陶 露,湯迎凱,韋卓利,項 平*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室;3蚌埠醫(yī)學(xué)院組織移植安徽省重點實驗室;*通訊作者,E-mail:byxiangping@163.com)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是由鼻咽上皮癌變引起的一種頭頸部上皮性惡性腫瘤,在中國南方、北非和東南亞地區(qū)發(fā)病率較高[1-3]。近年來,隨著放療技術(shù)的進步,鼻咽癌早期治療效果良好[4],然而,60%的新診斷患者的臨床結(jié)果很差,他們通常表現(xiàn)為晚期疾病。因此,開發(fā)有效的治療策略從而使這種致命疾病得以根除是至關(guān)重要的。

microRNA(miRNA/miRs)是一類非編碼RNA,可通過與mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)堿基配對,增強mRNA降解或抑制其翻譯,大約三分之一的人類基因可以被miRNA調(diào)控[5-7]。最近的研究表明,miRNA在許多人類疾病中異常表達,調(diào)控多種生物學(xué)作用,包括增殖、凋亡、遷移和分化,在腫瘤的發(fā)展過程中,miRNA既可以作為癌基因,也可以作為腫瘤抑制因子[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)miR-125b-2-3p在結(jié)直腸癌[11]、乳腺癌[12]和口腔鱗狀細胞癌[13]等腫瘤中發(fā)揮作用。miR-125b-2-3p在鼻咽癌中發(fā)揮何種作用?目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。本研究通過分析miR-125b-2-3p在鼻咽癌細胞中的表達水平及其對鼻咽癌細胞HNE1增殖和凋亡的影響,為鼻咽癌的診斷和治療提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑

鼻咽癌細胞HNE1和HK1為蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室凍存細胞,人永生化鼻咽上皮細胞NP69購自賽庫生物技術(shù)有限公司。RPMI 1640購自美國Gibco公司;胎牛血清購自南美Lonsera公司;Lipofectamine?2000購自美國Invitrogen公司;mimics NC、miR-125b-2-3p mimics、inhibitor NC和miR-125b-2-3p inhibitor以及miR-125b-2-3p引物(序列:F:5′-CAGTGTCATCACAAGTCAGGCT-3′,R:5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′)購自吉瑪基因股份有限公司;U6(貨號HmiRQP9001)購自易錦生物技術(shù)有限公司;miRcute miRNA提取分離試劑盒購自天根生化科技有限公司;All-in-OneTMmiRNA定量檢測體系購自美國GeneCopoeia公司;CCK-8檢測試劑盒購自邁珂生物科技有限公司;Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒和DAPI染色液購自索萊寶科技有限公司;Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HNE1、HK1和NP69細胞株均在5% CO2,37 ℃條件下培養(yǎng),完全培養(yǎng)液是由10%胎牛血清和1%青-鏈霉素混合RPMI 1640配制。收集對數(shù)生長期HNE1細胞,計數(shù)并均勻鋪板于6孔板,待細胞生長至密度約70%時進行細胞轉(zhuǎn)染,分別轉(zhuǎn)染mimics NC和miR-125b-2-3p mimics,inhibitor NC和miR-125b-2-3p inhibitor,然后驗證轉(zhuǎn)染效率。在后續(xù)實驗中分為control組(未處理)、mimics NC組(Lip 2000+mimics NC)、miR-125b-2-3p mimics組(Lip 2000+miR-125b-2-3p mimics)、inhibitor NC組(Lip 2000+inhibitor NC)和miR-125b-2-3p inhibitor組(Lip 2000+miR-125b-2-3p inhibitor)。

1.3 熒光定量PCR檢測miR-125b-2-3p表達水平

收集對數(shù)生長期細胞,根據(jù)miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書提取總RNA,根據(jù)All-in-OneTMmiRNA定量檢測體系使用說明書依次進行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng),設(shè)置參數(shù):95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參,采用相對定量2-ΔΔCt方法計算。

1.4 細胞集落形成的測定

收集對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后HNE1細胞并計數(shù)均勻鋪板,培養(yǎng)期間間斷觀察細胞生長情況,7 d后終止培養(yǎng)。4%組織細胞固定液固定20 min,PBS洗2次,結(jié)晶紫染色15 min,拍照并統(tǒng)計集落形成數(shù)目。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖能力

收集對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后HNE1細胞并計數(shù),103/孔鋪板于96孔板,分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48,72 h后終止培養(yǎng),更換培養(yǎng)液,每孔加10 μl CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中孵育2.5 h使用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光值。

1.6 活細胞/死細胞雙染色檢測細胞活力

收集對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后HNE1細胞,計數(shù)后鋪板于6孔板,分別在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng),PBS洗2次,根據(jù)Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒說明書,每孔依次加入1 μl Calcein-AM和3 μl PI孵育25 min,PBS洗2次,熒光顯微鏡使用(490±10)nm激發(fā)濾片觀察拍照。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后HNE1細胞并計數(shù),均勻鋪板于6孔板,4 h后更換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)36 h后終止培養(yǎng),收集細胞并計數(shù),取10萬重懸細胞于1 000 r/min條件下離心5 min,根據(jù)Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書,分別依次加入195 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液,5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶染色液,輕輕混勻,避光孵育20 min,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 線粒體膜電位檢測細胞凋亡早期情況

收集對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后HNE1細胞,計數(shù)鋪板于6孔板,放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后終止。根據(jù)線粒體膜電位檢測試劑盒說明書,提前配置JC-1染色工作液和JC-1染色緩沖液(1×)備用。PBS洗滌細胞1遍,加入1 ml培養(yǎng)液和1 ml JC-1染色工作液,混勻,培養(yǎng)箱孵育20 min,JC-1染色緩沖液(1×)洗2次,加入2 ml培養(yǎng)液。在熒光顯微鏡下觀察和拍照。線粒體膜電位下降標(biāo)志細胞凋亡早期,紅/綠熒光強度比值表示細胞去極化程度,比值越高說明膜電位越高[14]。

1.9 細胞核DAPI染色

取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后HNE1細胞計數(shù)鋪板于6孔板,培養(yǎng)24 h后終止,PBS洗2次,4%組織細胞固定液固定20 min,PBS洗2次,DAPI染色液染色15 min,洗滌后于熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-125b-2-3p在鼻咽癌細胞HNE1中的表達

結(jié)果顯示,miR-125b-2-3p在HNE1、HK1和NP69細胞中均有表達,與人永生化鼻咽上皮細胞NP69相比,miR-125b-2-3p在鼻咽癌細胞中表達較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。與control組和mimics NC組相比,miR-125b-2-3p在miR-125b-2-3p mimics組中表達上調(diào)(P<0.01);與control組和inhibitor NC組相比,miR-125b-2-3p在miR-125b-2-3p inhibitor組中表達下調(diào)(P<0.01,見圖2)。

與人永生化鼻咽上皮細胞NP69比較,*P<0.05,**P<0.01

與control組和相應(yīng)的NC組比較,**P<0.01

2.2 miR-125b-2-3p對鼻咽癌細胞HNE1增殖的影響

結(jié)果表明,與mimics NC組相比,miR-125b-2-3p mimics組吸光值較高(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-125b-2-3p inhibitor組吸光值較低(P<0.01,見圖3)。細胞集落形成實驗結(jié)果顯示,與mimics NC組相比,miR-125b-2-3p mimics組細胞集落數(shù)目較多(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-125b-2-3p inhibitor組細胞集落數(shù)目較少(P<0.01,見圖4)?；罴毎?死細胞雙染色檢測結(jié)果表明,相較于mimics NC組,miR-125b-2-3p mimics組活細胞較多;相較于inhibitor NC組,miR-125b-2-3p inhibitor組活細胞較少(見圖5)。

與各自對應(yīng)的NC組比較,**P<0.01

與各自對應(yīng)的NC組比較,**P<0.01

黃綠色熒光表示活細胞;紅色熒光表示死細胞

2.3 miR-125b-2-3p對鼻咽癌細胞HNE1凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,與mimics NC組相比,miR-125b-2-3p mimics組細胞凋亡率較低(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-125b-2-3p inhibitor組細胞凋亡率較高(P<0.01,見圖6)。線粒體膜電位(JC-1)檢測結(jié)果表明,與mimics NC組相比,miR-125b-2-3p mimics組細胞紅/綠熒光強度比值較高;相較于inhibitor NC組,miR-125b-2-3p inhibitor組紅/綠熒光強度比值較低(P<0.05,見圖7)。DAPI細胞核染色檢測結(jié)果表明,相較于inhibitor NC組,miR-125b-2-3p inhibitor組細胞出現(xiàn)核固縮和核碎裂較多(見圖8)。

與各自對應(yīng)的NC組比較,**P<0.01

與各自對應(yīng)的NC組比較,**P<0.01

藍色熒光表示細胞核;紅色箭頭指核固縮和核碎裂

3 討論

microRNA廣泛參與各種關(guān)鍵的細胞過程,miRNA通過降解靶基因轉(zhuǎn)錄本和抑制mRNA的翻譯在許多類型的腫瘤細胞中發(fā)揮作用[15,16]。有報道稱miRNA在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,例如miRNA-520c-3p在鼻咽癌組織和細胞系中表達下調(diào),鼻咽癌腫瘤分級越重、腫瘤越大miRNA-520c-3p表達水平越低,miRNA-520c-3p過表達使細胞周期停滯在G0/G1期,抑制細胞增殖能力[17]。本研究以miR-125b-2-3p為研究對象,通過熒光定量PCR檢測miR-125b-2-3p在人永生化鼻咽上皮細胞NP69和鼻咽癌細胞中的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于人永生化鼻咽上皮細胞NP69,miR-125b-2-3p在鼻咽癌細胞中表達上調(diào),說明miR-125b-2-3p在鼻咽癌診斷中具有潛在的價值。

lncRNA AC007271.3上調(diào)在體外促進細胞增殖、遷移、侵襲,抑制細胞凋亡,在體內(nèi)促進腫瘤生長,研究表明AC007271.3通過與miR-125b-2-3p結(jié)合,破壞primary miR-125b-2的穩(wěn)定,作為競爭內(nèi)源性RNA,導(dǎo)致miR-125b-2-3p的直接靶標(biāo)Slug的表達上調(diào),促進口腔鱗狀細胞癌的發(fā)展[13]。也有研究表明miR-125b-2-3p上調(diào)通過靶向EGR1作為透明細胞腎細胞癌轉(zhuǎn)移的重要啟動子,促進透明細胞腎細胞癌的發(fā)展[18]。miR-125b-2-3p在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。為了進一步闡明miR-125b-2-3p在鼻咽癌細胞HNE1中的生物學(xué)功能,本研究構(gòu)建了下調(diào)或上調(diào)miR-125b-2-3p表達水平的鼻咽癌細胞HNE1轉(zhuǎn)染細胞株。實驗結(jié)果顯示,在鼻咽癌細胞HNE1中轉(zhuǎn)染miR-125b-2-3p inhibitor后,與轉(zhuǎn)染inhibitor NC相比miR-125b-2-3p表達水平明顯下調(diào);相較于inhibitor NC組,miR-125b-2-3p inhibitor組細胞增殖能力明顯受到抑制,細胞凋亡增多,說明下調(diào)miR-125b-2-3p能夠抑制鼻咽癌細胞HNE1的體外增殖,促進HNE1細胞的凋亡。細胞凋亡是在基因水平上受到調(diào)控,從而有序和有效地清除受損細胞,癌前病變中DNA損傷導(dǎo)致的細胞凋亡可以清除潛在的有害細胞,從而阻止腫瘤的生長,這一死亡過程的解除與未受抑制的細胞增殖、癌癥的發(fā)展和進展有關(guān)[19,20]。因此,推測可能通過miR-125b-2-3p下調(diào)使鼻咽癌細胞增殖受到抑制,細胞凋亡增加,從而抑制鼻咽癌的發(fā)展。

綜上,本研究初步證實了下調(diào)miR-125b-2-3p能夠抑制鼻咽癌細胞HNE1的增殖,促進HNE1細胞的凋亡。microRNAs是許多細胞過程的關(guān)鍵調(diào)控因子,在癌癥中經(jīng)常被解除控制,包括細胞凋亡,miRNAs可能通過分別直接靶向促凋亡或抗凋亡mRNA,同時發(fā)揮促凋亡和抗凋亡的作用[21],將miRNA作為合成miRNA模擬物或抑制物已經(jīng)成為一種很有前途的治療癌癥的方法。因此,推測miR-125b-2-3p對鼻咽癌細胞凋亡的影響可能是通過靶向調(diào)控下游mRNA發(fā)揮作用,由于實驗的局限性尚未研究。未來我們將深入研究miR-125b-2-3p上下游調(diào)控鼻咽癌生物學(xué)功能的潛在分子,為進一步了解鼻咽癌發(fā)生機制以及臨床靶點治療提供新的理論依據(jù)。