金 磊,王 帥,于衛(wèi)華,劉江正,劉 瑞,孔德欽,姬秋和,李文麗*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍事毒理學(xué)與防化醫(yī)學(xué)教研室,特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710032;2中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院內(nèi)分泌科;3無(wú)錫市第九人民醫(yī)院病理科;4空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:liwenli@fmmu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:jqiuhe@fmmu.edu.cn)

齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是廣泛存在于各種植物中的天然化合物,生物毒性較低。因其具有抗病毒、消炎、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)作用,臨床被用于治療急性黃疸型肝炎和慢性肝炎[1]。由于OA可抑制脂質(zhì)合成、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、保護(hù)和促進(jìn)胰腺β細(xì)胞釋放胰島素[2,3]、增加肝糖原儲(chǔ)備[4-6],進(jìn)而減輕胰島素抵抗(insulin resistance, IR)[2,4,5],近年將其作為治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)候選藥物進(jìn)行深入研究。然而此物質(zhì)水溶解度極低,對(duì)酸堿均不穩(wěn)定,導(dǎo)致其生物利用度極低,限制了藥用價(jià)值的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本課題組先期成功建立棕櫚酸誘導(dǎo)BRL-3A細(xì)胞胰島素抵抗模型[7],該模型穩(wěn)定性好,可作為OA研發(fā)的良好模型。本團(tuán)隊(duì)目前已熟練掌握將高生物相容性、可體內(nèi)降解的殼聚糖降解為小分子納米顆粒技術(shù),故探索將殼聚糖納米化后對(duì)OA進(jìn)行包裹形成自組裝齊墩果酸-殼聚糖納米顆粒(nanoOA),以提高溶解度,并研究nanoOA生物安全性及對(duì)BRL-3A細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響,以期發(fā)現(xiàn)提高OA生物利用度的新劑型,從而能夠進(jìn)一步研究其對(duì)胰島素抵抗和糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

BRL-3A肝細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,四甲基噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司,二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,OA購(gòu)自西安小草制藥有限公司,2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司,胰蛋白酶、BSA購(gòu)自西安國(guó)安生物科技有限公司,無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市紅巖化學(xué)試劑廠,青霉素G、硫酸鏈霉素購(gòu)自鼎國(guó)生物公司,BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,丙二醛(MDA)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器

醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(SW-CJ,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),CO2培養(yǎng)箱(Incubator 311,美國(guó)賽默飛世爾公司),倒置熒光顯微鏡(CKX53,日本Olympus公司),全波段酶標(biāo)儀(Infinite 200 PRO,瑞士Tecan公司),全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(KH20R-Ⅱ,德國(guó)Sigma公司),流式細(xì)胞儀(Accuri C6,美國(guó)BD公司),透射電子顯微鏡(JEM-2010,日本電子光學(xué)公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

具體操作參照本課題組前期方法[7],簡(jiǎn)單概括如下:當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞匯合度超過(guò)90%時(shí),胰酶消化離心后棄去上清液將細(xì)胞收集,加入完全培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×105/ml,將細(xì)胞接種于微孔板,接種量為100 μl/孔(96孔板)和500 μl/孔(6孔板)。在37 ℃恒溫、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,觀察細(xì)胞匯合度超過(guò)80%時(shí),用PBS溶液洗滌3次后,按實(shí)驗(yàn)分組施加處理因素,置于37 ℃培養(yǎng)箱不同時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

觀察細(xì)胞匯合度超過(guò)80%時(shí),用PBS溶液洗滌3次后,依據(jù)施加處理因素分為兩組:OA組和nanoOA組,分別加入0,6.25,12.5,25,50,100 μg/ml OA和nanoOA。置于37 ℃培養(yǎng)箱3,6,12,24 h后進(jìn)行相應(yīng)細(xì)胞活力和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)。以上每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔,每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 OA儲(chǔ)備液配制

稱取500 mg OA于50 ml DMSO中,振蕩混勻,配成10 mg/ml儲(chǔ)備液,過(guò)濾分裝-20 ℃保存,實(shí)驗(yàn)前按比例用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋。

1.6 nanoOA儲(chǔ)備液配制

參照韓璐既往使用方法[8,9]將降解后小分子量殼聚糖經(jīng)反應(yīng)體系得到殼聚糖納米微粒,將殼聚糖納米微粒溶于pH=7.4的PBS溶液中,與OA攪拌反應(yīng)得到相應(yīng)粒徑的水溶性齊墩果酸-殼聚糖納米顆粒,于288 nm檢測(cè)包封OA濃度(1.7 mg/ml),滅菌后分裝為1 ml/管,-20 ℃保存,實(shí)驗(yàn)前按比例用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋。

1.7 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力

接種于96孔板中細(xì)胞按1.4中實(shí)驗(yàn)分組處理完畢后,每孔加入MTT工作液200 μl,置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h,吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入150 μl DMSO,振蕩溶解紫色結(jié)晶3 min。酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光度OD490 nm值。各處理組細(xì)胞相對(duì)活力=各處理組OD490 nm值/對(duì)照組OD490 nm值×100%。

1.8 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平

接種于6孔板中細(xì)胞按1.4的實(shí)驗(yàn)分組處理后,吸棄孔內(nèi)上清液,避光加入DCFH-DA(10 μmol/L,1 ml/孔),于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS溶液洗滌細(xì)胞3次,充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。胰酶消化離心收集細(xì)胞,PBS溶液洗滌,離心收集細(xì)胞沉淀。加入PBS溶液1 ml重懸成單細(xì)胞懸液,置于流式細(xì)胞儀以DCFH-DA的最大激發(fā)和吸收波長(zhǎng)(EX 488 nm,EM 530 nm)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度。每樣分別計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。數(shù)據(jù)獲取和分析使用儀器自帶CFlowPlus軟件。

1.9 吸光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平

接種于6孔板中細(xì)胞按1.4中實(shí)驗(yàn)分組處理后,棄去孔內(nèi)上清液,細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下,用移液器將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至塑料離心管,BCA法進(jìn)行蛋白定量分析,并按照MDA測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理后吸取反應(yīng)液0.25 ml加入到96孔板中,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔及空白孔吸光度OD520 nm值。MDA含量(nmol/mg蛋白)=(樣品OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 nmol/ml)÷樣品蛋白濃度(mg蛋白/ml)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 nanoOA制備效果評(píng)價(jià)

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度殼聚糖納米顆粒作用BRL-3A細(xì)胞后,其活力僅輕度降低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同濃度殼聚糖納米顆粒對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示,齊墩果酸-殼聚糖納米顆粒溶解度可達(dá)10 mg/ml,且有較好穩(wěn)定性。同時(shí)通過(guò)光鏡及電鏡觀察,制備的nanoOA較為均勻,粒徑在20～40 nm(見(jiàn)圖2),達(dá)到安全有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。此外在復(fù)溫方面:20 ℃環(huán)境中將冰箱凍存的nanoOA儲(chǔ)備液取出后解凍速度較OA快(3 minvs10 min)。

A.光鏡下形態(tài) (×100) B.電鏡下形態(tài)

2.2 OA和nanoOA對(duì)BRL-3A細(xì)胞活力影響

MTT結(jié)果顯示,與同時(shí)間0 μg/ml OA相比,低濃度(6.25,12.5,25 μg/ml)OA作用3,6,12,24 h,BRL-3A細(xì)胞活力并未明顯下降,且在3 h時(shí)輕度提高細(xì)胞活力;而高濃度OA(50,100 μg/ml)作用后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞相對(duì)活力則明顯下降(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 不同濃度OA、nanoOA作用不同時(shí)間對(duì)BRL-3A細(xì)胞相對(duì)活力的影響

而不同濃度nanoOA作用后BRL-3A細(xì)胞相對(duì)活力沒(méi)有明顯改變,且這一趨勢(shì)不因濃度增大而改變,尤其在高濃度狀態(tài)下細(xì)胞活力受影響程度較小,與同濃度OA組相比,細(xì)胞活力明顯較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此,納米化可以降低OA對(duì)BRL-3A細(xì)胞毒性作用。

2.3 OA和nanoOA對(duì)BRL-3A細(xì)胞ROS水平影響

ROS檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),與0 μg/ml OA相比,各濃度處理后細(xì)胞內(nèi)ROS峰值發(fā)生右移,ROS升高的細(xì)胞比例依次升高,濃度為100 μg/ml時(shí)ROS升高的細(xì)胞比例雖然有所下降,但峰型已呈雙峰(見(jiàn)圖3),提示有大量細(xì)胞碎片生成。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),OA處理后細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯增加(P<0.05,見(jiàn)圖4),存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 OA和nanoOA對(duì)BRL-3A細(xì)胞ROS水平的影響

與0 μg/ml相比,*P<0.05;同濃度與OA組相比,#P<0.05

而與0 μg/ml相比,各濃度nanoOA處理后細(xì)胞內(nèi)ROS峰值亦發(fā)生右移,但ROS升高的細(xì)胞比例相較OA組則較低,增加nanoOA濃度后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平未見(jiàn)明顯增加。

將兩組結(jié)果綜合對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn),濃度為12.5,25,50,100 μg/ml時(shí),nanoOA組ROS水平均比OA組低(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

2.4 OA和nanoOA對(duì)BRL-3A細(xì)胞MDA水平的影響

細(xì)胞MDA檢測(cè)結(jié)果顯示,與0 μg/ml相比,不同濃度OA(12.5,25 μg/ml)處理后BRL-3A細(xì)胞內(nèi)MDA水平增高(P<0.05),而用nanoOA預(yù)處理后細(xì)胞MDA水平基本持平,且與同濃度OA相比下降明顯(P<0.05,見(jiàn)圖5)。

與0 μg/ml相比,*P<0.05;同濃度與OA組相比,#P<0.05

3 討論

齊墩果酸是一種五環(huán)三萜化合物,于1908年由英國(guó)化學(xué)家Powers首次從木犀科植物橄欖中發(fā)現(xiàn)并分離獲得,后由Ruzicka確定了其結(jié)構(gòu)[10]。該化合物廣泛存在于木犀科、龍膽科、五加科等自然界的植物中,在三七、女貞子、人參中含量豐富。

齊墩果酸是典型的具有生物活性的天然藥物,具有很大的開(kāi)拓潛力。早期研究發(fā)現(xiàn)OA具有良好減輕肝損傷、降低血清氨基轉(zhuǎn)移酶、抑制肝纖維化、促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用[1],在治療急慢性肝炎及肝硬化,尤其是急性黃疸型肝炎方面有較好療效,后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤[11,12]、抗凋亡[13]、保護(hù)神經(jīng)[14-16]等作用,被廣泛用于臨床研究。隨著對(duì)T2DM相關(guān)研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)OA在刺激胰島素表達(dá)和分泌、減輕IR[2,4,5]、保護(hù)胰腺β細(xì)胞[2,3]、促進(jìn)葡萄糖利用、抑制葡萄糖吸收、增加肝糖原儲(chǔ)備[4-6]、調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化[17]、防治T2DM并發(fā)癥等多方面均有作用,而成為一個(gè)有多重開(kāi)發(fā)價(jià)值的傳統(tǒng)藥物。然而由于其溶解度低難于被胃腸道吸收,使得臨床應(yīng)用的片劑、膠囊劑、顆粒劑的生物利用度均較低,同時(shí)存在副作用大等不利因素,因此其在應(yīng)用上受到了限制,與此相關(guān)的制劑學(xué)研究一直受到重視。

納米技術(shù)在提高藥物溶解性、靶向性等方面體現(xiàn)出的卓越特性,使得納米藥物已成為目前制劑學(xué)的研究熱點(diǎn)。殼聚糖源自于自然界中的甲殼素,因其具有無(wú)毒、抑菌、增強(qiáng)免疫作用以及生物相容性好等優(yōu)勢(shì),已被廣泛用作藥物和疫苗的遞送載體。將殼聚糖經(jīng)反應(yīng)體系[8]降解成的小分子納米顆粒,與抗氧化劑自組裝后,抗氧化劑的水溶解度及抗氧化效果都得到了明顯改善[9,18]。因此,本實(shí)驗(yàn)基于此方法將OA與殼聚糖納米顆粒自組裝包裹后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。

納米載體標(biāo)準(zhǔn)為1～100 μm,過(guò)大過(guò)小均不適于用作藥物遞送系統(tǒng)。光鏡和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所采用殼聚糖顆粒大小均勻且適中,達(dá)到了納米顆粒的標(biāo)準(zhǔn),有效減少了毒副作用產(chǎn)生,溶解度的測(cè)定也證實(shí)了其具有較好的水溶性,說(shuō)明該法制備的納米顆粒無(wú)毒、生物相容性好,可作為高安全性藥物載體進(jìn)行后續(xù)研究。接下來(lái)用MTT法排除了藥物載體對(duì)細(xì)胞的毒性作用,發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞生存率無(wú)影響,證明了藥物載體的生物安全性。為證實(shí)納米化是否能減低OA對(duì)BRL-3A細(xì)胞的影響,本團(tuán)隊(duì)對(duì)細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)nanoOA對(duì)細(xì)胞的影響均小于OA,在高濃度時(shí)差異尤為明顯,提示納米化可以降低OA導(dǎo)致的BRL-3A細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA水平增高,降低了脂質(zhì)過(guò)氧化程度,驗(yàn)證了nanoOA可減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述,殼聚糖納米顆粒具有良好的生物安全性,將OA包裹后可以明顯提高其水溶性,同時(shí)可以減輕其細(xì)胞毒性作用,nanoOA較OA更具生物安全性與生物利用度,是較安全有效的OA制劑類型。因而OA-殼聚糖納米顆?？梢宰鳛镺A的一種新劑型進(jìn)行后續(xù)分子機(jī)制及藥效學(xué)研究。

以上結(jié)果僅反映納米化可以改善齊墩果酸的水溶性及對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,本團(tuán)隊(duì)針對(duì)其是否可改善齊墩果酸對(duì)胰島素抵抗作用進(jìn)行體內(nèi)和體外研究,相關(guān)數(shù)據(jù)及結(jié)果有待公布。