張宇涵,李 香,張 玲,馬燕春

(山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,太原 030001;*通訊作者,E-mail:mayanchun85@163.com)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一。有研究表明預(yù)計到2030年,CRC將成為發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1,2]。在診斷時大多數(shù)CRC患者就已達(dá)到中晚期狀態(tài),且高發(fā)病率和低生存率仍然是一個公共衛(wèi)生問題且仍缺乏更有效的治療手段[3]?；孛つc癌屬于結(jié)直腸癌中的一種。目前結(jié)腸癌的治療手段主要是手術(shù)結(jié)合放化療,但同步放化療可能會增加毒副作用,導(dǎo)致部分同步放化療反應(yīng)差的患者手術(shù)不能如期進(jìn)行[4]。因此,尋找更加安全有效的抗結(jié)腸癌治療方法迫在眉睫。

我國傳統(tǒng)中草藥具有毒副作用小、多靶點和整體性的特點,最近得到多方面關(guān)注[5]。雷公藤紅素(celastrol,Cel)又名南蛇藤素,是一種五環(huán)三萜類單體化合物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),Cel具有抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗神經(jīng)元退變等廣泛的藥理活性[6]。越來越多的報道[7]顯示,它在抗腫瘤方面也發(fā)揮了巨大的作用,主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期、血管生成通路等達(dá)到抗腫瘤活性的效果,包括非小細(xì)胞型肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌等。Cel還可以調(diào)節(jié)MAPK、TNF-α等多種信號通路以發(fā)揮抗腫瘤活性[8]。但是有關(guān)雷公藤紅素是否能通過調(diào)控MAPK信號通路影響結(jié)直腸癌細(xì)胞生長的報道較少。因此本實驗以HCT-8細(xì)胞為研究對象,通過觀察雷公紅素對HCT-8細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響,進(jìn)一步探討Cel對結(jié)直腸癌的治療效應(yīng),明確Cel是否通過調(diào)控MAPK信號通路的表達(dá)而影響結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的增殖能力,為今后開發(fā)結(jié)直腸癌的防治藥物提供部分實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人回盲腸腺癌細(xì)胞HCT-8(本實驗所用的HCT-8細(xì)胞是從一位67歲男性結(jié)直腸腺癌患者的大腸中分離而來)保存于山西省食管癌發(fā)病機(jī)理及轉(zhuǎn)化研究重點實驗室。用含10%胎牛血清(FBS)、100 mg/ml鏈霉素和100 U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃及5% CO2條件下培養(yǎng)。按照雷公藤紅素的濃度將細(xì)胞分為4組:0 μmol/L,0.5 μmol/L,1.0 μmol/L,2.0 μmol/L。

1.2 主要試劑

雷公藤紅素(celastrol)購自美國Selleck公司(10 mg,S1290),濃度為10 mmol/L并溶解于二甲基亞砜(DMSO)中后使用。MTT購自北京索萊寶公司,用PBS配制使其濃度為0.5%,-20 ℃避光保存。Bcl-2、cleaved PARP、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK抗體,購自艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司;E-cadherin、Vimentin、Slug、Snail、Twist、GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 MTT檢測細(xì)胞的存活率

按照每孔6×103細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞貼壁后按照分組進(jìn)行加藥,每組設(shè)置5個復(fù)孔,分別在加藥24,48,72,96 h時每孔加入10 μl MTT溶液,37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h,然后小心棄去MTT,每孔加入100 μl DMSO,室溫?fù)u床孵育15 min,檢測各組細(xì)胞在490 nm波長處的吸光度值(OD490),其間接反映活細(xì)胞的數(shù)量,并繪制生長曲線。

1.4 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)

體外培養(yǎng)的細(xì)胞通常貼壁性強(qiáng),細(xì)胞形成緊密堆積的上皮細(xì)胞集落,細(xì)胞核大,細(xì)胞質(zhì)少;當(dāng)貼壁的單層細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時按照分組加藥處理24 h,隨后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的狀態(tài)。

1.5 細(xì)胞集落形成實驗檢測HCT-8細(xì)胞增殖能力

將每孔1×103個HCT-8細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)至貼壁,并按照分組進(jìn)行加藥處理。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周后,菌落用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色30 min。低倍鏡下計數(shù)各組細(xì)胞的集落形成個數(shù)。

1.6 侵襲與遷移實驗檢測細(xì)胞侵襲遷移能力

侵襲實驗:提前2 h用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠,比例為1∶20,鋪100 μl到小室底并將其放于37 ℃培養(yǎng)箱形成一層薄膜,加入2×105個細(xì)胞到上層小室并用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),下層小室加含20% FBS的培養(yǎng)基600 μl,培養(yǎng)48 h采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min后進(jìn)行拍照。

遷移實驗:采用未鋪Matrigel基質(zhì)膠的Trans-well小室,實驗分組及步驟同侵襲實驗。

1.7 活性氧(ROS)實驗檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量

將1×106個HCT-8細(xì)胞接種于24孔板,按照分組進(jìn)行加藥處理,濃度比例1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋熒光探針DCFH-DA,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,每隔3～5 min顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸,隨后用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。隨后采用熒光顯微鏡觀察ROS產(chǎn)生水平情況。

1.8 不同濃度的Cel對HCT-8細(xì)胞對蛋白表達(dá)水平的影響

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液超聲裂解并采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。隨后,將蛋白質(zhì)在95 ℃沸水中煮沸5 min變性,并進(jìn)行SDS-PAGE。PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,一抗:兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗cleaved PARP單克隆抗體、兔抗E-cadherin,Vimentin,Twist,Slug,Snail單克隆抗體、兔抗p-ERK,p-JNK,JNK,p-P38單克隆抗體均按1∶1 000稀釋,兔抗p38多克隆抗體(1∶1 000),鼠抗ERK多克隆抗體(1∶2 000)4 ℃過夜孵育檢測蛋白印跡,使用Odyssey Clx系統(tǒng)顯示辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)和蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果表明,細(xì)胞分別用0,0.5,1.0,2.0 μmol/L的Cel培養(yǎng)24 h,接種96 h時細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.01);并且多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮、連接消失、發(fā)泡發(fā)亮、與周圍細(xì)胞脫落,2.0 μmol/L Cel對細(xì)胞生長抑制最明顯(見圖1)。以上結(jié)果均表明雷公藤紅素可以抑制HCT-8細(xì)胞的存活率,且具有濃度依賴性。

A. HCT-8細(xì)胞生長曲線圖B.藥物處理24 h倒置顯微鏡下HCT-8細(xì)胞形態(tài)特征

2.2 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞增殖的影響

集落形成實驗結(jié)果顯示:與0 μmol/L相比,0.5,1.0,2.0 μmol/L雷公藤紅素處理后 HCT-8細(xì)胞的克隆形成個數(shù)均顯著減少(P<0.01,見圖2)。表明雷公藤紅素具有抑制HCT-8細(xì)胞增殖的作用。

圖2 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞增殖的影響

2.3 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量隨Cel濃度降低而減少(P<0.01);促蛋白Bax表達(dá)量隨Cel濃度升高而增加(P<0.01),cleaved PARP蛋白表達(dá)量隨Cel濃度升高而增加(P<0.05,見圖3)。實驗結(jié)果表明Cel可抑制細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)HCT-8細(xì)胞凋亡。

與0 μmol/L相比,**P<0.01

2.4 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果表明:與0 μmol/L相比,0.5,1.0,2.0 μmol/L雷公藤紅素處理后侵襲的細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.001,見圖4),表明雷公藤紅素可以抑制HCT-8細(xì)胞的侵襲能力。

2.5 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果表明:與0 μmol/L相比,0.5,1.0,2.0 μmol/L雷公藤紅素處理后遷移的細(xì)胞數(shù)量均明顯減少(P<0.001,見圖5),表明雷公藤紅素可以抑制HCT-8細(xì)胞的遷移能力。

與0 μmol/L相比,***P<0.001

2.6 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

通過檢測EMT標(biāo)志性蛋白進(jìn)一步驗證Cel對HCT-8細(xì)胞侵襲遷移的影響。HCT-8細(xì)胞經(jīng)Cel處理后,E-cadherin蛋白表達(dá)量隨Cel濃度升高而增加,Vimentin、Twist、Slug、Snail蛋白表達(dá)量隨Cel濃度降低而減少,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖6)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05,**P<0.01

2.7 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響

活性氧檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示,隨著Cel濃度的增大,DCF的熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)遞增的趨勢,表明HCT-8細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生隨藥物濃度的變化而增加,與0,0.5,1.0 μmol/L相比,2 μmol/L Cel產(chǎn)生的ROS含量是最多的(P<0.05,見圖7)。

圖7 雷公藤紅素對HCT-8細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響

2.8 雷公藤紅素對MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,與0 μmol/L相比,0.5,1.0,2.0 μmol/L雷公藤紅素處理后磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)逐漸減少,p-JNK/p-p38蛋白表達(dá)逐漸增多(P<0.01,見圖8)。結(jié)果表明,雷公藤紅素可能通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放從而激活MAPK信號通路,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖及侵襲遷移的進(jìn)程。

與0 μmol/L相比,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,目前治療方式以手術(shù)輔助放化療為主,但放化療的高毒性和耐藥性以及手術(shù)高復(fù)發(fā)率使得結(jié)腸癌患者總體5年生存率依然很低[9]。因此,需要開發(fā)更多高效低毒的抗癌藥物。雷公藤紅素是中藥雷公藤的醇類提取物的有效成分之一,它正在成為藥用植物中一種潛在的抗腫瘤治療藥物,不僅具有抑制免疫反應(yīng)和抗炎癥作用,還表現(xiàn)出了較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤活性,能起到良好的抗腫瘤效果[10]。

有研究顯示,細(xì)胞凋亡與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及藥物療效關(guān)系密切。Bcl-2蛋白家族是許多導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,Bcl-2屬于Bcl-2蛋白家族中的一員,也是第一個被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白,Bax是Bcl-2的同源基因,它的過表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)使細(xì)胞趨于凋亡[11];底物PARP的被剪切認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的另一個重要指標(biāo)。因此,本研究進(jìn)一步檢測了Cel對HCT-8細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示,Cel可以下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),上調(diào)Bax和PARP剪切帶的表達(dá)。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)期間,癌癥細(xì)胞通過激活幾個特定的信號通路及其下游轉(zhuǎn)錄因子獲得遷移和侵襲表型,長期以來一直被認(rèn)為在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。EMT通常由上皮標(biāo)志物E-cadherin的缺失和間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的增加來定義[13]。且有研究表明,Slug上調(diào)已成為結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和新生血管生成的獨立預(yù)后因素和預(yù)測標(biāo)志物[14,15]。本研究結(jié)果也顯示雷公藤紅素可以通過調(diào)控EMT進(jìn)程從而抑制HCT-8細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?；钚匝?ROS)是腫瘤發(fā)展的一個重要因素,在腫瘤細(xì)胞中,ROS的釋放可進(jìn)一步增強(qiáng)MAPK的活性,進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移過程[16]。Cel通過促進(jìn)了胃癌細(xì)胞中ROS的生成,從而找到了一個開發(fā)癌癥患者治療方法中可能的靶點;通過誘導(dǎo)ROS生成、JNK活化抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖[17]。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK作為MAPK家族的一員,是參與炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵MAPK,其特異性激活的方式是通過對炎癥和應(yīng)激刺激反應(yīng)被磷酸化。本研究中經(jīng)過驗證得出,經(jīng)過不同濃度的雷公藤紅素處理后HCT-8細(xì)胞中ROS水平逐漸遞增,同時JNK、p38 MAPK蛋白的磷酸化表達(dá)水平顯著被上調(diào),表明雷公藤紅素能通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放進(jìn)而激活MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞的凋亡,從而影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。接下來將進(jìn)一步用體內(nèi)實驗對本結(jié)果進(jìn)行驗證,并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制性研究。

綜上所述,本研究證明雷公藤紅素可以抑制結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,其作用機(jī)制可能與MAPK信號通路引起細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程(EMT)有關(guān)。本研究為尋找更加安全有效的抗結(jié)直腸癌新藥提供了部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。