孫璽皓 綜述 唐仕波 陳建蘇 審校

中南大學(xué)愛爾眼科學(xué)院 愛爾眼科研究所,長(zhǎng)沙 410015

遺傳性視網(wǎng)膜疾病(inherited retinal diseases,IRDs)是一類因基因組異常而導(dǎo)致光感受器細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損害的疾病,常造成視力不可逆喪失[1]。目前一些IRDs的致病基因及具體突變位點(diǎn)已經(jīng)明確,但仍缺乏有效的治療方法。隨著第3代基因編輯技術(shù)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein system,Cas)的出現(xiàn),基因治療和細(xì)胞替代治療的可行性增加,為IRDs患者治療帶來了曙光。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的作用機(jī)制

2013年,Charpentier和Doudna在Nature上介紹了一種使用單向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)靶向DNA進(jìn)行切割的細(xì)菌酶,可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌、斑馬魚及人類細(xì)胞等多種生物基因組的編輯[2],并因此獲得了2020年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。目前用于哺乳動(dòng)物基因組編輯的是來源于化膿性鏈球菌(S.pyogenes)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)[3],該系統(tǒng)主要包括核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白和sgRNA,通過識(shí)別、切割、修復(fù)3個(gè)步驟完成對(duì)基因組的編輯[4-5]。先由sgRNA識(shí)別目標(biāo)DNA序列5'端的原間隔序列臨近基序(protospacer adjacent motifs,PAM)來定位需要編輯的位點(diǎn)[6];識(shí)別靶位點(diǎn)后引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶切割靶點(diǎn)位DNA雙鏈,隨后對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行非同源末端鏈接(nonhomologous end joining,NHEJ)修復(fù)或者在有同源修復(fù)模板的情況下進(jìn)行更精準(zhǔn)的同源定向修復(fù)(homology-directed repair,HDR)。

與既往的基因編輯技術(shù)不同,CRISPR/Cas9是通過sgRNA引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶切割目標(biāo)位點(diǎn),故通過改變sgRNA的序列便可重新定位含有PAM區(qū)的目標(biāo)位點(diǎn)[4]。與鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)核酸酶等基因組編輯工具相比,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、構(gòu)建容易,操作周期短等優(yōu)點(diǎn)[7];但同時(shí)其也存在同源重組效率低、易發(fā)生脫靶、可能引起p53激活,PAM區(qū)相對(duì)較窄等問題[8-10]。隨著研究的不斷深入,這些問題逐步得到了解決。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)化

2.1 降低脫靶率

在進(jìn)行基因組編輯時(shí),CRISPR/Cas9可能會(huì)造成目標(biāo)位點(diǎn)之外的基因組改變,這種現(xiàn)象為脫靶效應(yīng)[9]。脫靶不僅發(fā)生在DNA水平,同時(shí)也存在于RNA水平[11],這不僅降低了基因編輯的精準(zhǔn)性,也增加了其不可控的風(fēng)險(xiǎn)。為此研究者通過改變sgRNA的長(zhǎng)度,對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾,使用雙sgRNA識(shí)別靶位點(diǎn),優(yōu)化Cas9蛋白酶的結(jié)構(gòu)等方式降低脫靶率[12-14]。

2.2 提升精準(zhǔn)性

通常Cas9蛋白需在sgRNA的引導(dǎo)下識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn),進(jìn)而造成靶位點(diǎn)附近DNA雙鏈斷裂,同時(shí)引入同源修復(fù)模板,達(dá)到插入或修復(fù)某段DNA的目的。但該過程易造成目標(biāo)位點(diǎn)附近堿基的隨機(jī)插入與缺失,并且其效率因細(xì)胞類型和狀態(tài)、所需編輯的基因組位置以及修復(fù)模板的不同而產(chǎn)生很大差異[15]。為此,研究者開發(fā)了單堿基編輯系統(tǒng),其可以進(jìn)行單個(gè)堿基的編輯,包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器,前者可以實(shí)現(xiàn)編輯窗口內(nèi)單個(gè)堿基C或G到T或A的轉(zhuǎn)換,而后者可以實(shí)現(xiàn)T或A到C或G的轉(zhuǎn)化,但其應(yīng)用范圍較窄[16-18]。隨后,Anzalone等[19]所構(gòu)建的新型堿基編輯系統(tǒng)Prime Editing打破了堿基互換之間的限制,實(shí)現(xiàn)所有類別堿基的自由置換,而且可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)堿基的插入與刪除,進(jìn)一步擴(kuò)大了單堿基編輯系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。但Prime Editing的組成構(gòu)件較大,在一定程度上限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。

2.3 擴(kuò)展編輯范圍

PAM區(qū)的存在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的編輯范圍[20]。Walton等[21]通過改變Cas9蛋白的結(jié)構(gòu),擴(kuò)大了PAM區(qū)的范圍,使Ⅱ型CRISPR/Cas9能夠識(shí)別NYN(Y即C+T)或者NRN(R即A+G)的PAM區(qū)。可將編輯范圍擴(kuò)大至幾乎全基因組的任何位點(diǎn),進(jìn)一步增加了其實(shí)用性。但PAM區(qū)的擴(kuò)大會(huì)降低其特異性,增加脫靶的可能性。

2.4 提高安全性

除了提升CRISPR/Cas9的特異性與有效性之外,提高其安全性也十分重要。Harrington等[22]發(fā)現(xiàn)AcrIIC1可以直接結(jié)合Cas9蛋白保守的催化結(jié)構(gòu)域,而AcrIIC3可以誘導(dǎo)Cas9蛋白二聚化,從而阻止其與靶DNA的結(jié)合,達(dá)到控制Cas9蛋白活性的目的。而Dong等[23]則發(fā)現(xiàn)AcrIIA4蛋白可通過在結(jié)構(gòu)上模擬PAM區(qū),阻止Cas9對(duì)雙鏈DNA底物的識(shí)別,避免細(xì)胞和組織中不必要的基因組編輯。Nihongaki等[24]則通過對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行改造,使其活性可以受光的調(diào)控,進(jìn)而控制CRISPR/Cas9在體內(nèi)外表達(dá)的時(shí)間,降低其長(zhǎng)期表達(dá)所引起的副作用。

3 CRISPR/Cas9在IRDs應(yīng)用途徑與方法

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在IRDs中的應(yīng)用主要包括2個(gè)途徑,即體外或者體內(nèi)基因編輯。體外基因編輯的應(yīng)用主要在細(xì)胞水平矯正人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)或者特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs),然后誘導(dǎo)其分化為視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞,移植到患眼,替代原有的病變細(xì)胞;體內(nèi)基因編輯主要通過相關(guān)的載體將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至體內(nèi),直接糾正異常組織與細(xì)胞基因組中的突變位點(diǎn)。

3.1 體外基因編輯

iPSCs是一類具有自體再生功能的細(xì)胞,通過誘導(dǎo)分化便可以衍生出不同的視網(wǎng)膜細(xì)胞[25]。隨著體外3D視網(wǎng)膜類器官(retinal organoids,ROs)分化方案的不斷完善,分化成熟的視網(wǎng)膜類器官具有一定的生理結(jié)構(gòu)并且包含多種視網(wǎng)膜細(xì)胞[26-27],使其有可能替代傳統(tǒng)的動(dòng)物模型來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,甚至可以將其進(jìn)行移植替代原有的病變組織[28]。而由于CRISPR/Cas9可以精準(zhǔn)地修正基因組突變,故將其和iPSCs聯(lián)合應(yīng)用可以更好地發(fā)揮二者的優(yōu)勢(shì)[29]。

Zhu等[30]將人來源的iPSCs分化的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞植入到視網(wǎng)膜色素變性模型小鼠的視網(wǎng)膜下腔,發(fā)現(xiàn)移植的hiPSCs-RPE細(xì)胞不僅在小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)生整合與替換而且能夠分泌神經(jīng)保護(hù)因子,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化、減少細(xì)胞凋亡,從而抑制光感受器細(xì)胞的丟失。雖然其長(zhǎng)期的安全性和有效性有待確認(rèn),但證明了細(xì)胞替代治療的可行性。Mandai等[31]將iPSCs來源的RPE細(xì)胞移植到新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性患者眼內(nèi),雖然最佳矯正視力沒有改善或惡化,但證明了其可行性。隨后Nishida等[32]通過3D打印模具對(duì)所產(chǎn)生的RPE細(xì)胞植片的形態(tài)進(jìn)行了改良,產(chǎn)生了條狀的人iPSCs來源的RPE細(xì)胞植片,該條狀細(xì)胞植片在體外具有良好的擴(kuò)增效率,而移植到裸鼠的視網(wǎng)膜下腔后,可以與宿主的RPE細(xì)胞整合,并表達(dá)正常的RPE細(xì)胞極性。而若在iPSCs誘導(dǎo)分化前通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)修復(fù)致病位點(diǎn),再將分化成熟的細(xì)胞輸送至病變部位,即可以實(shí)現(xiàn)自體細(xì)胞的替代治療,在一定程度上解決供體匱乏的問題。并且由于移植物來源于患者本身,故在理論上不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)[33]。目前已有臨床試驗(yàn)進(jìn)行了iPSCs來源的RPE細(xì)胞的移植治療,而由于光感受器細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),分化效率較低,分化后的視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,難以獲得高純度的細(xì)胞[34],故iPSCs來源的光感受器相關(guān)細(xì)胞的移植治療距離實(shí)際的臨床應(yīng)用還有相當(dāng)長(zhǎng)的距離。

3.2 體內(nèi)基因編輯

利用基因編輯技術(shù)直接在活體視網(wǎng)膜組織內(nèi)糾正異常的基因組突變位點(diǎn),從而避免iPSCs誘導(dǎo)分化的繁瑣步驟以及外源性細(xì)胞在移植后與周圍細(xì)胞整合的問題[35]。但這需要選擇特異性較高的載體或者采用物理轉(zhuǎn)染的方式將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至體內(nèi)。傳遞載體可以分為病毒載體和非病毒載體,常見的病毒載體有慢病毒、腺病毒(adenovirus,AD)和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)等。慢病毒及AD能夠攜帶較大的基因片段,但其轉(zhuǎn)染效率較低[36];AAV雖然只能攜帶不超過4.7 kb的基因片段,但在體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率較高,并且具有較高的安全性和極低的免疫原性,故應(yīng)用較為廣泛[37]。根據(jù)對(duì)不同組織的轉(zhuǎn)染偏好可以將AAV分為不同的血清型,其中AAV2、AAV5和AAV8在視網(wǎng)膜組織中的轉(zhuǎn)染效率較高[38]。由于AAV裝載量的限制,大多數(shù)情況下需要采用雙AAV包裝CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),但雙AAV的傳遞方案大大降低了體內(nèi)基因編輯的效率[39-40]。非病毒載體的主要優(yōu)勢(shì)便是能夠攜帶更大的基因片段,生物安全性高,較少引起組織的免疫反應(yīng)[41],但轉(zhuǎn)染效率通常較低。鑒于其較高的安全性,可以通過多次注射的方式來提高轉(zhuǎn)染效率。電穿孔作為一種物理轉(zhuǎn)染方法,通過高壓電擊瞬間提高細(xì)胞膜的通透性,可以使外源性分子傳遞至細(xì)胞內(nèi),并且穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[42]。故通過顯微注射聯(lián)合電穿孔的方法可將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至靶細(xì)胞內(nèi)。

Hung等[43]運(yùn)用雙AAV2作為載體將sgRNA和Cas9蛋白通過玻璃體腔注射的方式傳遞至表達(dá)Thy1-黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),抑制YFP在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá),從而在不影響視網(wǎng)膜正常功能的情況下,對(duì)成年小鼠視網(wǎng)膜組織進(jìn)行了基因編輯。但CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在體內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)可能會(huì)增加脫靶率以及引起機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[44]。故Li等[45]進(jìn)一步改進(jìn)了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),使其在視網(wǎng)膜組織中發(fā)揮作用后通過自我干擾的方式降低Cas9蛋白活性,減少持續(xù)表達(dá)所帶來的副作用,從而提高CRISPR/Cas9在體內(nèi)應(yīng)用的安全性。Nishiguchi等[46]設(shè)計(jì)了微同源介導(dǎo)的末端連接,將同源重組片段長(zhǎng)度減少至20 bp,使單個(gè)AAV便能裝載CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的全部元件,并將其應(yīng)用于Gnat1和Pde6c基因突變所致的視桿與視錐細(xì)胞異常小鼠體內(nèi),從而恢復(fù)Gnat1基因表達(dá),挽救視桿細(xì)胞的功能,治療后模型鼠視網(wǎng)膜功能有所恢復(fù),視敏度有所提高。該研究中的基因編輯效率約為10%,高于雙AAV傳遞策略(<5%)[47],從而進(jìn)一步提高了基因編輯的實(shí)用性。

4 CRISPR/Cas9在IRDs中的應(yīng)用

由于IRDs多為單個(gè)基因突變所致,無需進(jìn)行多個(gè)靶位點(diǎn)的修正,并且視網(wǎng)膜下腔處于免疫豁免的狀態(tài)[48],適合應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行治療[49]。

4.1 CRISPR/Cas9在視網(wǎng)膜色素變性中的應(yīng)用

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種常見的遺傳性視網(wǎng)膜退行性疾病[50]。Buskin等[51]運(yùn)用CRISPR/Cas9的HDR方式對(duì)PRPF31基因突變所致RP患者的iPSCs進(jìn)行修復(fù),并與患者來源的視網(wǎng)膜類器官進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)纖毛發(fā)生和細(xì)胞粘附等異常疾病表征得以改善,從而改善RPE發(fā)育。Deng等[52]采用同樣的方法對(duì)RPGR基因突變所致RP患者的iPSCs進(jìn)行修復(fù),得出了與Buskin等[51]類似的結(jié)論。這些研究證明了CRISPR/Cas9在體外糾正IRDs異常表型的潛力。

在體內(nèi)水平,Moreno等[53]通過雙AAV2將靶向抑制NRL基因的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至視網(wǎng)膜色素變性模型小鼠視網(wǎng)膜下腔,抑制繼發(fā)性視錐細(xì)胞丟失,發(fā)現(xiàn)治療后小鼠的視功能有所改善。Bakondi等[54]采用顯微注射聯(lián)合電穿孔的方式將Cas9和sgRNA運(yùn)輸至視紫紅質(zhì)基因S334ter位點(diǎn)突變所導(dǎo)致RP大鼠的視網(wǎng)膜下腔,成功敲除突變的視紫紅質(zhì)等位基因后,發(fā)現(xiàn)大鼠的光感受器凋亡得到抑制,視網(wǎng)膜變性程度有所緩解。這些研究均證明了CRISPR/Cas9在體內(nèi)治療RP的潛力。

4.2 CRISPR/Cas9在遺傳性X連鎖青少年視網(wǎng)膜劈裂癥中的應(yīng)用

遺傳性X連鎖青少年視網(wǎng)膜劈裂癥(hereditary X-linked juvenile retinoschisis,XLRS)是青年男性黃斑變性的主要原因之一[55]。Huang等[56]建立了RS1基因突變(c.625C>T與c.488G>A)所導(dǎo)致XLRS患者來源的iPSCs細(xì)胞系,隨后將iPSCs分化為ROs,在體外重現(xiàn)了XLRS的主要病理特征,包括視網(wǎng)膜劈裂、視黃醇生成缺陷和外節(jié)和纖毛形態(tài)異常。然后Huang等[56]應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)患者來源iPSCs突變位點(diǎn)進(jìn)行修正,并分化為ROs,發(fā)現(xiàn)異常的疾病表型得以修復(fù),在體外證明了CRISPR/Cas9基因編輯的有效性。并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IQCB1和OPA1等基因表達(dá)的下調(diào)也得到恢復(fù),而這些基因的下調(diào)常導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和其他神經(jīng)細(xì)胞之間的通訊障礙,與視神經(jīng)的萎縮有關(guān)[57-58]。Huang等[56]的研究為之后對(duì)XLRS的藥物篩選,發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。而Yang等[59]將CRISPR/Cas9以玻璃體腔注射的方式傳遞至小鼠眼內(nèi),誘導(dǎo)RS1基因編碼區(qū)625位點(diǎn)處的堿基C突變?yōu)門,以體內(nèi)基因編輯的方式構(gòu)建XLRS的動(dòng)物疾病模型。Moore等[60]以無機(jī)納米粒子-納米金剛石作為載體,攜帶整個(gè)CRISPR/Cas9基因編輯的元件以及示蹤熒光標(biāo)記物,從而構(gòu)建RS1 c.625C>T突變所致XLRS的點(diǎn)突變的小鼠疾病模型,雖然模型鼠并未出現(xiàn)視網(wǎng)膜囊腫,但表現(xiàn)出與XLRS相似的病理特征,如視網(wǎng)膜外層厚度減少,感光細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常等。不過該研究并沒有進(jìn)行基因組測(cè)序證實(shí)該位點(diǎn)發(fā)生突變。以上研究證明了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)不僅可以在體內(nèi)外構(gòu)建與患者突變位點(diǎn)一致的細(xì)胞或動(dòng)物疾病模型,而且可以在患者來源的iPSCs內(nèi)糾正其突變位點(diǎn),為后續(xù)在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用以及臨床轉(zhuǎn)化提供了研究基礎(chǔ)。

4.3 CRISPR/Cas9在LCA10中的應(yīng)用

LCA10是由CEP290基因突變所導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳疾病,大多數(shù)患者在嬰兒期便表現(xiàn)出嚴(yán)重的視錐及視桿營(yíng)養(yǎng)不良[61]。由于CEP290編碼序列較大(約7.5 kb),超過了普通AAV的包裝能力,限制了基因替代療法在該疾病中的應(yīng)用[62]。而CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以有效地糾正或刪除特定的DNA片段,恢復(fù)正?；虻谋磉_(dá),使其成為L(zhǎng)CA10潛在的治療方法。Ruan等[63]采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在293T細(xì)胞系中引入CEP290基因突變并采用雙AAV5將CRISPR/Cas9傳遞至野生型小鼠視網(wǎng)膜下腔,進(jìn)而引起CEP290基因第25內(nèi)含子(該內(nèi)含子與人CEP290基因的內(nèi)含子26同源)的缺失,分別成功構(gòu)建了LCA10的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。并且研究了具有自限能力的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),減少其在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)所帶來的副作用。而Maeder等[64]應(yīng)用EDIT-101靶向CEP290基因異常片斷的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)消除了LCA10轉(zhuǎn)基因小鼠中CEP290基因突變所產(chǎn)生的異常剪接供體,從而恢復(fù)CEP290基因的正常表達(dá),逆轉(zhuǎn)光感受器異常。隨后通過視網(wǎng)膜下注射的方式將AAV載體傳遞至非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴眼內(nèi),探討了在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)視網(wǎng)膜內(nèi)進(jìn)行基因編輯的效率與病毒計(jì)量的關(guān)系,當(dāng)病毒的濃度約1.00×1012時(shí),其在視網(wǎng)膜內(nèi)的基因編輯效率能夠到達(dá)(27.9±20.7)%。該研究不僅證明了CRISPR/Cas9具有在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物視網(wǎng)膜內(nèi)編輯基因組的能力,且能夠達(dá)到治療水平(10%的編輯效率)[64]。但有研究發(fā)現(xiàn)以AAV為載體的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)會(huì)引起輕度的炎癥反應(yīng)。這可能是由于AAV作為一種病毒載體具有一定的免疫原性[65]。隨后經(jīng)過不斷的完善優(yōu)化,2018年11月美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了EDIT-101臨床試驗(yàn)新藥的申請(qǐng),允許張鋒團(tuán)隊(duì)開展使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療LCA10的臨床試驗(yàn)(NCT03872479),使LCA10成為眼科領(lǐng)域中首個(gè)嘗試運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行治療的臨床試驗(yàn)。

5 小結(jié)及展望

在體外,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以修正IRDs患者來源的iPSCs突變位點(diǎn),并將其分化為視網(wǎng)膜相關(guān)細(xì)胞,這對(duì)于研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,進(jìn)行藥物篩選以及后續(xù)的細(xì)胞替代治療有著重要的現(xiàn)實(shí)意義;在體內(nèi),可以通過相關(guān)的載體將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)傳遞至眼內(nèi)以糾正IRDs中的基因突變,從而逆轉(zhuǎn)異常的疾病表型,為研究和治療IRDs提供一個(gè)新的方向。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在體外可以通過HDR的方式修復(fù)大部分IRDs的突變位點(diǎn),但由于同源修復(fù)模板的存在,HDR方式在體內(nèi)編輯的效率顯著低于NHEJ方式,因此目前在體內(nèi)水平主要通過NHEJ方式抑制某個(gè)基因的表達(dá),從而糾正異常疾病表型,而單堿基編輯器的出現(xiàn)和不斷迭代為單個(gè)堿基突變引起的IRDs提供了更加精準(zhǔn)的治療方式。故要使CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在臨床上具有更加現(xiàn)實(shí)的意義,還需要進(jìn)一步優(yōu)化其編輯效率,降低脫靶率,提升載體傳遞的安全性和有效性。相信隨著研究的不斷深入,科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,這些問題也將逐步得到解決,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)必將給IRDs患者帶來福音。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突