陳 勇，楊青通，曹高寨，李 強(qiáng)，姚珍珍，邵亞群

1 寧波三生生物科技股份有限公司，浙江寧波 315171

2 新鄭市亞峰奶牛場(chǎng)，河南鄭州 451162

3 鄭州牧之堂獸藥有限公司，河南鄭州 452370

0 引言

黃體酮為脂溶性孕激素，除眾所周知的保胎、對(duì)抗雌激素抑制發(fā)情排卵外，還有更重要的作用和應(yīng)用。目前黃體酮在奶牛繁殖管理中主要用于定時(shí)輸精處理，在同期排卵（Ovsynch）流程前7 天提高優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育期間的孕酮水平，可確保優(yōu)勢(shì)卵泡中卵母細(xì)胞質(zhì)量，使之排卵后獲得高質(zhì)量卵子，繼而在受精后形成存活能力強(qiáng)的胚胎，減少后續(xù)整個(gè)妊娠期的妊娠損失率[1～4]。同時(shí)該階段內(nèi)的高孕酮水平還可通過(guò)負(fù)反饋對(duì)GnRH合成分泌產(chǎn)生抑制，減少兩個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡共生現(xiàn)象，最終通過(guò)減少雙排卵反應(yīng)，控制實(shí)際生產(chǎn)中的雙胎率[5～7]。

另外，奶牛受精后的14 天是胚胎和母體建立聯(lián)系的關(guān)鍵時(shí)期，如能提高體內(nèi)孕酮水平、降低雌二醇水平，可提高后續(xù)妊娠成功率[8]。

奶牛注射黃體酮后血藥濃度迅速升高，超出生理水平，并通過(guò)血乳屏障比例升高，使進(jìn)入牛奶中的孕酮量增加。經(jīng)代謝血藥濃度快速下降，注射給藥黃體酮血藥濃度波動(dòng)大、不穩(wěn)定[1，9]。出于食品安全考慮，目前注射劑型黃體酮已在泌乳期禁用[10]。實(shí)際生產(chǎn)中使用制劑為黃體酮硅膠緩釋栓，是以尼龍為骨架，以醫(yī)用硅膠為載體，將黃體酮按適當(dāng)比例置于熔化的醫(yī)用硅膠內(nèi)，經(jīng)混勻、冷卻后形成含有黃體酮的硅膠膜，之后包裹于骨架外。每支孕酮栓內(nèi)含黃體酮1.38 g[11～13]。黃體酮硅膠緩釋栓放置于奶牛陰道內(nèi)，硅膠膜內(nèi)的黃體酮通過(guò)緩釋微孔持續(xù)緩慢釋放，并通過(guò)陰道黏膜吸收進(jìn)入體內(nèi)而發(fā)揮作用[14，15]。黃體酮硅膠緩釋栓的主要應(yīng)用方案是在Ovsynch流程中的前7 天或前5 天（后備牛0568流程），提高該期間優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育過(guò)程中的孕酮水平，從而提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和排卵后卵子質(zhì)量，使之在受精后產(chǎn)生存活能力較強(qiáng)的胚胎，以及在輸精后第14天前后提高奶牛體內(nèi)孕酮水平，提高子宮內(nèi)環(huán)境，使胚胎安全度過(guò)與母體產(chǎn)生聯(lián)系的關(guān)鍵時(shí)期，提高妊娠成功率[16～19]。

本次試驗(yàn)對(duì)比選擇奶牛繁殖管理的兩個(gè)階段，進(jìn)行原研孕酮栓和喜達(dá)栓的7 天和累計(jì)14 天的放置，對(duì)比藥物釋放量、體內(nèi)孕酮水平變化及其他繁殖數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

注射用戈那瑞林（生源）、氨基丁三醇前列腺素F2α（諦諾）、黃體酮硅膠緩釋栓（喜達(dá)：黃體酮含量1.38 g/支），寧波三生生物科技股份有限公司；黃體酮硅膠緩釋栓（黃體酮含量1.38 g/支），進(jìn)口原研產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和分組

本次試驗(yàn)分兩組，第1組選取牧場(chǎng)正常參配牛22 頭，隨機(jī)按照耳標(biāo)編號(hào)末位數(shù)奇偶數(shù)分為兩組，兩組牛的產(chǎn)后天數(shù)、配次、胎次、產(chǎn)量等基礎(chǔ)狀況平衡基本一致，飼養(yǎng)在同一牛舍、同一組內(nèi)。耳標(biāo)奇數(shù)組為試驗(yàn)組，使用喜達(dá)栓；耳標(biāo)偶數(shù)組為對(duì)照組，使用原研孕酮栓。第2組，緩釋栓的第2次利用，在第1組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)選取輸精后11 天的奶牛，按照耳標(biāo)編號(hào)末位數(shù)奇偶數(shù)隨機(jī)分為兩組，兩組牛的產(chǎn)后天數(shù)、配次、胎次、產(chǎn)量等基礎(chǔ)狀況平衡，基本一致，飼養(yǎng)在同一牛舍、同一組內(nèi)。偶數(shù)組為試驗(yàn)組，采用使用過(guò)1 次（7 天）的喜達(dá)栓；奇數(shù)組為對(duì)照組，采用使用過(guò)1 次（7 天）的原研孕酮栓。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 第一次使用對(duì)比

具體處理：6月12日上午7點(diǎn)，牧場(chǎng)產(chǎn)后符合定時(shí)輸精處理及檢胎空懷牛，剔除流產(chǎn)、乳房炎、腹瀉、蹄病等臨床發(fā)病牛及不正產(chǎn)牛后，剩余健康牛22 頭參與試驗(yàn)。按照耳標(biāo)號(hào)的奇、偶數(shù)分組，奇數(shù)（喜達(dá)栓）組12 頭，偶數(shù)（原研孕酮栓）組10 頭。采用Ovsynch流程處理，在0 天（6月12日）注射GnRH，同時(shí)根據(jù)分組放置不同廠(chǎng)家的黃體酮硅膠緩釋栓，放栓前牛體外陰用75%酒精噴灑消毒，紙巾擦干，石蠟油做潤(rùn)滑劑。放栓前牛尾中央靜脈采血5 mL，分離提取血清后冷凍保存。放栓48 h后（6月14日）所有試驗(yàn)牛再次經(jīng)尾中央靜脈采血5 mL，分離提取血清后冷凍保存；7 天后（6月19日）上午7點(diǎn)試驗(yàn)牛撤除硅膠栓，同時(shí)注射氨基丁三醇前列腺素F2α5 mL，并經(jīng)尾中央靜脈采血5 mL，分離提取血清后冷凍保存。將撤除的兩組硅膠栓各隨機(jī)選取兩枚送往檢測(cè)機(jī)構(gòu)，檢測(cè)栓內(nèi)黃體酮?dú)埩舯壤?月21日下午3點(diǎn)，試驗(yàn)牛注射GnRH100 μg，6月22日上午7點(diǎn)所有試驗(yàn)牛定時(shí)輸精，之后按照牧場(chǎng)繁殖管理流程發(fā)情揭發(fā)和檢胎。處理流程見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)牛同期處理-定時(shí)輸精流程

1.3.2 第二次使用對(duì)比

具體處理：6月19日，將撤除的黃體酮緩釋栓用流水洗刷干凈，尤其是緩釋栓定位孔內(nèi)的分泌物，擦干后放置于0.1%新潔而滅溶液浸泡30 min左右。選取輸精后11 天的已配待檢牛，按照耳標(biāo)編號(hào)的奇偶數(shù)分組，本次偶數(shù)組放置喜達(dá)栓，奇數(shù)組放置原研黃體酮緩釋栓。在放置緩釋栓前，于尾中央靜脈采血5 mL，分離提取血清后冷凍保存，48 h后（6月21日）試驗(yàn)牛再次從尾中央靜脈采血5 mL，分離提取血清后冷凍保存。7 天后（6月26日）試驗(yàn)牛再次從尾中央靜脈采血5 mL，分離血清后冷凍保存，并撤除黃體酮緩釋栓，之后按照牧場(chǎng)繁殖管理流程發(fā)情揭發(fā)和檢胎。撤除的兩組硅膠栓及收集的所有血清送往檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)栓內(nèi)黃體酮?dú)埩舯壤?/p>

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)過(guò)程中如有發(fā)病牛則剔除試驗(yàn)，如在檢胎前未返情淘汰的奶牛剔除試驗(yàn)受胎率的對(duì)比，但放栓過(guò)程血中黃體酮濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)仍參與相關(guān)分析對(duì)比。檢胎前返情牛記錄為空懷牛，參與情期受胎率的數(shù)據(jù)對(duì)比，血中黃體酮濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)參與相關(guān)分析對(duì)比。

參與試驗(yàn)的牛群中無(wú)發(fā)病、淘汰牛。血中黃體酮濃度變化、受胎率、栓內(nèi)黃體酮?dú)埩袈实葦?shù)據(jù)經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析組間差異度。P＞0.05差異不顯著，P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果及分析

試驗(yàn)牛血清使用熒光試劑盒檢測(cè)黃體酮濃度，單位為mmol/mL，撤下的黃體酮緩釋栓使用液相檢測(cè)法測(cè)定栓內(nèi)黃體酮含量。兩種硅膠緩釋栓在兩組試驗(yàn)中撤栓時(shí)都有白色分泌物，無(wú)差異。該現(xiàn)象為陰道黏膜的正常排異反應(yīng)，未特殊處理。所有奶牛在輸精后28～34 天采血，做配后初次妊娠診斷。

2.1 不同孕酮栓處理后對(duì)奶牛體內(nèi)孕酮水平的影響

不同黃體酮緩釋栓使用后孕酮血藥濃度變化、受胎等數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。兩組奶牛放栓前以及放栓過(guò)程中孕酮水平的變化趨勢(shì)均無(wú)差異（P＞0.05）；受胎率對(duì)比：喜達(dá)栓組受胎率50%（6/12），原研孕酮栓組受胎率20%（2/10），無(wú)顯著差異（P＞0.05）；空懷牛返情率對(duì)比：喜達(dá)組未孕牛返情率50%（3/6），原研孕酮栓組未孕牛返情率37.5%（3/8），差異不顯著（P＞0.05）。

表2 孕酮栓處理后奶牛體內(nèi)孕酮變化及結(jié)果 單位：mmol/mL

經(jīng)黃體酮緩釋栓處理后孕酮上升比例較大。因試驗(yàn)過(guò)程未檢查卵巢，不能明確處理之初及過(guò)程中卵巢功能性結(jié)構(gòu)變化。但根據(jù)黃體酮緩釋栓處理之初和處理過(guò)程中體內(nèi)孕酮水平變化可推斷，處理之初3 頭牛卵巢應(yīng)該不存在有效黃體，并且在注射GnRH后也未發(fā)生排卵繼而產(chǎn)生有效黃體，所以7 天后黃體酮緩釋栓處理結(jié)束后體內(nèi)孕酮水平的變化主要?dú)w功于黃體酮緩釋栓的使用，但撤栓時(shí)會(huì)有所回落。這是因?yàn)樗ㄡ尫诺脑型?jīng)陰道黏膜吸收后會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)孕酮水平升高，尤其是初期栓表面的孕酮較容易游離釋放，而相對(duì)較深層孕酮釋放速率下降，陰道表面可吸收孕酮量隨之減少[20]，所以后續(xù)體內(nèi)孕酮水平回落。

另外，開(kāi)始試驗(yàn)處理時(shí)體內(nèi)孕酮水平處于較低水平（＜2 mmol/mL）的8 頭牛（含＜0.67 mmol/mL的3頭牛），處理過(guò)程孕酮水平持續(xù)升高的3 頭牛中兩頭為產(chǎn)后首配牛（泌乳天數(shù)45 天、57 天）。該群體開(kāi)始處理時(shí)多數(shù)為卵巢靜止或處于性周期活動(dòng)的非黃體期，7 天黃體酮緩釋栓處理結(jié)束時(shí)處于黃體（早）期。該群體總體有效（受胎或自然返情都視為有效）率尚可，有效率為50%，可見(jiàn)黃體酮緩釋栓對(duì)卵巢機(jī)能調(diào)整結(jié)果較理想。該群體相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 開(kāi)始處理時(shí)較體內(nèi)低孕酮水平群體統(tǒng)計(jì) 單位：mmol/mL

2.2 兩種黃體酮緩釋栓二次利用對(duì)比

所有奶牛在輸精后28～34 天采血，做配后初次妊娠診斷，結(jié)果見(jiàn)表4。兩組數(shù)據(jù)體內(nèi)孕酮水平變化過(guò)程、受胎率、空懷牛返情率等，差異不顯著（P＞0.05）。在放置黃體酮栓7 天后撤栓時(shí)為輸精后的第18天（6月26日），初檢空懷牛輸精后18 天時(shí)的孕酮水平，較輸精后11 天（6月19日）或13 天（6月21日）多數(shù)呈顯著下降趨勢(shì)。由于體內(nèi)有黃體酮緩釋栓持續(xù)釋放孕酮，使空懷奶牛輸精的第后18 天時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)體內(nèi)孕酮水平過(guò)低（＜2 mmol/mL）。輸精后11 天孕酮仍處于低水平（＜21 mmol/mL）的奶牛，初檢都空懷，可見(jiàn)輸精后14 天左右胚胎與母體建立聯(lián)系的關(guān)鍵時(shí)期體內(nèi)孕酮水平的高低與之后的妊娠成功率相關(guān)性極大。如果輸精后14 天左右奶牛遭受應(yīng)激或健康問(wèn)題，黃體功能受損或之前黃體功能不足及黃體發(fā)育不良等，導(dǎo)致體內(nèi)孕酮水平?jīng)]有足夠高或降低，都會(huì)妊娠失敗[21，22]。

表4 黃體酮緩釋栓第2 次使用后血中孕酮水平變化和受胎情況 單位：mmol/mL

本試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)測(cè)定的體內(nèi)孕酮水平為發(fā)情后11天的黃體分泌孕酮能力所致，明顯較Ovsynch流程放置黃體酮栓處理7 天時(shí)體內(nèi)孕酮水平高，與泌乳期奶牛性周期體內(nèi)孕酮水平變化規(guī)律一致：排卵后隨黃體生成和發(fā)育，體內(nèi)孕酮水平逐漸升高，至性周期的14 天時(shí)為7 天時(shí)的2 倍左右。

從喜達(dá)栓首次使用7 天結(jié)束時(shí)奶牛體內(nèi)孕酮水平、奶牛輸精后11 天時(shí)自身黃體產(chǎn)生孕酮導(dǎo)致體內(nèi)孕酮水平對(duì)比看，放置黃體酮緩釋栓的奶牛體內(nèi)孕酮濃度極顯著低于自身黃體所產(chǎn)生的孕酮濃度（P＜0.001），證明使用黃體酮緩釋栓在食品安全是有保障的[10]。

2.3 兩種緩釋栓的黃體酮?dú)埩袈剩ㄡ尫判剩?duì)比

將使用過(guò)7 天、14 天的黃體酮緩釋栓做栓內(nèi)黃體酮?dú)埩袅繖z測(cè)，計(jì)算各次使用后的殘留率，結(jié)果如表5所示，兩種黃體酮緩釋栓經(jīng)兩次使用后栓內(nèi)黃體酮?dú)埩袈蕦?duì)比差異不顯著（P＞0.05）。

表5 兩種黃體酮緩釋栓使用后的孕酮?dú)埩袈剩ɑ鶖?shù)以1.38 g 計(jì)）

黃體酮緩釋栓第1 次使用后釋放比例為32%～38%，第2次使用后釋放比例為20%～28%，與緩釋栓深層次部位黃體酮釋放困難度增加相關(guān)。放栓后黃體酮釋放速率呈先高后低的“衰減”模式，這也與生產(chǎn)中第2次使用孕酮栓時(shí)的受胎率較新栓會(huì)降低的實(shí)際狀況一致。

本次試驗(yàn)未孕牛的返情率較低，兩組試驗(yàn)牛初檢時(shí)懷孕率為50%（15/30），初檢情期受胎率為39.47%（15/38），與當(dāng)時(shí)嚴(yán)重的熱應(yīng)激和牧場(chǎng)防暑降溫工作不利等因素相關(guān)[23，24]。但熱應(yīng)激相對(duì)較輕的試驗(yàn)前兩周的返情率相似，初檢檢出率為47.73%（21/44），初檢情期受胎率為33.87%（21/62）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)使用喜達(dá)栓對(duì)比原研孕酮栓產(chǎn)品，從放栓后體內(nèi)孕酮水平變化、受胎率、空懷牛返情率、各自使用后栓內(nèi)黃體酮?dú)埩舯壤葦?shù)據(jù)看，兩種黃體酮緩釋栓無(wú)差異。喜達(dá)栓在實(shí)際生產(chǎn)中可以替代同類(lèi)原研孕酮栓產(chǎn)品。

兩種孕酮緩釋栓的二次利用期間所釋放孕酮量都顯著低于新栓使用期間的釋放量，因此在生產(chǎn)中不建議二次使用。