徐永妮,李 爍,趙智凝

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院第九八六醫(yī)院檢驗病理科,西安 710054;*通訊作者,E-mail:h0erxx@163.com)

細菌性肺炎是一種感染性肺部疾病,肺炎鏈球菌作為一種革蘭陽性菌,是引起細菌性肺炎常見的病原體,其入侵宿主無菌部位后,免疫系統(tǒng)受到抑制,促使肺炎鏈球菌通過肺泡上皮的遷移,最終導(dǎo)致肺部感染[1,2]。因此,研究肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞的作用機制對細菌性肺炎的治療具有重要意義。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)來源于黃芪根部,具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用,對心血管疾病、肺病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有保護作用[3,4]。研究顯示黃芪甲苷能夠減輕肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[5],但具體的作用機制還尚未研究。轉(zhuǎn)錄啟動因子1(Sirtuin 1,SIRT1)是一種NAD+依賴性去乙酰化酶,參與細胞分化、凋亡、能量代謝等。磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作為SIRT1的下游因子,主要調(diào)節(jié)細胞的能量代謝[6]。據(jù)了解,啟動SIRT1/AMPK通路對脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的肺泡上皮屏障功能具有保護作用,而黃芪甲苷可以通過啟動SIRT1/AMPK信號通路改善血管內(nèi)皮功能障礙[7,8]。因此,本研究通過觀察肺泡上皮細胞的增殖、凋亡及蛋白表達情況,探討黃芪甲苷對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞損傷的作用及其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和菌株 人正常肺泡上皮細胞A549(批號CBP30021L)購自南京科佰生物科技有限公司,ATCC BAA-255肺炎鏈球菌(批號092144)購自上海碩欣生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 黃芪甲苷(批號202208,北京凱詩源生物科技有限公司);EX527(SIRT1抑制劑,批號15452,美國Med chem Express公司);脫纖維羊血、THB培養(yǎng)基(批號分別是1001339、HB0311-3,北京普非生物科技有限公司);MTT細胞活性檢測試劑盒(批號C11019,廣州市銳博生物科技有限公司);5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU,批號A1397,北京康瑞納生物科技有限公司);Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(批號FY600003,上海弗元生物科技有限公司);白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(批號DS647、3648D、DS636,上海優(yōu)利科生命科學(xué)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(批號分別是11119、11184,翌圣生物科技股份有限公司);BrdU、SIRT1、AMPK、p-AMPK一抗(批號分別是ab6326、ab189494、ab32047、ab92701,英國abcam公司);熒光標(biāo)記及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號1053、1102,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、GAPDH引物設(shè)計與合成(上海生工生物工程有限公司);NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);CFX96實時熒光定量PCR儀(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);CytoFLEX流式細胞儀(上海貝克曼庫爾特國際貿(mào)易有限公司);Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀(上海帝肯實驗器材有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將肺泡上皮細胞A549用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素-鏈霉素混合液)的DMEM培養(yǎng)基放在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞匯合率達到80%時開始傳代。肺炎鏈球菌用含有5%的脫纖維羊血的平板培養(yǎng),并在實驗開始之前放入含0.5%酵母的Todd-Hewitt肉湯(Todd Hewitt broth,THB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。

1.2.2 細胞分組與處理 將傳代后培養(yǎng)至生長對數(shù)期細胞分為對照組、感染組、黃芪甲苷低、中、高濃度組、黃芪甲苷+SIRT1抑制劑組(黃芪甲苷+EX527組)。對照組用DEME培養(yǎng)基培養(yǎng),感染組用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)細胞24 h[9],黃芪甲苷低、中、高濃度組細胞分別用濃度為10,20,40 μmol/L的黃芪甲苷培養(yǎng)48 h后,收集細胞用PBS清洗,再用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)24 h[10],黃芪甲苷+EX527組細胞用含有40 μmol/L黃芪甲苷和200 nmol/L SIRT1抑制劑EX527[6]的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后,收集細胞用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)24 h。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 收集各組細胞以每孔1×104個細胞接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h。然后吸棄上清液,加150 μl DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔的吸光值,并計算細胞存活率。

1.2.4 BrdU法檢測細胞增殖 將細胞接種至24孔板中,按分組培養(yǎng)24 h后,每孔中加入10 μmol/L的BrdU孵育2 h。然后將細胞用4%多聚甲醛固定,加入BrdU抗體在37 ℃下孵育2 h,再用山羊抗兔熒光二抗孵育1 h,最后加入DAPI進行核染,在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況,并計算BrdU陽性細胞(綠色熒光)的比例,以此表示細胞增殖率。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞用PBS洗滌,4 ℃,200g離心5 min,收集細胞沉淀加入200 μl Binding Buffer重懸細胞,再分別加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)染色液混勻,避光放置10 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量 收集各組細胞上清液,然后利用ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,并依據(jù)操作步驟處理待測樣品,用酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.7 實時熒光定量PCR(qRT-RCR)檢測Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA的表達 收集各組細胞提取總RNA,并用微量核酸蛋白濃度測定儀測定RNA濃度,利用試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后按照熒光定量試劑盒說明書進行qPCR,反應(yīng)體系為SYBR Green Master Mix 10 μl,上下游引物各0.4 μl,cDNA 1 μl,水8.2 μl。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min;2步法:95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán),熔解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算細胞中mRNA的相對表達量,引物序列見表1。

表1 RT-qRCR引物

1.2.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白的表達 收集各組培養(yǎng)的細胞,加入蛋白裂解液提取總蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離總蛋白,并將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜取出用TBST清洗3次,置于5%的脫脂牛奶中封閉2 h,TBST沖洗后放入脫脂牛奶配制的一抗稀釋液(SIRT1、AMPK、p-AMPK稀釋比例1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜,再放入羊抗兔二抗稀釋液(1∶1 000)中,室溫孵育2 h,繼續(xù)用TBST清洗3次,放入顯影劑中避光顯色10 min。用蛋白凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶并拍照,并以GAPDH為內(nèi)參蛋白,利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對A549細胞增殖的影響

MTT和BrdU實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,感染組細胞存活率及BrdU陽性細胞率顯著降低(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細胞存活率及BrdU陽性細胞率升高(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細胞增殖活性升高(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細胞存活率及BrdU陽性細胞率升高(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細胞存活率及BrdU陽性細胞率降低(P<0.05,見圖1和表2)。

圖1 BrdU實驗檢測黃芪甲苷對A549細胞增殖的影響 (×200)

表2 黃芪甲苷對A549細胞增殖的影響

2.2 黃芪甲苷對A549細胞凋亡的影響

與對照組相比,感染組細胞凋亡率升高(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細胞凋亡率升高(P<0.05,見表3和圖2)。

圖2 流式細胞術(shù)檢測黃芪甲苷對A549細胞凋亡的影響

表3 黃芪甲苷對A549細胞凋亡率的影響

2.3 黃芪甲苷對A549細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與對照組相比,感染組細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05,見表4)。

表4 黃芪甲苷對A549細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

2.4 黃芪甲苷對A549細胞中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達的影響

與對照組相比,感染組細胞中Bcl-2 mRNA表達降低,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達升高(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細胞中Bcl-2 mRNA表達升高,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達降低(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細胞中Bcl-2 mRNA表達升高,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達降低(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細胞中Bcl-2 mRNA表達升高,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達降低(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細胞中Bcl-2 mRNA表達降低,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達升高(P<0.05,見表5)。

表5 黃芪甲苷對A549細胞中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達的影響

2.5 黃芪甲苷對A549細胞中SIRT1、AMPK、p-AMPK/AMPK蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),AMPK在各組細胞中均無顯著變化。與對照組相比,感染組細胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達及p-AMPK/AMPK降低(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達及p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達及p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達及p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達及p-AMPK/AMPK降低(P<0.05,見表6和圖3)。

1.對照組;2.感染組;3.黃芪甲苷低濃度組;4.黃芪甲苷中濃度組;5.黃芪甲苷高濃度組;6.黃芪甲苷+EX527組

表6 黃芪甲苷對A549細胞中SIRT1、p-AMPK、p-AMPK/AMPK蛋白表達的影響

3 討論

肺炎鏈球菌是一種高度適應(yīng)人類的病原體,其作為呼吸道微生物群中常見的無癥狀成員,具有引起黏膜和侵襲性疾病的能力,包括肺炎、中耳炎、腦膜炎等[11]。其中由肺炎鏈球菌感染引起的細菌性肺炎在世界上仍然有較高的發(fā)病率和死亡率,當(dāng)人類肺細胞和組織被肺炎鏈球菌感染后會引起強烈的促炎反應(yīng),進一步導(dǎo)致細胞死亡,且已知IL-6、IL-1β、TNF-α是評估肺泡上皮細胞損傷程度的重要炎性細胞因子[5,12,13]。因此,本研究對細胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染組肺泡上皮細胞的存活率及BrdU陽性細胞率明顯低于對照組,細胞凋亡率以及其培養(yǎng)液中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明顯高于對照組。表明肺炎鏈球菌成功感染了肺泡上皮細胞并引起炎性損傷。而黃芪甲苷不同濃度處理后細胞的存活率及BrdU陽性細胞率升高,凋亡率以及IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明顯降低。提示黃芪甲苷能夠促進肺泡上皮細胞的增殖,抑制細胞凋亡和炎癥反應(yīng),從而減輕肺炎鏈球菌感染引起的損傷。接著又檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達,已知抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax均是細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時,pro-Caspase-9被轉(zhuǎn)化為其活性形式,并作用于Caspase-3前體形成cleaved Caspase-3[14,15]。結(jié)果顯示,與感染組相比,黃芪甲苷處理組細胞中Bcl-2 mRNA表達升高,Bax和cleaved Caspase-3 mRNA表達降低。以上結(jié)果進一步驗證了黃芪甲苷對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細胞凋亡的抑制作用,這與先前的研究結(jié)果[5]保持一致,但具體的作用機制還需進一步了解。

SIRT1是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵因子,也是細胞存活的重要組成部分,其可以作用于細胞的增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)[16]。AMPK作為SIRT1的下游基因,也是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵,在各種類型的細胞中參與脂質(zhì)代謝、炎癥和血管生成的調(diào)節(jié)[17]。當(dāng)AMPK被啟動后可以增加細胞內(nèi)NAD+水平,從而建立代謝反饋機制,使SIRT1活性增強,導(dǎo)致SIRT1靶蛋白的去乙?；?調(diào)節(jié)線粒體功能和維持能量平衡[18,19]。有研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)啟動SIRT1/AMPK信號通路可以抑制炎癥和細胞凋亡,從而保護缺血再灌注引起的肺上皮細胞損傷[20]。本研究結(jié)果顯示,感染組細胞中SIRT1和磷酸化AMPK蛋白表達降低,黃芪甲苷處理組SIRT1和磷酸化AMPK蛋白表達升高。表明黃芪甲苷可以啟動SIRT1表達,從而介導(dǎo)下游AMPK蛋白磷酸化。而加入SIRT1抑制劑EX527后,黃芪甲苷促進肺泡上皮細胞增殖,抑制其凋亡和炎癥反應(yīng)的作用被逆轉(zhuǎn),且AMPK磷酸化表達降低。進一步揭示了黃芪甲苷能夠減輕肺炎鏈球菌引起的肺泡上皮細胞損傷的作用機制可能與調(diào)控SIRT1/AMPK信號通路有關(guān)。

綜上所述,黃芪甲苷通過調(diào)控SIRT1/AMPK信號通路,減輕肺炎鏈球菌感染引起的肺泡上皮細胞損傷。本研究為肺炎鏈球菌等細菌感染引起的肺部疾病提供了新的治療思路和依據(jù)。但本研究仍然存在一定的局限性,首先本研究僅在細胞中進行了體外實驗,并未探討黃芪甲苷在體內(nèi)的作用效果及機制;其次,本研究僅證明了黃芪甲苷對肺炎鏈球菌感染造成的肺泡上皮細胞損傷的保護作用,并未探究黃芪甲苷對肺炎鏈球菌的具體作用。因此,在后續(xù)實驗中需要進一步研究黃芪甲苷對肺炎鏈球菌的作用,并深入探討黃芪甲苷在體內(nèi)對肺炎鏈球菌感染引起的肺泡上皮細胞損傷的具體作用。