南李剛,王貴佐,楊淑梅,劉 璐*

(1陜西省人民醫(yī)院急診科,西安 710068;2陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥一科;*通訊作者,E-mail:liulu290@126.com)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特征[1]。持續(xù)存在的氣道炎癥反應(yīng),以氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)為主,并與氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞相互作用,分泌大量介質(zhì),進(jìn)一步激活、募集炎癥細(xì)胞,發(fā)揮協(xié)同促炎作用[2]。持續(xù)性炎癥反應(yīng)和氣道反復(fù)損傷-修復(fù)導(dǎo)致氣道重塑,是哮喘患者氣流不可逆性受限、激素抵抗以及肺功能受損的病理基礎(chǔ)[3],目前臨床尚無療效確切的防治措施。因此,探索哮喘氣道炎癥和重塑的分子機(jī)制,并尋找潛在干預(yù)藥物,對(duì)于減輕氣道炎癥和氣道重塑,進(jìn)而改善哮喘的整體控制水平、預(yù)后及降低醫(yī)療成本具有重要意義。

和厚樸酚(honokiol, HKL)是一種雙酚類化合物,是從中藥厚樸的根及樹皮中提取的重要單體,抗氧化能力是維生素E的1 000倍,還具有抗感染、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[4,5]。研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚可改善過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥反應(yīng)[6],但其分子機(jī)制以及和厚樸酚是否同樣可改善哮喘氣道重塑嚴(yán)重程度,還需進(jìn)一步研究。轉(zhuǎn)錄共激活因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein, YAP)是Hippo信號(hào)通路的核心效應(yīng)分子,活化后通過調(diào)節(jié)下游基因發(fā)揮促炎、促增殖等作用。研究表明,和厚樸酚可通過激活TGF-β1/p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)YAP磷酸化失活、降解,抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖[7]。但和厚樸酚是否也可通過下調(diào)YAP調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥及重塑過程,還需進(jìn)一步探討。

因此,本研究應(yīng)用卵清蛋白(ovalbumin, OVA)建立慢性哮喘大鼠模型,旨在評(píng)估和厚樸酚是否可抑制哮喘氣道炎癥和氣道重塑,以及探討其機(jī)制是否與和厚樸酚下調(diào)YAP表達(dá)相關(guān),為哮喘防治策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠24只,6周齡,體質(zhì)量為 180～220 g,購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(陜)2018-001)。

1.2 主要試劑

和厚樸酚粉劑(純度≥98.0%)及OVA凍干粉(純度≥97%)購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司,地塞米松注射液(1 ml∶5 mg)購(gòu)于中國(guó)遂成藥業(yè)股份有限公司;兔抗大鼠t-YAP單克隆抗體購(gòu)于中國(guó)上海艾博抗貿(mào)易有限公司,小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗及HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗均購(gòu)自于美國(guó)Sigma-Aldrich公司;RIPA裂解液購(gòu)自于中國(guó)上海碧云天公司,化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自于美國(guó)Milipore公司;IL-4及IL-17 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)R&D Systems,IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)LSBio公司。

1.3 慢性哮喘大鼠模型的構(gòu)建

24只大鼠隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、OVA模型組、和厚樸酚組和地塞米松組,每組6只。配置新鮮造模液(1 mg OVA+100 mg十二水硫酸鋁鉀溶于1 ml PBS溶液中),OVA模型組、和厚樸酚組和地塞米松(陽性對(duì)照)組大鼠分別于第1,7,14天腹腔注射新鮮造模液致敏,對(duì)照組大鼠腹腔注射同等體積PBS。第21天起,將大鼠置于15 L密閉玻璃容器內(nèi),由霧化裝置提供霧化動(dòng)力,以1%的OVA(PBS溶解)進(jìn)行霧化吸入激發(fā),每次30 min,隔日激發(fā)1次,3次/周,連續(xù)激發(fā)8周(共24次)。對(duì)照組采用PBS霧化吸入,其他操作均相同。和厚樸酚組于每次OVA霧化前1 h腹腔注射和厚樸酚溶液(5 mg/kg),地塞米松組于每次OVA霧化前1 h腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織樣本收集

末次激發(fā)后24 h處死大鼠,收集標(biāo)本。用4 ℃預(yù)冷、無菌PBS 2.5 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,重復(fù)4次,收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF),并離心,上清液在-80 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞沉淀用100 μl無菌PBS重懸,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù);取細(xì)胞沉淀涂片行瑞氏-吉姆薩染色,光鏡觀察,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)。支氣管肺泡灌洗后分離部分肺組織并在-80 ℃保存。

1.5 肺組織病理學(xué)檢查

取一部分肺組織固定于10%中性緩沖甲醛液,固定后的肺組織,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋切片(5 μm)后,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清及BALF中IL-4、IL-6、IL-17水平

樣品處理:全血標(biāo)本室溫放置2 h后以1 000g離心20 min;BALF以1 000g離心20 min,收集上清液,保存于-20 ℃,避免反復(fù)凍融。檢測(cè)前將ELISA試劑盒在室溫平衡15～30 min后使用。嚴(yán)格按照說明書操作,設(shè)置對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)孔(梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品)、待測(cè)樣品孔。封板、室溫孵育、洗滌后加入HRP偶聯(lián)抗體(IL-6試劑盒中HRP偶聯(lián)抗體稀釋100倍使用,IL-4、IL-17試劑盒中HRP偶聯(lián)抗體無需稀釋、直接使用)。重復(fù)封板、室溫孵育,洗滌過程。每孔加入底物溶液,室溫避光孵育后終止。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度。IL-4、IL-6、IL-17 ELISA試劑盒的檢測(cè)靈敏度分別為5 pg/ml、7.8 pg/ml和5 pg/ml。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)肺組織YAP表達(dá)水平

免疫印跡法檢測(cè)大鼠肺組織YAP表達(dá)水平,β-actin作為內(nèi)參。制備肺組織勻漿,使用RIPA裂解液提取總蛋白,測(cè)定蛋白濃度后按體積比4∶1加入上樣緩沖液,100 ℃水浴鍋?zhàn)冃浴DS-PAGE分離蛋白樣本,采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用封閉液充分封閉,轉(zhuǎn)移至按1∶1 000稀釋的一抗中孵育,4 ℃過夜,洗膜后轉(zhuǎn)入按1∶5 000稀釋的二抗中室溫孵育2 h,再次洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對(duì)肺組織病理改變的影響

OVA混懸液激發(fā)后模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的喘息、呼吸頻率變快、步履蹣跚、煩躁不安、腹肌痙攣陽性反應(yīng)等現(xiàn)象。對(duì)照組大鼠無上述改變。和厚樸酚組和地塞米松組在OVA激發(fā)階段,隨著和厚樸酚和地塞米松的應(yīng)用,大鼠喘息、呼吸加快、步履蹣跚、煩躁不安、腹肌痙攣陽性反應(yīng)癥狀嚴(yán)重程度均較OVA模型組減輕,且兩組間癥狀表現(xiàn)相似。

肺組織切片顯示對(duì)照組大鼠的肺組織無明顯炎性改變;OVA模型組大鼠可見支氣管管壁、平滑肌層增厚,部分氣道可見上皮細(xì)胞脫落壞死,支氣管管腔狹窄,氣道及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與OVA模型組相比,和厚樸酚組及地塞米松組大鼠肺組織氣道重構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕,而和厚樸酚組與地塞米松組大鼠肺組織病理改變相似(見圖1)。

圖1 和厚樸酚對(duì)OVA誘導(dǎo)的慢性哮喘模型大鼠肺組織病理改變的影響 (HE染色,×200)

2.2 和厚樸酚對(duì)大鼠BALF炎性細(xì)胞數(shù)的影響

與對(duì)照組比較,OVA模型組BALF內(nèi)炎性細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(P<0.01);與OVA模型組比較,和厚樸酚組及地塞米松組大鼠BALF內(nèi)炎性細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低(P<0.01);和厚樸酚組與地塞米松組大鼠BALF炎性細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與OVA模型組比較,##P<0.01

2.3 和厚樸酚對(duì)大鼠血清及BALF中炎癥因子的影響

與對(duì)照組比較,OVA模型組大鼠血清及BALF中IL-4、IL-6和IL-17濃度升高(P<0.01);與OVA模型組比較,和厚樸酚及地塞米松組大鼠血清及BALF中IL-4、IL-6和IL-17濃度均降低(P<0.01);和厚樸酚組與地塞米松組IL-4、IL-6和IL-17水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與OVA模型組比較,##P<0.01

2.4 和厚樸酚對(duì)大鼠肺組織中YAP蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較,OVA模型組大鼠肺組織中YAP蛋白水平較對(duì)照組升高至2.9倍(P<0.01);與OVA模型組相比,和厚樸酚組大鼠肺組織內(nèi)YAP蛋白水平降至0.88倍(P<0.01,圖4)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與OVA模型組比較,##P<0.01

3 討論

哮喘本質(zhì)是一種慢性氣道炎癥性疾病,發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,目前其發(fā)病機(jī)制可概括為免疫-炎癥反應(yīng)、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制及其相互作用。其中Th1/Th2失衡是重要因素之一,這一失衡導(dǎo)致Th2類細(xì)胞因子IL-4產(chǎn)生過多,進(jìn)而誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞活化分泌特異性IgE,后者可促進(jìn)肥大細(xì)胞增殖分化,進(jìn)一步刺激炎性細(xì)胞因子分泌[8,9]。IL-6可由包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌,與細(xì)胞膜上IL-6受體或IL-6受體的可溶性形式結(jié)合,隨后該復(fù)合物與糖蛋白130(glycoprotein, gp130)結(jié)合,不僅可誘發(fā)和擴(kuò)大炎癥反應(yīng),而且能夠抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明IL-6信號(hào)在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。哮喘患者血清、痰液、BALF中IL-6水平升高,與肺功能損害和哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)[10,11]。Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(re-gulatory cells, Tregs)失衡也參與哮喘發(fā)生發(fā)展過程,尤其是在那些非嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的哮喘患者當(dāng)中。Th17細(xì)胞分泌IL-17,可募集中性粒細(xì)胞;并促進(jìn)支氣管纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞活化,高度表達(dá)IL-6、IL-8和粒細(xì)胞集落刺激因子,加重氣道炎癥;參與氣道重塑[12,13]。

現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚可抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖以及抗血管生成,在多種以異常炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖為潛在病理機(jī)制的疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[14,15]。研究表明,和厚樸酚預(yù)處理可減輕慢性過敏性哮喘小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原沉積以及氣道杯狀細(xì)胞增生,下調(diào)肺勻漿中包括IL-4、IL-6、IL-17在內(nèi)的多種細(xì)胞因子水平[16]。這與本研究結(jié)果一致,即和厚樸酚可抑制哮喘炎癥反應(yīng)和氣道重塑。

Hippo通路由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成,具有高度保守性,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、器官大小、腫瘤發(fā)生等多個(gè)生物學(xué)過程。作為Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子,YAP由上游MST1/2-LATS1/2磷酸化而失活,并堆積在胞漿中經(jīng)泛素化途徑降解。一旦Hippo通路失活,YAP去磷酸化并活化入核,與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控下游靶基因表達(dá)水平、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為[17,18]。研究發(fā)現(xiàn),異甘草酸鎂通過抑制YAP改善肝星狀細(xì)胞炎癥反應(yīng)和活化[19]。在哮喘領(lǐng)域研究發(fā)現(xiàn),OVA致敏慢性哮喘小鼠模型中YAP水平明顯升高,且YAP水平與氣道ASM層厚度相關(guān)[20],提示Hippo-YAP信號(hào)通路可能參與哮喘病理過程。研究表明,和厚樸酚可阻斷YAP入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的作用,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及克隆形成[21]。本研究結(jié)果顯示,和厚樸酚可下調(diào)哮喘大鼠肺組織YAP水平,推測(cè)和厚樸酚抑制哮喘大鼠氣道炎癥及氣道重塑的機(jī)制與其下調(diào)YAP表達(dá)相關(guān),這為和厚樸酚在哮喘臨床治療上提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)我們將從細(xì)胞層面進(jìn)一步探索和厚樸酚抑制哮喘氣道炎癥及氣道重塑的分子機(jī)制。