趙婧，林旭埜，*，陳漢鍶，鄒偉斌

[1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.海泰達(dá)生物科技（廣州）有限公司，廣東 廣州 510630]

牛蛙（Rana catesbeiana）屬于脊索動(dòng)物門(mén)，兩棲綱，蛙科，蛙屬，原產(chǎn)北美，是世界上最著名的大型食用蛙類[1]。牛蛙具有易養(yǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖快、生長(zhǎng)速度快、食性雜、餌料易解決等特點(diǎn)，養(yǎng)殖利潤(rùn)相當(dāng)可觀[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和放養(yǎng)密度的提高，各種病害相繼發(fā)生，并成為牛蛙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個(gè)重大障礙[3]。蛙類病害主要分為細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲(chóng)性疾病[4]。細(xì)菌性疾病主要有由腦膜炎敗血伊麗莎白菌引起的蛙腦膜炎敗血金黃桿菌?。挥墒人a(chǎn)氣單胞菌引起的蛙紅腿?。挥涉溓蚓鸬逆溓蚓?；由腸型點(diǎn)狀氣單胞菌引起的蛙腸胃炎病等。真菌性疾病主要有由多種水霉引起的水霉病等；寄生蟲(chóng)性疾病主要有蛙車輪蟲(chóng)病、纖毛蟲(chóng)病等。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）為革蘭陰性菌，屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（klebsiella），分3 個(gè)亞種：肺炎亞種（subsp.pneumoniae）、鼻炎亞種（subsp.azaenae）和鼻硬結(jié)亞種（subsp.rhinoscleromatis）。由Friediander 于1893年從患大葉性肺炎病人的肺組織中首次分離到[5]。兼性厭氧，氧化酶為陰性[6]，能夠引起動(dòng)物肺炎、腸炎、腦膜炎和敗血癥等嚴(yán)重疾病，也是一種重要的人獸共患病原菌[7]。

米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola, EMI）為屬于黃桿菌綱（Flavobacteria）黃桿菌目（Flavobacteriales）黃桿菌科（Flavobacteriaceae）伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）細(xì)菌，該屬下還有腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica, EME）、按蚊伊麗莎白菌（Elizabethkingia anophelis, EAN）和植物內(nèi)生伊麗莎白菌（Elizabethkingia endophytica, EEN）。米爾伊麗莎白菌（EMI）于2003 年在和平空間站冷凝水中被首次發(fā)現(xiàn)，為革蘭陰性非發(fā)酵細(xì)菌[8]。

近期，江門(mén)市某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)流行一種疾病，患病蛙出現(xiàn)頭向一側(cè)歪斜、運(yùn)動(dòng)遲緩、在水中旋轉(zhuǎn)、眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜、食欲廢絕等癥狀，甚至死亡。為探明牛蛙病因，現(xiàn)通過(guò)分離鑒定患病牛蛙的病原，觀察致病菌感染牛蛙后的組織病理學(xué)變化，并對(duì)分離菌株的耐藥性和致病性進(jìn)行試驗(yàn)，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 時(shí)間與地點(diǎn)

2023 年4—5 月，試驗(yàn)地位于廣州市天河區(qū)暨南大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)大廈四樓。

1.2 材料

從廣東省江門(mén)市某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，取有歪頭白眼等癥狀的病蛙，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即解剖，對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。再選擇80 只健康牛蛙，開(kāi)展動(dòng)物感染試驗(yàn)。

1.3 試劑和儀器

血瓊脂平板（自廣州環(huán)凱微生物有限公司）、生化編碼鑒定盒（環(huán)凱微生物有限公司）、抗生素藥敏片（杭州微生物試劑有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病原菌的分離、純化培養(yǎng)

在生物安全柜中進(jìn)行細(xì)菌分離。隨機(jī)選取具有典型癥狀的病蛙，解剖前用75%乙醇消毒全身。將剪刀加熱消毒處理后，用剪刀背面烙烤嚴(yán)重病變組織表面，再用剪刀剪開(kāi)組織，將無(wú)菌接種環(huán)伸入切口，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，蘸取病蛙的腦和內(nèi)臟組織，劃線于血瓊脂平板上，培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察分離細(xì)菌的菌落形態(tài)。挑取優(yōu)勢(shì)菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)，用于形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析、分子鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將分離得到的各菌株，分別進(jìn)行革蘭染色，并在顯微鏡下觀察、記錄下菌落的形態(tài)特點(diǎn)。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 基因分子鑒定

分別提取分離得到的優(yōu)勢(shì)菌基因組的DNA，對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增。16S rRNA 基因上游引物為：5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物為：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。反應(yīng)條件：95 ℃1 min；98 ℃15 s；55 ℃30 s；72 ℃2 min；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證為目的片段大小后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司純化和測(cè)序。測(cè)序得到的基因序列在NCBI 中進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)屬種的16S rRNA 基因序列，找到相似性較高的菌株，用MEGA11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2.3.2 生理生化鑒定

分離得到的菌株生理生化指標(biāo)，采用生化編碼鑒定盒進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)目為山梨醇、纖維二糖、棉籽糖、蛋白胨水、西蒙氏檸檬酸鹽、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、半固體瓊脂、葡萄糖、硫化氫、乳糖、尿素、七葉苷、甘露糖、阿拉伯糖、氰化鉀生長(zhǎng)試驗(yàn)管，觀察試驗(yàn)結(jié)果。生化編碼鑒定盒均購(gòu)自環(huán)凱微生物有限公司，操作方法詳見(jiàn)該試劑盒說(shuō)明書(shū)，參照常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[9]中細(xì)菌生理生化指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，檢測(cè)菌株藥物敏感性。首先將分離得到的菌株，分別接種于LB 液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后，于8 000 r/min 離心10 min 沉淀菌體，用無(wú)菌PBS 稀釋菌體至0.5 mcf，取20 μL 菌懸液均勻涂布于LB 固體平板上，待菌液被吸收后，向培養(yǎng)基貼不同抗生素藥敏紙片，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，并根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏試劑判斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定結(jié)果。

2.5 動(dòng)物感染試驗(yàn)

選擇80 只健康牛蛙，試驗(yàn)前在養(yǎng)殖箱里暫養(yǎng)2 周，每天換1 次水，水溫保持在25～28 ℃，正常投喂商品飼料，設(shè)置4 框，每框20 只。將純化后分離得到的菌株，分別接種到LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水將菌株配置成1×106cfu/mL 的菌懸液。

將牛蛙隨機(jī)分為3 個(gè)感染組和1 個(gè)陰性對(duì)照組，每組20 只。將分離得到的菌株的菌懸液和分離得到的菌株的混合菌懸液，分別注射到3 個(gè)感染組的健康牛蛙腹腔，劑量為0.2 mL/只，每組注射20 只，陰性對(duì)照組則腹腔注射無(wú)菌PBS緩沖液（0.2 mL/只）。每日觀察，記錄牛蛙發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察20 d。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原菌的分離、純化培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

將感染的病蛙樣品，接種于血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，從病蛙體內(nèi)不同組織處取樣，均分離到2種形態(tài)的優(yōu)勢(shì)菌落，見(jiàn)圖1（a）（b）。

圖1 病料接種在培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

由圖1 可見(jiàn)，一種菌落呈淡黃色，圓形至橢圓形不等，略隆起，表面光滑，另一種菌落呈灰白色，多突起、質(zhì)地黏稠，挑起時(shí)更易呈拉絲狀。將分離菌進(jìn)行革蘭染色后，于普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2（a）（b）。

圖2 分離細(xì)菌革蘭染色鏡檢結(jié)果

由圖2 可見(jiàn)，菌體均呈紅色，可初步判斷分離細(xì)菌均為革蘭陰性菌；一種分離菌呈短桿狀比較分散的排列，另一種分離菌呈兩端較鈍的短粗球桿狀較連續(xù)的排列。將分離菌均接種于常見(jiàn)的細(xì)菌分離培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7 d，未見(jiàn)其他微生物生長(zhǎng)。將純化后的細(xì)菌命名為JM2023A 株和JM2023B 株。

3.2 病原菌鑒定

3.2.1 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增JM2023A 株和JM2023B株的16S rRNA 基因，擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出1 600 bp 左右的目的條帶（圖3），將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用JM2023A 株與GenBank 中同源性比較高的米爾伊麗莎白菌屬的16S rRNA 序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，再用JM2023B 株與GenBank 中同源性比較高的克雷伯菌屬的16S rRNA 序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。JM2023A 株與米爾伊麗莎白菌聚為一支，JM2023B株與肺炎克雷伯菌聚為一支。

圖3 JM2023A 株和JM2023B 株的擴(kuò)增結(jié)果

圖4 JM2023A 株的16s rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 JM2023B 株的16s rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.2.2 生理生化鑒定

利用細(xì)菌微量生化鑒定管，對(duì)分離株JM2023A株和JM2023B 株進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)比對(duì)見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[9]。由表1 可見(jiàn)，分離株JM2023A 株的生化指標(biāo)與米爾伊麗莎白菌一致，分離株JM2023B 株的生化指標(biāo)與肺炎克雷伯菌一致。結(jié)合JM2023A 株和JM2023B 株的理化特性與基因分析結(jié)果，綜合判定JM2023A 株為米爾伊麗莎白菌，JM2023B 株為肺炎克雷伯菌。

表1 JM2023A 株和JM2023B 株的生化鑒定結(jié)果①

3.3 藥敏試驗(yàn)

對(duì)30種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，JM2023A 株對(duì)多黏菌素B 敏感；對(duì)多西環(huán)素、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢拉定、哌拉西林中度敏感；對(duì)其他抗生素表現(xiàn)為耐藥。JM2023B 株對(duì)頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林中度敏感；對(duì)其他抗生素表現(xiàn)為耐藥。

表2 JM2023A 株和JM2023B 株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將注射JM2023A 菌懸液的命名A 組，注射JM2023B 菌懸液的命名B 組，注射JM2023A 和JM2023B 混合菌懸液的命名C 組，注射無(wú)菌PBS 緩沖液的命名D 組。試驗(yàn)中，A、B、C 3 組的牛蛙均出現(xiàn)不同程度死亡，A 組蛙出現(xiàn)皮膚變黑、頭向一側(cè)歪斜、在水中旋轉(zhuǎn)、眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜、食欲下降等癥狀，死亡率70%；B 組蛙出現(xiàn)眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜、厭食懶動(dòng)，應(yīng)急能力差、身體失去平衡等癥狀，死亡率15%；C 組蛙出現(xiàn)皮膚變黑、眼睛表面出現(xiàn)白色薄膜、厭食懶動(dòng)、游動(dòng)時(shí)身體打轉(zhuǎn)、應(yīng)急能力差等癥狀，死亡率90%；而D 組未見(jiàn)患病蛙或者死亡蛙，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從A 組感染發(fā)病牛蛙組織中再次分離出的病原菌經(jīng)鑒定為米爾伊麗莎白菌，從B 組感染發(fā)病牛蛙組織中再次分離出的病原菌經(jīng)鑒定為肺炎克雷伯菌，從C 組感染發(fā)病牛蛙組織中再次分離出的病原菌經(jīng)鑒定為米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌?？梢?jiàn)本次回歸試驗(yàn)符合科赫氏法則。

表3 動(dòng)物回歸試結(jié)果

4 討論

近年來(lái)，養(yǎng)殖戶為了追求高額利潤(rùn)加大了養(yǎng)殖密度，使水體承載能力加大，同時(shí)也加大了投餌率，導(dǎo)致水體受到嚴(yán)重污染，各種病害微生物大量繁殖，溫度升高，導(dǎo)致各種病害加大，如蛙的歪頭病、白內(nèi)障病、紅腿病、腹水病等[10]，其中歪頭病、白內(nèi)障病是近年來(lái)養(yǎng)殖蛙類危害最大的病害之一。

本試驗(yàn)從患病牛蛙內(nèi)臟中分離純化出2 株疑似菌，通過(guò)觀察菌落形態(tài)、革蘭染色、藥敏試驗(yàn)、生化鑒定、16S rDNA 基因檢測(cè)、構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)等，鑒定為米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌，回歸試驗(yàn)感染后，可見(jiàn)引起歪頭和白內(nèi)障等癥狀，證實(shí)了2種菌可引起牛蛙歪頭白內(nèi)障病。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，米爾伊麗莎白菌株對(duì)多黏菌素B 敏感；對(duì)多西環(huán)素、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢拉定、哌拉西林中度敏感；對(duì)其他抗生素表現(xiàn)為耐藥。肺炎克雷伯菌株僅對(duì)頭孢他啶、頭孢呋辛、哌拉西林中度敏感；對(duì)其他抗生素表現(xiàn)為耐藥。2 個(gè)菌株均具有較強(qiáng)的耐藥性，肺炎克雷伯菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，與周蓉等[11-12]的試驗(yàn)結(jié)果差異較大。可見(jiàn)不同地區(qū)肺炎克雷伯菌耐藥性有一定的差異，原因可能是不同地區(qū)臨床中用于治療肺炎克雷伯菌引起的疾病，常用藥物存在差異導(dǎo)致，同時(shí)表明，肺炎克雷伯菌的耐藥性在增加，可能是由于抗生素使用不當(dāng)引起。這種變化趨勢(shì)，對(duì)該菌的臨床治療和控制帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，建議在臨床防治牛蛙歪頭白內(nèi)障病時(shí)，不選用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明令禁止使用的氯霉素、呋喃唑酮等藥物[13]，并且依據(jù)藥敏結(jié)果，選擇合適的抗生素，采用交叉及聯(lián)合用藥等方式，避免濫用抗生素，加強(qiáng)臨床用藥監(jiān)管，以降低細(xì)菌的耐藥率[14]。同時(shí)視情況可以考慮采用非抗生素依賴性手段，例如疫苗。據(jù)周永燦等[15]的研究結(jié)果，接種白內(nèi)障病蛙中分離的病菌制備的滅活疫苗，對(duì)有效預(yù)防該病的發(fā)生確實(shí)具有十分良好的效果。

動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B、C3 組菌液在注射試驗(yàn)蛙后，同樣出現(xiàn)了白內(nèi)障，歪頭等現(xiàn)象，且都具有一定的致病性，但程度不同。確定了米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌是其致病菌，也確定了江門(mén)市某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)疾病暴發(fā)的主要原因，是感染了細(xì)菌性病原菌。A 組注射米爾伊麗莎白菌液的試驗(yàn)蛙死亡率70%；B 組注射肺炎克雷伯菌液的試驗(yàn)蛙死亡率15%；C 組注射米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌混合菌液的實(shí)驗(yàn)蛙死亡率90%；而D 組注射PBS未見(jiàn)患病蛙或者死亡蛙。可見(jiàn)米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌均可導(dǎo)致牛蛙患歪頭白內(nèi)障病死亡，其中米爾伊麗莎白菌為主要致病菌。而米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌共同致病時(shí)，死亡率相較于2 個(gè)菌單獨(dú)作用時(shí)，有明顯升高趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2種菌共同致病時(shí)，有協(xié)同作用。建議在臨床上，選擇對(duì)2種菌均有效的治療方案。

5 結(jié)論

通過(guò)菌落形態(tài)、生化特性、基因序列、藥敏性、致病性等方面試驗(yàn)，分離得到病原菌，確定了江門(mén)市某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)牛蛙歪頭白內(nèi)障病的病原為米爾伊麗莎白菌和肺炎克雷伯菌。2種菌均對(duì)多數(shù)抗生素耐藥，共同致病時(shí)，具有協(xié)同作用，對(duì)牛蛙具有比各自單獨(dú)致病時(shí)更高的致死率。