AG11718)參照說(shuō)明書用QuantStudioTMReal Time PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。BdUBC18為參考基因,相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers used for the qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 二穗短柄草SPL家族基因的鑒定和染色體定位

所得17個(gè)編碼SBP蛋白的基因(表2)。在二穗短柄草的5條染色體上分布不均,其中6個(gè)分布在第3染色體上,占35%,第1、2、4染色體上均有3個(gè),有2個(gè)位于第5染色體上。

表2 二穗短柄草SPL基因家族的特征Table 2 Characteristic features of SPL gene family in B. distachyon

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),所有的二穗短柄草SPL蛋白定位在細(xì)胞核中。17個(gè)成員的氨基酸長(zhǎng)度為192～1 126 aa,其中最長(zhǎng)的是BdSPL011,最短的是BdSPL002。相對(duì)分子量20.05～122.96 kDa,等電點(diǎn)5.44～9.92。

2.2 BdSPLs的序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

在17個(gè)BdSPL蛋白中,均有約76個(gè)氨基酸組成的SBP結(jié)構(gòu)域(圖1),其C末端有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),為Cys-His或Cys-Cys-His-Cys,以及一個(gè)NSL位點(diǎn)。

用 MEGA6.0構(gòu)建二穗短柄草SPL蛋白與擬南芥、水稻 SPL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。根據(jù)遺傳變異度將這52個(gè)SPL劃分成7組;其中D組和F組的SPL最多。二穗短柄草的17個(gè)SPL均勻分布在除E組外的其他6個(gè)組里。進(jìn)化樹中進(jìn)化枝相近SPL可能來(lái)自同源基因,例如,A組中的BdSPL012和OsSPL016可能是同源基因。同一組中,二穗短柄草與水稻的SPL遺傳變異度更小,說(shuō)明二者關(guān)系更近。

圖2 二穗短柄草、擬南芥和水稻SPL系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 BdSPL的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖3)表明,17個(gè)BdSPL基因的外顯子數(shù)為2～11,58%的BdSPL基因含有3個(gè)外顯子,圖2中同組BdSPL基因結(jié)構(gòu)相似。

圖3 BdSPLs基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

17個(gè)BdSPL基序分析(圖3)表明,兩個(gè)基序(motif 1, motif 2)包含在所有BdSPL蛋白中,推測(cè)motif 1和motif 2是SBP結(jié)構(gòu)域的重要構(gòu)成部分。圖2中F組的BdSPL蛋白具有最多的基序數(shù),蛋白質(zhì)最長(zhǎng);不同組有其特定的基序,例如,motif 3、9、10和11僅存在于F組和G組的BdSPL蛋白中;motif 7存在于F組亞家族的BdSPL001、004和011中。推測(cè)同一組成員具有相似的功能。

2.4 二穗短柄草與水稻、小麥和玉米的SPL基因共線性分析

在二穗短柄草(圖4A)中檢測(cè)到6對(duì)基因復(fù)制事件,其中5對(duì)與片段復(fù)制事件有關(guān),1對(duì)為串聯(lián)復(fù)制事件。這表明片段復(fù)制事件對(duì)BdSPL的進(jìn)化起主要作用。所有BdSPLs的Ka/Ks均小于1;復(fù)制事件的發(fā)散時(shí)間約為76 Mya。

A: 二穗短柄草基因組中的重復(fù)基因?qū)?B、C、D: 二穗短柄草與水稻、小麥、玉米間的共線性;淺色背景代表四個(gè)物種整個(gè)基因組中的共性區(qū)塊,深色線條代表BdSPLs的共線基因?qū)Α?/p>

在其他3個(gè)物種中檢測(cè)到125個(gè)基因與BdSPL基因是共線的,其中,水稻有23個(gè)(圖4B),小麥有62個(gè)(圖4C),玉米有40個(gè)(圖4D)。這表明與水稻和玉米相比,小麥與二穗短柄草SPL基因相似性更高。除BdSPL012/Os01t0922600、BdSPL015/Os01t0922600、BdSPL006/TraesCS7A02G260500等10對(duì)基因的Ka/Ks值大于1外,其余115對(duì)基因的Ka/Ks值均小于1。BdSPLs與水稻的分化時(shí)間約為53 Mya,早于小麥的45 Mya,晚于玉米的57 Mya。這表明BdSPL基因經(jīng)過(guò)了純化選擇,其中Ka/Ks>1的基因?qū)υ谶M(jìn)化過(guò)程中起著重要作用。

2.5 BdSPLs的GO注釋及與其他蛋白質(zhì)相互作用分析

GO注釋顯示(圖5),17個(gè)BdSPL蛋白共得到22個(gè)GO注解,其中14個(gè)與生物過(guò)程有關(guān),2個(gè)與分子功能有關(guān),6個(gè)與細(xì)胞組分有關(guān)。在細(xì)胞組分中,17個(gè)BdSPLs與細(xì)胞和細(xì)胞器組成有關(guān),不到30%的BdSPLs參與膜的形成。在分子功能中,17個(gè)BdSPLs均與DNA結(jié)合,不到10%的BdSPLs具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。在生物過(guò)程中,超過(guò)60%的BdSPL蛋白參與了二穗短柄草的生長(zhǎng)和發(fā)育,包括發(fā)育過(guò)程、代謝過(guò)程和生物過(guò)程。不到40%的BdSPLs能對(duì)環(huán)境壓力作出反應(yīng)。這說(shuō)明BdSPL蛋白參與各種生理過(guò)程。

構(gòu)建BdSPLs與二穗短柄草中其他蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖6),共檢測(cè)到678個(gè)相互作用的蛋白分支,每個(gè)BdSPL與至少4個(gè)其他蛋白發(fā)生15次相互作用。其中,47%的BdSPLs與至少61個(gè)蛋白相互作用,如BdSPL006、007和008,表明這些SPL蛋白在蛋白網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。將與BdSPL蛋白相互作用的其他蛋白的序列提交到CDD數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)多數(shù)為AP2和MADS超家族。據(jù)報(bào)道,AP2家族在激素調(diào)節(jié)和花發(fā)育中具有重要作用[45]。推測(cè)BdSPL蛋白與AP2家族的蛋白相互作用調(diào)節(jié)植物的花發(fā)育。

BdSPLs蛋白標(biāo)記為紅色,其他蛋白標(biāo)記為藍(lán)色。

2.6 BdSPLs基因的啟動(dòng)子分析

為了確定BdSPL基因中包含的順式作用元件,我們分析了這些基因上游啟動(dòng)子部位的1.5 kb DNA序列。結(jié)果(圖7)表明,BdSPL基因啟動(dòng)子區(qū)域包含多種順式元件,可分為激素和脅迫反應(yīng)元件、光響應(yīng)元件和植物生長(zhǎng)發(fā)育元件三類。其中,有47%屬于光反應(yīng)元件。59%的基因含有G-box,推測(cè)BdSPL基因可能受光調(diào)控;88%的BdSPL基因含有與脫落酸反應(yīng)相關(guān)的Abre元件,推測(cè)其參與ABA代謝途徑的調(diào)節(jié);大約58%的BdSPL基因含有ARE、CGTCA-Motif、TGACG-Motif三種元件,推測(cè)其參與厭氧誘導(dǎo)和MeJA介導(dǎo)的反應(yīng)。此外,啟動(dòng)子序列中還有一些與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件,如CAT-box、O2-Site和HD-ZIP-1。推測(cè)BdSPL基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、光調(diào)節(jié)和激素反應(yīng)等生理過(guò)程中發(fā)揮作用。

2.7 BdSPLs基因的表達(dá)分析

為了確定BdSPL基因的組織特異性表達(dá)模式,通過(guò)SRA數(shù)據(jù)庫(kù)分析其在二穗短柄草的9個(gè)組織(葉片、早期花序、出苗花序、花藥、雌蕊、授粉后5 d的種子、授粉后10 d的種子、植物胚胎和胚乳)的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù),并繪制了熱圖。結(jié)果(圖8A)表明,同一亞族的BdSPL基因具有相似的組織表達(dá)模式;其中BdSPL009、-010、-014、-017等12個(gè)基因在花序早期和萌發(fā)組織中高表達(dá),推測(cè)其與花的發(fā)育過(guò)程有關(guān)。BdSPL001、-004、-006等8個(gè)基因主要在雌蕊中表達(dá),BdSPL001、-004、-008和-011在授粉后5 d的種子中表達(dá)。只有少數(shù)基因在授粉后10 d的葉片、種子、植物胚胎或胚乳中表達(dá)水平較高,如BdSPL004、-005和-010。推測(cè)BdSPLs主要參與花的發(fā)育。

圖8 BdSPLs基因在9種組織(A)、8種植物激素和脅迫(B)下的表達(dá)譜

通過(guò)SRA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了14個(gè)BdSPLs在8種植物激素高低水平處理下的表達(dá)數(shù)據(jù)(圖8B)發(fā)現(xiàn),與低濃度激素處理相比,BdSPL基因在高濃度下的表達(dá)一致。例如,BdSPL001、-009和-014在高濃度激素下有較高的表達(dá)水平;在低濃度條件下,BdSPL001和-014被細(xì)胞分裂素、ABA和生長(zhǎng)素等6種植物激素上調(diào),并被GA下調(diào);BdSPL009在生長(zhǎng)素、ABA和GA處理下高表達(dá),但在BR處理下表達(dá)很低。這表明BdSPLs對(duì)低濃度激素處理更敏感。在低濃度植物激素處理下,大多數(shù)基因上調(diào),BdSPL015在ABA處理下高表達(dá),BdSPL002、-005和-006在JA處理下高表達(dá),BdSPL005、-007和-012在乙烯處理下高表達(dá)而BdSPL002、-006、-008、-009、-012和-014等大多數(shù)基因被BR或GA處理下調(diào)。由此認(rèn)為,BdSPLs可以正向調(diào)節(jié)JA和乙烯途徑,負(fù)向調(diào)節(jié)GA和BR途徑。

2.8 BdSPLs基因的表達(dá)分析

為了研究BdSPLs的功能,采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)17個(gè)BdSPLs在四個(gè)組織(根、葉、莖和花序)的表達(dá)模式。從圖9A發(fā)現(xiàn),大多數(shù)BdSPL基因在花序中的表達(dá)高于根、莖和葉;除了BdSPL006、-008、-009和-012外,其余13個(gè)基因在花序中有高水平表達(dá),進(jìn)一步證明BdSPLs與花的發(fā)育密切相關(guān)。BdSPL001、-003和-005等14個(gè)BdSPLs基因在葉中的表達(dá)高于根和莖,表明這14個(gè)基因參與了葉的發(fā)育。BdSPL006和BdSPL012基因在莖中高表達(dá),表明這兩個(gè)基因可能影響莖的發(fā)育。

圖9 17個(gè)BdSPLs基因在4個(gè)組織(A)和5種不同處理(B)下的相對(duì)表達(dá)水平

分析脅迫、溫度、激素5個(gè)不同處理下17個(gè)BdSPLs的表達(dá)水平(圖9B)發(fā)現(xiàn),約有50%的BdSPLs在所有處理下呈下調(diào)趨勢(shì)。例如,GA處理下所有BdSPLs的表達(dá)均下調(diào),ABA處理下85%的BdSPLs表達(dá)下調(diào),PEG處理下94%的BdSPLs表達(dá)下調(diào),低溫下,BdSPL004、-005、-007、-008、-013、-014、-016和-017共8個(gè)基因表達(dá)降低。有少數(shù)BdSPLs基因表達(dá)上調(diào),如BdSPL005、-013、-014和-016在鹽處理下表達(dá)上調(diào),BdSPL009、-011和-012在低溫處理下高表達(dá),BdSPL006、-010和-015在鹽和低溫處理下均表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明,BdSPLs對(duì)GA和ABA處理及干旱處理可能有負(fù)調(diào)控作用。

3 討論

3.1 二穗短柄草中SPL家族基因的特征

本研究采用比較基因組學(xué)的方法,從二穗短柄草全基因組中獲得了17個(gè)BdSPL基因,多于擬南芥(16)[11],但少于玉米(31)[46]、水稻(19)[47]和蕎麥(24)[48]。17個(gè)SPL蛋白序列長(zhǎng)度、分子量及等電點(diǎn)均存在較大的差異,亞細(xì)胞定位其均在細(xì)胞核中,這與上述植物的結(jié)果一致,推測(cè)其功能保守。系統(tǒng)發(fā)育樹將二穗短柄草、擬南芥和水稻的SPL基因分為7個(gè)組,同一組中同源性較高的基因可能具有相似的功能,如B組二穗短柄草BdSPL003和水稻OsSPL010具有較高的同源性,而水稻OsSPL010已被證明參與逆境脅迫響應(yīng)及水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[49],推測(cè)BdSPL003參與二穗短柄草逆境脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育。鑒定到17對(duì)二穗短柄草和水稻的同源SPL基因,但沒(méi)有鑒定出二穗短柄草和擬南芥間的SPL同源基因?qū)?這表明BdSPL基因與水稻的同源性高于擬南芥。本研究發(fā)現(xiàn)5對(duì)BdSPL基因歸因于片段復(fù)制事件,只有1對(duì)BdSPL基因經(jīng)歷了串聯(lián)復(fù)制事件,這與Liu等[48]結(jié)果一致。共線性結(jié)果表明,BdSPLs與小麥的同源基因比水稻和玉米的同源基因更多。

3.2 BdSPLs的結(jié)構(gòu)

基因結(jié)構(gòu)包括外顯子和內(nèi)含子,Xu[50]認(rèn)為,內(nèi)含子和外顯子通過(guò)獲取、丟失、插入或缺失進(jìn)化?；虻慕Y(jié)構(gòu)不僅是影響基因功能的主要因素,也是了解基因家族進(jìn)化的重要基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn),BdSPL基因有2～11個(gè)外顯子,大部分基因含有3個(gè)外顯子。推測(cè)BdSPL基因在進(jìn)化過(guò)程中因?yàn)閮?nèi)含子/外顯子的插入和缺失導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生差異,多數(shù)BdSPL基因有3個(gè)外顯子,表明BdSPL基因較保守。Guo[51]認(rèn)為,生物體中染色體融合或重組的原因之一是基因組進(jìn)化過(guò)程中內(nèi)含子/外顯子數(shù)量的變化,這些變化改變了基因的功能。在本研究中,BdSPL基因內(nèi)含子或外顯子的數(shù)量不同,也影響了二穗短柄草SPL基因的生物學(xué)功能。

在本研究中,在BdSPL蛋白中發(fā)現(xiàn)了15個(gè)基序。Motif 1和motif 2主要編碼SPL結(jié)構(gòu)域,不同的亞族含有特定的保守基序,這與水稻[47]研究結(jié)果一致。特有的基序增加了SPL蛋白功能的多樣性,特定的保守基序是其功能的關(guān)鍵。

3.3 BdSPL基因的潛在功能

在本研究中,大多數(shù)BdSPL基因在花序中高表達(dá),表明BdSPL基因可能對(duì)花的發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。Chao[52]報(bào)道了AtSPL1基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期下游靶基因的表達(dá)增強(qiáng)花序的耐熱性;Liu[48]發(fā)現(xiàn)AtSPL2、-9、-10、-11、-13和-15促進(jìn)了苦蕎從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化,并調(diào)控其花和莖的發(fā)育;Cui[53]報(bào)道AtSPL9縮短了植物的開花時(shí)間,調(diào)節(jié)側(cè)根的生長(zhǎng)。同源基因一般具有相似的功能。在本研究中,進(jìn)化分析結(jié)果表明,AtSPL1和AtSPL12與BdSPL001、-004和BdSPL014高度同源;AtSPL2、-10和-11與BdSPL007、-008高度同源;AtSPL9、-15與BdSPL010、-014和-016密切相關(guān);AtSPL13與屬于A組的BdSPL基因高度同源。許多與上述AtSPL基因同源的BdSPL基因在花序中的表達(dá)水平高于其他三個(gè)組織,表明BdSPL基因可能參與花的發(fā)育。此外,在莖中低表達(dá)的BdSPL006和-012基因與AtSPL13同源,表明這兩個(gè)基因可能參與了莖的發(fā)育。

通過(guò)基因芯片和miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),植物中很多microRNA基因響應(yīng)生物和非生物脅迫,而SPL基因作為microRNA156的靶基因,也在響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[54]。本研究發(fā)現(xiàn),SPL基因在苗期的表達(dá)水平都很低。Wu[55-56]和Wang[57]報(bào)道m(xù)iR156在苗期的表達(dá)水平最高,隨著植物從苗期向成熟期轉(zhuǎn)變,其表達(dá)水平逐漸降低。AtSPL3和AtSPL9的表達(dá)水平在苗期較低,在整個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期逐漸升高。因此,推測(cè)miR156在苗期抑制SPL基因的表達(dá)。17個(gè)BdSPL基因均在GA和ABA脅迫下下調(diào),表明BdSPL基因在GA和ABA介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)中起負(fù)調(diào)控作用。在PEG、鹽和低溫處理下,不同BdSPL基因或上調(diào)或下調(diào)。Cui[53]發(fā)現(xiàn)鹽和干旱處理下調(diào)了AtSPL9的表達(dá),推遲了擬南芥的開花。本研究發(fā)現(xiàn),BdSPL010、-014和-016基因與AtSPL9有很高的同源性,推測(cè)這3個(gè)基因延緩開花時(shí)間。