王建中，張 恒，李曉光，王 剛，張廷青

1 中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801

2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450046

3 杭州愛謹(jǐn)生物科技有限公司，浙江杭州 310018

4 內(nèi)蒙古蒙潤吉牛農(nóng)牧有限公司，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000

0 引言

新孢子蟲?。∟eospora caninum）是因犬新孢子蟲寄生于犬、牛、羊等多種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲病，但并非人畜共患傳染病。其嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)，主要造成母牛流產(chǎn)和死胎，以及新生犢牛運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該病可垂直傳播感染，即帶蟲母?？蓪⑾x體直接傳染給新生犢牛。犬新孢子蟲可污染奶牛場(chǎng)飼料和水源，同時(shí)犬新孢子蟲亦可在野生動(dòng)物中自然循環(huán)，因無疫苗和有效藥物預(yù)防和治療犬新孢子蟲病，故維持自繁封閉牛群并不能保證免受感染。因此，犬新孢子蟲病是全球最普遍和最難控制的牛流產(chǎn)病原之一。國外早已證實(shí)該病是造成養(yǎng)牛業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的重要原因之一。每年美國奶牛養(yǎng)殖業(yè)和肉牛養(yǎng)殖業(yè)因犬新孢子蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失分別達(dá)到5.46 億美元和1.11 億美元[1]。

近年來，我國許多養(yǎng)殖企業(yè)積極從智利和烏拉圭引進(jìn)數(shù)量可觀的育種奶牛和肉牛，這兩個(gè)南美國家城市、農(nóng)村的大街小巷到處可見流浪狗，奶牛場(chǎng)和肉牛場(chǎng)亦不例外，這不可避免造成牛群犬新孢子蟲的感染。但目前犬新孢子蟲感染并未納入我國活畜進(jìn)口檢疫條款，所以從智利和烏拉圭運(yùn)回的牛群攜帶犬新孢子蟲是常態(tài)現(xiàn)象，這點(diǎn)亦被出口國的當(dāng)?shù)孬F醫(yī)證實(shí)。本文在此提醒進(jìn)口這些地區(qū)牛的奶牛場(chǎng)和肉牛場(chǎng)，應(yīng)時(shí)刻警惕犬新孢子蟲導(dǎo)致的流產(chǎn)。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉群教授曾在國內(nèi)率先開展該病研究，證明犬新孢子蟲病在我國奶牛群體感染普遍，一般妊娠5～7月期間可能爆發(fā)大規(guī)模流產(chǎn)[2]。鑒于國內(nèi)大部分奶牛場(chǎng)對(duì)犬新孢子蟲感染危害認(rèn)識(shí)不足或根本無知，本文特以內(nèi)蒙古巴彥淖爾蒙潤吉牛農(nóng)牧有限公司杭錦后旗太陽廟農(nóng)場(chǎng)三分場(chǎng)（簡(jiǎn)稱“三分場(chǎng)”）發(fā)生的犬新孢子蟲病為例，簡(jiǎn)述牛犬新孢子蟲病的臨床癥狀、診斷和預(yù)防措施，為奶牛犬新孢子蟲流產(chǎn)診療防提供參考。

1 牛場(chǎng)基本情況

三分場(chǎng)全群3 356 頭牛，其中泌乳牛1 384 頭（全部為智利進(jìn)口牛），全場(chǎng)總共54 名員工。接助產(chǎn)成活率上半年96.6%；哺乳犢牛留養(yǎng)成活率上半年95.6%；現(xiàn)日均產(chǎn)奶量34 kg/頭。大罐奶體細(xì)胞數(shù)8 萬個(gè)/mL；大罐奶微生物0.7 萬CFU/mL；月臨床乳房炎發(fā)病率上半年平均0.87%。

三分場(chǎng)奶牛臨床癥狀和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果：奶牛頭胎牛流產(chǎn)率（妊娠5～7 月）平均0.60%，最近統(tǒng)計(jì)流產(chǎn)率＞1%；妊娠5～7 月經(jīng)產(chǎn)牛月流產(chǎn)率為2.6%。胚胎丟失率1%左右。患病犢牛未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)癥狀，口腔可視黏膜和齒齦潰瘍、出血和充血。有患病犢牛雙眼球凸出，呈長(zhǎng)時(shí)間呼吸喘癥狀。全群無布病感染。此外，患病犢牛呈現(xiàn)嚴(yán)重神經(jīng)癥狀的時(shí)間分別是6日齡、7日齡（死亡）、18日齡（死亡）和28日齡（死亡），如圖1。

圖1 三分場(chǎng)初生犢牛呈現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀（瘋狂啃咬鐵絲欄、拼命哞叫、后肢外展、共濟(jì)失調(diào)、盲目轉(zhuǎn)圈、肢蹄軟弱等）

2 犢牛犬新孢子蟲的鑒別診斷

犢牛（2月齡內(nèi)）感染犬新孢子蟲、牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）和牛病毒性腹瀉（Bovine Virus Diarrhea，BVD）均可能臨床呈現(xiàn)：神經(jīng)癥狀、體重過輕、站立困難、共濟(jì)失調(diào)、膝反射降低、本體感意識(shí)喪失、兩眼不對(duì)稱和腦積水或無任何臨床癥狀。

在鑒別診斷上，可通過問診早期胚胎死亡率高低、臨床檢視是否存在口腔黏膜和齒齦充血、出血和潰瘍，以及鼻鏡和鼻孔黏膜是否存在發(fā)紅和潰瘍，即可大致做出正確診斷。

與硝酸鹽中毒、沙門氏菌病或鉤端螺旋體病等所致流產(chǎn)不同，犬新孢子蟲流產(chǎn)與母牛當(dāng)前或近期系統(tǒng)性疾病史并無關(guān)聯(lián)。通常，破解流產(chǎn)成因最好做全面檢查，而不是挑出任何單一可能原因無窮止深究。牛群流產(chǎn)率明顯升高的成因相對(duì)容易成功破解。相反，牛群流產(chǎn)問題輕微的成因不易破解，調(diào)查分析數(shù)據(jù)包括檢測(cè)結(jié)果，往往無法做出準(zhǔn)確判定，而且事倍功半、過于麻煩和費(fèi)用昂貴。

牛群正常流產(chǎn)率是多少？美國國家動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)服務(wù)局（2007）建議，奶牛年流產(chǎn)率為2.0%，盡管以往認(rèn)為高達(dá)5.0%的流產(chǎn)率是正常的。目前，美國全國奶牛成母牛平均流產(chǎn)率為5.0%，青年牛平均流產(chǎn)率為3.3%。另外，肉牛成母牛正常流產(chǎn)率為0.5%，青年牛正常流產(chǎn)率為0.7%。實(shí)踐中，如果奶牛成母牛流產(chǎn)率高于5.0%，或肉牛成母牛流產(chǎn)率高于2.0%，就需及時(shí)分析原因并采取積極地改進(jìn)措施。

因三分場(chǎng)全部為進(jìn)口智利牛，而智利到處可見流浪狗（筆者曾在智利牛場(chǎng)挑選牛），甚至憩息在奶牛場(chǎng)干草垛上（圖2a），加之已排除BVD和IBR感染可能性，故順理成章首先懷疑犬新孢子蟲是否為元兇，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)毫無懸念地確認(rèn)是犬新孢子蟲感染，其中犢牛陽性率27%；泌乳牛陽性率92%（圖2b）。既然犬新孢子蟲可垂直傳播，泌乳牛群感染率高達(dá)92%，為何犢牛感染率僅為27%？這緣于該場(chǎng)并未發(fā)生水平傳播感染即外源性傳播感染，而只是垂直水平傳播感染即內(nèi)源性傳播感染，同時(shí)泌乳牛群中僅有少數(shù)先前感染母牛緩殖子被激活。

圖2 智利流浪犬（a）和三分場(chǎng)隨機(jī)采取12 頭泌乳牛和11 頭犢牛血樣檢測(cè)犬新孢子蟲結(jié)果（b）

3 牛犬新孢子蟲病流行情況

犬新孢子蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，隸屬于孢子蟲綱、新孢子蟲亞綱、新孢子蟲屬，可感染多種動(dòng)物引起新孢子蟲病。牛犬新孢子蟲病全球大部分地區(qū)均有分布[2]。美國于1957年最先報(bào)道牛犬新孢子蟲病爆發(fā)。我國犬新孢子蟲病首發(fā)于北京，隨后在西藏、新疆、山東、河南、云南、江蘇、內(nèi)蒙、青海、吉林等10 多個(gè)地區(qū)均出現(xiàn)牛犬新孢子蟲病例（表1）。

表1 我國部分地區(qū)牛犬新孢子蟲病流行情況

4 犬新孢子蟲傳播途徑

犬新孢子蟲感染犬（終末宿主）隨糞便排出未孢子化卵囊，繼之外界環(huán)境中發(fā)育為孢子化卵囊，孢子化卵囊具有感染性。牛（中間宿主）接觸孢子化卵囊污染飼料、水源或土壤而感染。孢子化卵囊進(jìn)入牛消化道后釋放出子孢子，并隨血流到達(dá)全身多種有核細(xì)胞內(nèi)寄生，發(fā)育成速殖子。速殖子可經(jīng)胎盤傳播感染胎犢。由于宿主免疫反應(yīng)，部分速殖子轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋齿^緩慢的緩殖子，并形成組織包囊。犬?dāng)z入含組織包囊牛組織（如胎衣和死胎兒）等，其胃蛋白酶會(huì)消化這些攝入組織和包囊囊壁，釋放出緩殖子進(jìn)行球蟲型發(fā)育，最終以未孢子化卵囊形式再次隨糞便排出體外，完成整個(gè)生活史（圖3）[3]。

圖3 犬新孢子蟲完整生活史

牛感染犬新孢子蟲至少有3 種傳播途徑：（1）牛可在任何時(shí)間感染犬新孢子蟲孢子化卵囊，稱為水平傳播感染。感染后，速殖子將會(huì)增殖一段時(shí)間，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一定水平抗體，繼之犬孢子蟲潛伏在細(xì)胞組織包囊中轉(zhuǎn)化為緩殖子。（2）如果青年?；虺赡概言衅陂g首次攝入孢子化卵囊，感染可能會(huì)損傷胎盤并波及胎犢，稱為外源性胎盤傳播感染（簡(jiǎn)稱“外源性傳播感染”）。外源性傳播感染是一種水平傳播感染亞型，妊娠母牛感染和胎犢感染會(huì)同步發(fā)生。（3）如果青年牛或成母牛先前已被感染，后來懷孕，犬新孢子蟲緩殖子可能重新活化并穿越胎盤，稱為內(nèi)源性胎盤傳播感染（簡(jiǎn)稱“內(nèi)源性傳播感染”）。內(nèi)源性傳播感染可能發(fā)生在同一母牛多次妊娠中，也可能發(fā)生在幾代之間。令人困惑的是，犬新孢子蟲文獻(xiàn)中經(jīng)常提到“垂直”傳播。顧名思義，垂直傳播指妊娠母牛和胎犢之間傳播感染，但這既發(fā)生在內(nèi)源性傳播感染，也發(fā)生在外源性傳播感染，因此，關(guān)于垂直傳播感染的定義往往含糊不清（圖4）。

圖4 牛感染犬新孢子蟲的3 種傳播途徑[4]

由圖4可知，牛一生任何時(shí)候（不僅只是妊娠期間）都可能感染犬新孢子蟲卵囊，即“水平”傳播感染；健康妊娠牛初次感染，稱外源性經(jīng)胎盤傳播感染，專指胎犢宮內(nèi)感染；已感染母牛緩殖子復(fù)活而致胎犢宮內(nèi)感染，稱內(nèi)源性經(jīng)胎盤傳播感染。

圖5展示了犬新孢子蟲在感染動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)幾種顯微形態(tài)；其在最終宿主犬科動(dòng)物腸道內(nèi)進(jìn)行有性繁殖，繼之隨糞便排出環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)的未孢子化卵囊，隨后演變成孢子化卵囊；這些孢子化卵囊會(huì)污染土壤、飼料和水源。犬新孢子蟲中間宿主是被捕食動(dòng)物，這些被捕食動(dòng)物因接觸污染土壤、飼料和水源而感染孢子化卵囊，也會(huì)經(jīng)由感染母體通過胎盤屏障傳播感染宮內(nèi)胎犢。無論何種感染方式，速殖子在宿主細(xì)胞內(nèi)都有一個(gè)快速無性繁殖時(shí)期，然后隨著速殖子破裂、擴(kuò)散，感染新細(xì)胞，原宿主細(xì)胞死亡。如出現(xiàn)臨床疾病，則是由速殖子引起。但大多數(shù)情況下，速殖子都受限感染動(dòng)物自身免疫系統(tǒng)反應(yīng)抑制，轉(zhuǎn)化為相對(duì)休眠狀態(tài)緩殖子，這些緩殖子位于微小細(xì)胞組織包囊內(nèi)。這些包囊通常永久存在中間宿主。當(dāng)感染動(dòng)物（任何組織）被犬科動(dòng)物捕食后，攝入緩殖子會(huì)在胃內(nèi)消化激活并感染腸道，前述循環(huán)重新開始。

圖5 犬新孢子蟲生命周期[5]

簡(jiǎn)言之，犬作為終末宿主攝入含新孢子蟲組織包囊動(dòng)物組織，繼組織包囊經(jīng)消化液分解釋放出子孢子侵入腸上皮細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖和有性繁殖，然后隨糞便排出未分化孢子卵囊；未分化孢子卵囊在外界發(fā)育為孢子化卵囊；中間宿主攝入孢子化卵囊后遭受感染，子孢子隨血流進(jìn)入多種有核細(xì)胞寄生，在細(xì)胞內(nèi)繁殖分裂形成速殖子，速殖子再次侵染新細(xì)胞。機(jī)體強(qiáng)壯時(shí)可有效控制這種發(fā)展，使一部分速殖子轉(zhuǎn)變?yōu)榫徶匙樱M(jìn)而留在體內(nèi)形成包囊長(zhǎng)期存在；速殖子和激活緩殖子可經(jīng)越胎盤屏障而致宮內(nèi)胎犢感染造成流產(chǎn)、死胎或弱胎。

5 牛感染犬新孢子蟲病的臨床表現(xiàn)

犬新孢子蟲感染主要引起母牛繁殖障礙，流產(chǎn)可發(fā)生在妊娠3月至分娩的任何階段，但通常妊娠5～6月時(shí)達(dá)到高峰。胎犢可能在子宮內(nèi)死亡、木乃伊化或自溶，出生時(shí)有臨床癥狀，或出生時(shí)臨床正常，但呈血清陽性。除繁殖障礙外，犬新孢子蟲感染很少引起成年牛和犢牛其他臨床癥狀。然而，2月齡以下宮內(nèi)感染犢牛偶爾出現(xiàn)腦脊髓炎導(dǎo)致的神經(jīng)癥狀，如共濟(jì)失調(diào)、四肢伸展過度、虛弱和后肢麻痹。此外，大多數(shù)牛感染后呈亞臨床癥狀，但常有例外。流產(chǎn)是唯一主要問題，這與母牛其他疾病癥狀無關(guān)。犬新孢子蟲病并非奶牛不孕或早期胚胎死亡重要原因，胎衣不下和子宮炎應(yīng)屬流產(chǎn)后繼發(fā)癥。除流產(chǎn)外，犬新孢子蟲病還與死胎或偶爾早產(chǎn)或神經(jīng)功能受損犢牛有關(guān)。宮內(nèi)感染犢牛出生時(shí)體型可能大小正?；蛎黠@較小，臨床癥狀包括神經(jīng)功能受損或部分脊柱缺陷。奶牛養(yǎng)殖業(yè)與流產(chǎn)相關(guān)成本（由于任何原因而不僅是犬新孢子蟲?。┲皇桥Ｄ坍a(chǎn)量減少，這緣于正常泌乳期、干奶期、體況和乳房健康受影響（圖6）。未發(fā)生流產(chǎn)時(shí)，犬新孢子蟲血清學(xué)陽性奶牛群奶產(chǎn)量并不降低；產(chǎn)奶量減少應(yīng)與流產(chǎn)有關(guān)，而非歸咎于血清陽性。

圖6 發(fā)病犢牛的臨床癥狀[5]

6 犬新孢子蟲流行病學(xué)模式

犬新孢子蟲流行病學(xué)模式主要有3 種：爆發(fā)流產(chǎn)（流行病模式）、逐年流產(chǎn)率增高（地方病模式）和亞臨床感染。

6.1 爆發(fā)流產(chǎn)模式

犬新孢子蟲病爆發(fā)流產(chǎn)，可能造成高比例妊娠母牛短時(shí)間內(nèi)流產(chǎn)。一般認(rèn)為，爆發(fā)流產(chǎn)是妊娠牛群飼料或水源被犬新孢子蟲卵囊污染所致。從爆發(fā)流產(chǎn)研究中獲得多項(xiàng)支持證據(jù)，爆發(fā)流產(chǎn)中觀察到的流行病學(xué)曲線與感染源接觸事件相吻合，例如一批日糧、添加劑或飲用水源被犬新孢子蟲污染。牛群感染時(shí)間與流產(chǎn)爆發(fā)時(shí)間也相互對(duì)應(yīng)，這與外源性傳播而非內(nèi)源性傳播一致。流行病學(xué)研究表明，流行性新孢子蟲病發(fā)病率與奶牛場(chǎng)犬?dāng)?shù)量多少密切關(guān)聯(lián)，這與攝入孢子化卵囊傳播感染?，F(xiàn)象相符（圖7）。

圖7 妊娠母牛感染犬新孢子蟲卵囊時(shí)間與妊娠進(jìn)展結(jié)果[5]

卵囊實(shí)驗(yàn)困難、耗時(shí)、昂貴。首先，供試感染組織必須用實(shí)驗(yàn)室制備的犬新孢子蟲孢子化卵囊接種小牛來產(chǎn)生；然后，這些組織喂給犬以誘導(dǎo)未分化孢子卵囊產(chǎn)生；最后，分化孢子卵囊喂給妊娠母牛，繼之觀察這些母牛分娩結(jié)果。目前利用分化孢子卵囊感染妊娠牛小規(guī)模試驗(yàn)全球僅報(bào)道3 則。然而，這3 則研究結(jié)果卻揭示出犬新孢子蟲傳播感染模式（表2）。所有陰性對(duì)照妊娠母牛均分娩出健康未感染犢牛。7 頭妊娠早期母牛接種犬新孢子蟲卵囊，即使最高劑量70 000 個(gè)卵囊，也未導(dǎo)致胎犢宮內(nèi)感染。這種宮內(nèi)感染屏障稍后始被破除：9天妊娠120～130 天母牛接種犬新孢子蟲卵囊，結(jié)果分娩6 天未宮內(nèi)感染犢牛，但另外3 頭妊娠母牛宮內(nèi)感染3 頭胎犢，其中2 流產(chǎn)（感染后39～44 ）和1 例死胎。另有7 頭妊娠中晚期母牛接種犬新孢子蟲卵囊后，其中6 頭初生犢牛血清陽性，即使接種最低劑量約127 個(gè)卵囊，但這6 頭初生犢牛臨床健康正常。這一實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ酱笾屡c現(xiàn)場(chǎng)牛犬新孢子蟲流產(chǎn)時(shí)間一致。這種模式也類似人類弓形蟲?。喝祟惞蜗x病胎兒宮內(nèi)感染可能性于妊娠前3 個(gè)月最低，但后果最嚴(yán)重；妊娠第3個(gè)月逐月增加且通常是亞臨床的。因此，妊娠青年牛攝入犬新孢子蟲卵囊似乎確能誘使流產(chǎn)爆發(fā)，前提是宮內(nèi)感染發(fā)生在當(dāng)前尚未明確定義的易感妊娠期內(nèi)，此時(shí)犬新孢子蟲可能侵越胎盤屏障，但終止于胎犢自身免疫系統(tǒng)成熟之前。

表2 健康妊娠牛接種犬新孢子蟲卵囊試驗(yàn)結(jié)果

6.2 地方病模式

患地方病模式犬新孢子蟲病牛群中，血清陽性奶牛通常與其可能跨越幾代血清陽性母系有親緣關(guān)系。犬新孢子蟲感染母牛可能會(huì)生下一胎或連續(xù)幾胎宮內(nèi)感染犢牛，這些感染犢牛又可能進(jìn)入繁殖牛群并繼續(xù)內(nèi)源性傳播感染。犬新孢子蟲血清陽性母牛比血清陰性母牛流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)更高。從10 個(gè)具有代表性國家大量研究匯編中獲得，犬新孢子蟲陽性血清奶牛群相對(duì)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)中位數(shù)為3.5%。換言之，如果血清陰性牛自然流產(chǎn)率為2%或3%，則有7.0%～10.5%犬新孢子蟲血清陽性?？赡芰鳟a(chǎn)。如結(jié)合胎次和任何先前流產(chǎn)因素，預(yù)測(cè)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)率更復(fù)雜。宮內(nèi)感染犢牛成長(zhǎng)發(fā)育配種妊娠后流產(chǎn)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)宮內(nèi)未感染犢牛7.4 倍。如頭胎未發(fā)生流產(chǎn)，此后妊娠期間流產(chǎn)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)大大降低；但如頭胎發(fā)生流產(chǎn)，此后妊娠期間流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)仍很高。盡管可能呈現(xiàn)輕微季節(jié)波動(dòng)，但犬新孢子蟲血清陽性率高奶牛群地方性流產(chǎn)全年或多或少都會(huì)隨機(jī)發(fā)生。因這種散發(fā)性流產(chǎn)常態(tài)性長(zhǎng)期存在，往往被忽視而誤以為是正?，F(xiàn)象，實(shí)際上這會(huì)造成奶牛場(chǎng)難以察覺的持續(xù)利潤損失。

此外，患地方病模式犬新孢子蟲病肉牛群或奶牛群也可能經(jīng)歷類似流行病流產(chǎn)（爆發(fā)型）模式，但這些肉牛群或奶牛群通常采用季節(jié)性繁殖而非全年繁殖。由于大多數(shù)流產(chǎn)發(fā)生在妊娠5～7月，故每年妊娠中期流產(chǎn)病例可在相當(dāng)短時(shí)間內(nèi)集中爆發(fā)。雖然地方病模式流產(chǎn)通常被認(rèn)為是由內(nèi)源性傳播感染引起，但水平傳播感染往往維持地方病模式犬新孢子蟲感染牛群血清高陽性率。流行病學(xué)研究進(jìn)一步印證奶牛場(chǎng)犬?dāng)?shù)量多少與發(fā)生地方病模式牛新孢子蟲病之間統(tǒng)計(jì)學(xué)密切關(guān)聯(lián)。由于犬新孢子蟲感染增加流產(chǎn)率和淘汰率，如有效長(zhǎng)期防止牛群水平傳播感染，將會(huì)逐漸減少血清陽性母牛數(shù)量，即使妊娠母牛100%發(fā)生內(nèi)源性傳播感染（這種情況很少發(fā)生）亦如此。地方病模式牛群水平傳播感染可能在不同時(shí)間（也許由于放牧）感染個(gè)別牛，也可能感染一群牛，緣于日糧或水源污染。

內(nèi)源性傳播感染效率定義為先前感染妊娠母牛其宮內(nèi)感染犢牛百分比。血清陽性犢牛數(shù)/血清陽性母牛數(shù)百分比波動(dòng)于41%～86%，平均傳播感染效率為63%。不過，這些研究均混雜水平傳播感染（產(chǎn)后或外源性經(jīng)胎盤傳播感染），其中2 個(gè)試驗(yàn)結(jié)果水平傳播感染每年都超過20%；故水平傳播感染導(dǎo)致內(nèi)源性傳播感染效率偏高，這緣于一些血清陰性犢牛可能遭受生后感染而被誤認(rèn)為是內(nèi)源性傳播感染。從奶牛犬新孢子蟲內(nèi)源性傳播感染效率合計(jì)63%統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，由于未剔除水平傳播感染犢牛，內(nèi)源性傳播感染真正效率可能比這一數(shù)據(jù)略低[5]。

內(nèi)源性傳播感染并非一定始自原先感染母牛，該論點(diǎn)在一數(shù)據(jù)記錄完整牛群獲得證實(shí)：該牛群曾遭受一次犬新孢子蟲病流產(chǎn)爆發(fā)，致使大多數(shù)奶牛都被感染；但隨后兩年中，同一牛群統(tǒng)計(jì)內(nèi)源性傳播感染率高達(dá)85%。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)：該牛群犢牛水平傳播感染即外源性傳播感染，造成母牛內(nèi)源性傳播感染率較高。

犬新孢子蟲感染母牛長(zhǎng)期內(nèi)源性傳播感染后果可能取決于幾個(gè)變量：初次感染時(shí)母牛年齡和生理狀態(tài)如未孕、妊娠早期未傳播感染胎犢或妊娠晚期傳播感染胎犢、犬新孢子蟲毒株特征和感染劑量等。盡管相對(duì)來說血清陽性母牛較血清陰性母牛流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)更高，但只有妊娠母牛未同時(shí)受水平傳播感染時(shí)這一點(diǎn)才成立。相反，當(dāng)妊娠牛群出現(xiàn)犬新孢子蟲流產(chǎn)爆發(fā)時(shí)，先前未感染母牛流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)升高，而先前感染母牛似乎具備一定程度抗水平傳播感染能力。用犬新孢子卵囊接種血清陽性妊娠母牛也能證實(shí)此點(diǎn)。

6.3 亞臨床感染模式

總體而言，與血清陰性母牛相比，犬新孢子蟲血清陽性母牛流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)較高，但這并不適用于所有牛群。曾記錄過血清陽性率高的許多牛群，但并未發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)率升高現(xiàn)象。此外，少數(shù)研究也未顯示母牛血清狀況與流產(chǎn)相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性之間聯(lián)系。因此，除非進(jìn)行犬新孢子蟲血清學(xué)普查，否則不太可能揭示兩者之間的關(guān)系。

7 犬新孢子蟲病的診斷

7.1 血清學(xué)篩查

通常發(fā)生流產(chǎn)時(shí)可預(yù)期流產(chǎn)母牛對(duì)致病病原體產(chǎn)生高水平特異性抗體。例如，對(duì)一頭剛流產(chǎn)奶牛僅進(jìn)行一次血清學(xué)檢查就可能確診牛犬新孢子蟲病或鉤端螺旋體病，但前提是檢測(cè)數(shù)值相當(dāng)高。由于采用幾種不同類型牛犬新孢子蟲抗體檢測(cè)方法（分別以滴度、光密度或樣本/陽性率不同形式報(bào)告），診斷實(shí)驗(yàn)室中，構(gòu)成牛犬新孢子蟲病“相當(dāng)高檢測(cè)數(shù)值”的因素將不同。例如，1∶400間接熒光抗體滴度不能確診為牛犬新孢子蟲流產(chǎn)；1∶1600應(yīng)有可能；但1∶6400可基本確定。雖然區(qū)分血清陰性和血清陽性判定結(jié)果之間截止滴度可設(shè)置為1∶25，但血清陽性牛也可緣于其他原因流產(chǎn)。

更可靠血清學(xué)方法是檢測(cè)幾頭新近流產(chǎn)母牛，并將結(jié)果與同樣數(shù)量未流產(chǎn)母牛比較。檢測(cè)牛頭數(shù)越多，對(duì)比效果越準(zhǔn)確。就大型奶牛場(chǎng)而言，經(jīng)驗(yàn)是每組至少檢測(cè)10 頭以上。研究牛犬新孢子蟲病和鉤端螺旋體病等其他流產(chǎn)疾病結(jié)果表明，大多數(shù)或所有流產(chǎn)母牛呈血清陽性，而正常健康無流產(chǎn)母牛血清陽性比例較低。正常健康無流產(chǎn)組通常也會(huì)有血清陽性母牛，緣于并非每頭感染母牛都會(huì)流產(chǎn)。還可對(duì)流產(chǎn)組和正常組平均抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，臨床感染母牛平均抗體水平預(yù)計(jì)更高；這種比較對(duì)于血清陽性率非常高牛群，或區(qū)分鉤端螺旋體疫苗接種產(chǎn)生抗體和野毒感染產(chǎn)生抗體，可能必不可少。

7.2 牛犬新孢子蟲流產(chǎn)胎犢的檢查

及時(shí)運(yùn)送整個(gè)冷凍流產(chǎn)胎犢最好。此外，還應(yīng)包括胎衣和流產(chǎn)母牛血清樣本。表3列出需采集樣本名錄。常規(guī)組織學(xué)檢測(cè)性價(jià)比極高，包括使用免疫組織學(xué)和某些類型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）作為額外檢測(cè)選項(xiàng)。就細(xì)菌培養(yǎng)而言，皺胃液樣本不錯(cuò)，可用針頭注射器無污染采集，然后再移入無菌真空管送檢。部分皺胃液帶有吞咽羊水，自然有可能含有引起胎盤炎或胎犢肺炎病原體，但流產(chǎn)時(shí)皺胃液并不會(huì)被周圍環(huán)境污染。

表3 牛流產(chǎn)需采集送檢樣本

8 犬新孢子蟲病流行原因

對(duì)奶牛場(chǎng)犬做新孢子蟲感染檢測(cè)診斷可能無任何意義，血清陽性犬表明既往曾被感染，可能已排出卵囊。然而由于持續(xù)排出卵囊時(shí)間通常（并不總是）少于2 周，故血清陽性犬與血清陰性犬相比，檢測(cè)當(dāng)時(shí)并不一定還在排出卵囊。如是血清陰性幼犬，則隨后也極易被感染并排出卵囊。當(dāng)然，亦可嘗試檢測(cè)犬糞便是否存在卵囊。不過，由于排出卵囊持續(xù)時(shí)期較短，即使血清陽性率高牛群，往往也難從糞便檢出卵囊。卵囊直徑約為10 m×11 m，約為犬弓形蟲卵表面積2%，很容易遺漏。此外，鑒于一類親緣關(guān)系密切但非致病性生物，如犬海氏哈曼德（Hammondia heydorni）球蟲外觀（盡管直徑為12 μm×14μm）幾乎等同犬孢子卵囊；因此，須通過PCR或其他專門實(shí)驗(yàn)室技術(shù)來鑒別。腹瀉犢牛糞便中隱孢子蟲卵囊更小，為5 m×7 m，而腹瀉犢牛糞便中賈第鞭毛蟲包囊約為9 m×13 m，但依然需注意鑒別診斷。

人工擠奶時(shí)代，奶牛場(chǎng)規(guī)模不大，犬糞便中新孢子蟲卵囊會(huì)沉積露天區(qū)域，逐漸風(fēng)化后卵囊將緩慢散布到周圍泥土或地表水源。幾周或幾月后，倘若個(gè)別牛碰巧在被污染地域吃草，則可能被感染。此外，小群牛共同從小水塘飲水也可能會(huì)感染；但在較大水域中，由于稀釋效應(yīng)太強(qiáng)而無法有效傳播感染。綜上，犬新孢子蟲往往只會(huì)感染個(gè)別牛，這種情況當(dāng)然使牛犬新孢子蟲病發(fā)病率較低。

自1988年首次報(bào)道牛犬新孢子蟲流產(chǎn)以來逾40年，由于奶牛養(yǎng)殖業(yè)機(jī)械化程度不斷提高，能在越來越小空間內(nèi)飼養(yǎng)越來越多奶牛。大型奶牛場(chǎng)已不采用放牧模式，而將所有飼料收割并運(yùn)到奶牛場(chǎng)。同時(shí)，奶牛營養(yǎng)科學(xué)進(jìn)步導(dǎo)致含多種飼料和添加劑的全混日糧廣泛應(yīng)用。最常見飼料之一是青貯飼料。幾十年前，青貯飼料往往儲(chǔ)存在安全的青貯塔，犬或其他動(dòng)物無法進(jìn)入。然而，堅(jiān)固豎立的青貯塔造價(jià)昂貴，裝填卸取速度緩慢。隨著奶牛群體規(guī)模逐漸增加，其他青貯形式越來越普遍，如地表青貯和地窖青貯。與計(jì)算機(jī)配方和最低日糧成本定量分析發(fā)展同步，全混日糧中使用的飼料品種不斷增加，這反過來要求購買和儲(chǔ)存更多種類飼料。由于養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)步和牛群規(guī)模擴(kuò)大，攝入病原體（包括犬新孢子蟲、鉤端螺旋體和沙門氏菌）廣泛傳播感染機(jī)會(huì)增多。只要污染一堆暴露在外飼料，牛群就可能由于將這些污染原料摻入全混日糧投喂而被感染（圖8）。如果投喂時(shí)牛齡較小，或未孕，或尚未處于妊娠易感階段，則不會(huì)發(fā)生流產(chǎn)。如部分或大部分妊娠牛恰巧處于妊娠易感階段，就可能流產(chǎn)；但感染率都會(huì)增加。由于感染是終生的，而且許多感染母牛會(huì)傳播感染胎犢，血清陽性率增加會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)期負(fù)面影響。反之，維持犬新孢子蟲血清陽性率高牛群，則相應(yīng)增加犬或其他犬科動(dòng)物攝入受感染組織機(jī)會(huì)，如胎衣、死犢和死牛包括丟棄內(nèi)臟，犬?dāng)z入后即排出未孢子化卵囊，從而增加環(huán)境污染頻率和水平傳播感染可能性。

圖8 犬新孢子蟲卵囊污染飼料和全混日糧并進(jìn)一步傳播感染[5]

9 牛犬新孢子蟲病防控方案

該病無治療特效藥，唯一商業(yè)化滅活疫苗Neo Guard已退出市場(chǎng)。目前可采用以下兩種策略防控牛犬新孢子蟲病。（1）切斷犬（終末宿主）向牛（中間宿主）水平傳播感染途徑：嚴(yán)禁家犬（采用拴系法）和其他犬科動(dòng)物（采用驅(qū)趕法）在牛飼料、谷倉或奶牛場(chǎng)內(nèi)排泄糞便。嚴(yán)禁家犬（采用拴系法）和野犬（采用驅(qū)趕法）采食流產(chǎn)胎兒、胎衣，或死犢牛。（2）切斷母牛向胎犢垂直傳播感染途徑：撲殺血清陽性母牛，但很難執(zhí)行。可采用血清陽性母牛為供體、血清陰性母牛為受體做胚胎移植。

避免犬新孢子蟲高感染率或降低高感染率牛群長(zhǎng)期關(guān)鍵防控措施是確保飼料免受犬糞便污染。目前采用放牧方式使高感染率牛群重新恢復(fù)至未感染前低感染率水平狀態(tài)并未奏效；此外，放牧亦無法避免牛群隨機(jī)感染犬新孢子蟲。采取各種防控措施可能降低集約化牛群發(fā)病率，但并不能降低感染水平。為保持集約化牛群拮抗犬新孢子蟲一定水平免疫力，除非特殊情況，不建議從牛群中完全消滅犬新孢子蟲。配制全混日糧的各類飼料貯存區(qū)域，應(yīng)采取相應(yīng)措施如設(shè)置飼料庫、料倉、筒倉自動(dòng)封閉閘門或弱電圍欄等嚴(yán)防家犬或野犬進(jìn)入。此外，奶牛場(chǎng)飲用水源也應(yīng)確保不被家犬或野犬糞便污染。

流行病學(xué)研究表明，奶牛場(chǎng)養(yǎng)犬是牛感染犬新孢子蟲病高風(fēng)險(xiǎn)因素之一。因此，奶牛場(chǎng)應(yīng)禁止養(yǎng)犬尤其是幼犬。與成年狗犬相比，幼犬更容易感染犬新孢子蟲，首次接觸犬新孢子蟲污染食物時(shí)更可能產(chǎn)生卵囊而導(dǎo)致更嚴(yán)重后果。如奶牛場(chǎng)周圍野犬眾多，因某些犬總會(huì)積極保護(hù)其領(lǐng)地，所以可考慮拴系法養(yǎng)犬，從而減少野犬和流浪犬出沒。需特別指出：無論如何精心設(shè)計(jì)和認(rèn)真實(shí)踐，奶牛場(chǎng)都可能無法完全凈化犬新孢子蟲病。這主要緣于某些因素確實(shí)難控制，例如：分娩前某些特定飼料或添加劑已被犬糞便污染；流浪或野生犬科動(dòng)物在草原或種植干草地域排泄糞便，或污染奶牛場(chǎng)水源。甚至可能還有其他罕見傳播感染方式：全混日糧切碎并混拌感染嚙齒動(dòng)物組織等。

10 犬新孢子蟲疫苗開發(fā)前景

奶牛養(yǎng)殖界迫切需要開發(fā)出有效的牛犬新孢子蟲病疫苗。盡管以前美國研發(fā)出一款滅活疫苗，但免疫效果并不理想，現(xiàn)已不再生產(chǎn)銷售。1988年以來，已在新西蘭和歐洲部分地區(qū)使用由弓形蟲而不是犬新孢子蟲引起的，針對(duì)綿羊非常相似狀況的高效弱毒活苗。有充分實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，牛犬新孢子蟲病也可通過類似弱毒疫苗達(dá)到免疫效果。然而迄今為止，還沒有任何相關(guān)產(chǎn)品成功開發(fā)并商業(yè)化。另外，為犬研制一種有效新孢子蟲病疫苗，將是控制牛犬新孢子蟲病感染最受歡迎輔助手段，并可化解人們對(duì)寵物犬和工作犬在牛場(chǎng)周圍活動(dòng)的擔(dān)憂。

致謝：由衷感謝杭州愛謹(jǐn)生物科技有限公司慷慨贊助犬新孢子蟲檢測(cè)工作和王聰明于百忙之中撥冗翻譯相關(guān)英文文獻(xiàn)。