李雪蓮,冷凌涵,張麗涓,向相,宋家志,陳陶江,韓強(qiáng),王平

膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是繼發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的感染引起的彌漫性腦功能損傷,病死率較高[1-2]。尋找能夠評(píng)估SAE預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要臨床意義。外泌體是直徑為30～150 nm小囊泡,包含蛋白、脂質(zhì)及RNA等[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(long noncoding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1,lncNEAT1)能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元棘突密度,參與SAE的疾病進(jìn)展[4-5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2重疊轉(zhuǎn)錄本(long noncoding RNA SOX2 overlapping transcript,LncSOX2OT) 是調(diào)節(jié)性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box2,SOX2)的非編碼RNA,可導(dǎo)致膿毒癥患者心肌細(xì)胞線粒體功能障礙的發(fā)生[6]。目前SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達(dá)尚不清楚,本研究通過(guò)檢測(cè)SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的表達(dá),分析兩者與生存預(yù)后的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年2月—2022年2月就診于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科的老年SAE患者96例為SAE組,男51例,女45例,年齡 (71.95±6.04)歲;體質(zhì)量指數(shù)(21.07±2.76)kg/m2;受教育年限(4.61±1.85)年;合并癥:高血壓史31例,糖尿病史17例;感染部位:肺部感染42例,尿路感染19例,血液感染22例,腹腔感染13例;根據(jù)SAE患者28 d內(nèi)生存狀態(tài)將SAE組再分為生存亞組(n=50)和死亡亞組(n=46)。以同期診治的無(wú)SAE的膿毒癥患者60例為非SAE組,男33例,女27例,年齡(70.78±5.96)歲;體質(zhì)量指數(shù)(21.18±2.72)kg/m2;受教育年限 (4.69±1.91)年;合并癥:高血壓20例,糖尿病10例;感染部位:肺部感染30例,尿路感染13例,血液感染10例,腹腔感染7例。SAE組和非SAE組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、受教育年限、高血壓史、糖尿病史及感染部位比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(2019SF-106),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①膿毒癥診斷符合膿毒癥3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②SAE診斷排除藥物效應(yīng)、電解質(zhì)紊亂、代謝紊亂及腦膜炎、腦炎等原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)及非感染性全身炎性反應(yīng)等引起的認(rèn)知功能障礙,表現(xiàn)為譫妄,注意力,定向力障礙和書寫能力等受損;③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并顱腦感染、腦血管疾病、腦占位性疾病、阿爾茨海默病及癲癇等顱內(nèi)病變;②肝性腦病、肺性腦病、腎性腦病等其他器官功能障礙繼發(fā)的意識(shí)障礙;③甲狀腺危象,甲狀腺功能減退及糖尿病并發(fā)癥等能夠引起意識(shí)障礙的內(nèi)分泌與代謝性疾病;④水電解質(zhì)紊亂、精神疾病及藥物中毒等引起的意識(shí)障礙;⑤妊娠、哺乳期女性。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè):患者入院后次日留取清晨空腹肘靜脈血5 ml,室溫靜置1 h,2 500 r/min離心10min,留取上層血清。利用外泌體RNA分離提取試劑盒(購(gòu)自北京百奧萊博公司,貨號(hào)BTN180807)提取血清外泌體,取血清0.5 ml加入外泌體分離試劑0.1 ml,4℃室溫孵育30 min,離心去上清,加入緩沖液0.2 ml重懸。加入外泌體核酸提取溶液A 0.6 ml,混勻后靜置3 min,加入溶液B 0.7 ml,混勻后離心加入溶液C 1 ml,離心取上清后加入無(wú)酶水重懸外泌體總RNA 0.2 ml。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,采用熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào)ABI7500)檢測(cè)血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,貨號(hào)SR1110。引物由華大公司設(shè)計(jì)合成。PCR總反應(yīng)體系20 μl:模板 0.5 μl,2×SYBR Green Premix 10 μl,正反向引物各1 μl,無(wú)酶水7.5 μl。反應(yīng)程序:94℃ 預(yù)變性5 min、95℃變性30 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s,變性退火延伸共35個(gè)循環(huán)。引物序列:LncNEAT1正向序列5'-ACGGGCACACATCAAGCATA-3'、反向序列5'-AGCCTCAGCCCCCTATACAA-3',LncSOX2OT正向序列5'-GGGCTCTGTGGTCAAGTCCG-3'、反向序列5'-CGCTCTGGTAGTGCTGGGC-3';GAPDH正向序列5'-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGTCG-3',反向序列:5'-CCACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG-3'。2-ΔΔCt法對(duì)血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.3.2 SAE嚴(yán)重程度評(píng)估:對(duì)96例SAE患者應(yīng)用急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)價(jià)Ⅱ (acute physiology and chronic health evaluationⅡ,APACHEⅡ)進(jìn)行評(píng)分,范圍0～72分,分值越高,病情越重。根據(jù)入院24 h內(nèi)呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)等6個(gè)系統(tǒng)的相應(yīng)參數(shù),進(jìn)行序貫器官衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment,SOFA評(píng)分),范圍0～24分,分值越高,病情越重。

2 結(jié) 果

2.1 2亞組臨床資料比較 死亡亞組SAE患者C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分高于生存亞組(P均<0.01),其他資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 生存亞組與死亡亞組SAE患者臨床資料比較

2.2 SAE組和非SAE組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達(dá)比較 SAE組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT相對(duì)表達(dá)量分別為(2.45±0.65)、(3.02±0.74),明顯高于非SAE組的(0.93±0.34)、(0.85±0.27)(t=16.726、21.803,P均<0.001)。

2.3 2亞組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達(dá)比較 生存亞組血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT相對(duì)表達(dá)量分別為(1.82±0.59)、(2.52±0.69 ),明顯低于死亡亞組 (3.13±0.71 )、( 3.56±0.78)(t=9.861、6.931,P均<0.001)。

2.4 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT表達(dá)與APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT與APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈明顯正相關(guān)(r=0.812,0.761,0.833,0.598,P均<0.001)。

2.5 SAE患者28 d生存預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 以SAE患者28 d生存預(yù)后為因變量(死亡=1,生存=0),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,降鈣素原高、C反應(yīng)蛋白高、神經(jīng)元特異性烯醇化酶高、APACHEⅡ評(píng)分高、SOFA評(píng)分高、LncNEAT1高及LncSOX2OT高是影響SAE患者28 d生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01),見(jiàn)表2。

表2 影響SAE患者28 d生存預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT對(duì)SAE患者28 d生存預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 繪制血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT對(duì)SAE患者28 d生存預(yù)后的評(píng)估價(jià)值的ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT及二者聯(lián)合對(duì)SAE患者28 d生存預(yù)后診斷的AUC分別為0.846、0.834、0.914,二者聯(lián)合高于單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè) (Z=3.864、3.915,P均<0.001),見(jiàn)表3、圖1。

圖1 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT及聯(lián)合對(duì)SAE患者28 d生存預(yù)后的評(píng)估價(jià)值ROC曲線

表3 血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT對(duì)SAE患者28 d生存預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

3 討 論

SAE是膿毒癥常見(jiàn)的并發(fā)癥,患者致殘率、致死率較高[8]。SAE缺乏典型的臨床表現(xiàn),目前無(wú)特異性生物標(biāo)志物及影像學(xué)改變,其診斷過(guò)程仍為排除性診斷。目前認(rèn)為SAE的發(fā)生與神經(jīng)炎性反應(yīng)、血腦屏障功能障礙及氨基酸和神經(jīng)遞質(zhì)異常有關(guān)[9]。雖然炎性反應(yīng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷標(biāo)志物如降鈣素原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等標(biāo)志物一定程度上能夠反映SAE患者病情程度,但在評(píng)估SAE患者預(yù)后方面仍存在敏感度及特異度不高等缺點(diǎn),臨床應(yīng)用價(jià)值有限[10]。深入研究SAE疾病機(jī)制,尋找能夠評(píng)估SAE預(yù)后的生物標(biāo)志物,有利于SAE的早期診治,降低SAE死亡率。

外泌體是細(xì)胞釋放的直徑在幾十納米到幾百納米不等的磷脂雙分子層細(xì)胞外囊泡,能夠使核酸、蛋白等分子進(jìn)行細(xì)胞間通訊[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者血清外泌體中的核酸及蛋白等內(nèi)容物可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞死亡,參與SAE疾病的發(fā)生發(fā)展,是潛在的生物標(biāo)志物[4]。LncNEAT1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的非編碼RNA,其能夠加重膿毒癥患者炎性反應(yīng)感染程度,導(dǎo)致多器官功能衰竭,是新的預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物[11]。本研究中,SAE患者血清外泌體LncNEAT1水平升高,與SAE病情程度有關(guān),提示LncNEAT1參與膿毒癥患者SAE的疾病發(fā)生和發(fā)展。SAE患者血清外泌體LncNEAT1升高與患者機(jī)體炎性反應(yīng)程度較重有關(guān)。研究表明,腫瘤壞死因子α、白介素1β等促炎細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞中LncNEAT1的表達(dá)上調(diào),LncNEAT1能夠以外泌體形式分泌到細(xì)胞外,進(jìn)一步發(fā)揮促炎的生物學(xué)效應(yīng)[11]。此外,LncNEAT1的水平升高能夠使神經(jīng)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙,加重SAE患者病情嚴(yán)重程度。研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥小鼠血清外泌體中LncNEAT1表達(dá)升高,其作為分子海綿結(jié)合微小RNA-9-5p,上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的表達(dá),促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3細(xì)胞的鐵死亡的發(fā)生,導(dǎo)致SAE疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。尚有研究表明,膿毒癥小鼠神經(jīng)細(xì)胞中l(wèi)ncNEAT1表達(dá)明顯增加,lncNEAT1能夠直接與血紅蛋白β亞單位相互作用,抑制突觸后密度蛋白95,降低神經(jīng)元樹(shù)突棘密度,導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙[5]。本研究中,血清外泌體LncNEAT1升高是SAE患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示檢測(cè)SAE患者血清外泌體LncNEAT1水平有助于評(píng)估患者臨床預(yù)后。分析其原因,一方面可能是LncNEAT1的表達(dá)能夠加重患者機(jī)體炎性反應(yīng)程度,促進(jìn)SAE患者病情進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中,LncNEAT1的表達(dá)上調(diào)能夠激活微小RNA-31-5p/POU結(jié)構(gòu)域2類轉(zhuǎn)錄因子1通路,促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放大量白介素1β、腫瘤壞死因子α等促炎細(xì)胞因子,加重膿毒癥疾病嚴(yán)重程度[13]。另一方面,LncNEAT1還能夠通過(guò)激活心肌細(xì)胞中Toll樣受體2/核因子κB信號(hào)通路,促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠心肌細(xì)胞凋亡,增加膿毒癥小鼠死亡率[14]。

LncSOX2OT編碼基因位于人類3號(hào)染色體,表達(dá)于發(fā)育中大腦皮質(zhì),參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化,與惡性腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15-16]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),LncSOX2OT的異常表達(dá)上調(diào)能夠抑制細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá),促進(jìn)人心肌細(xì)胞AC16的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)損傷,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[17]。本研究中,SAE患者血清外泌體LncSOX2OT升高,與病情程度呈正相關(guān),表明LncSOX2OT促進(jìn)SAE的疾病進(jìn)展。LncSOX2OT的表達(dá)升高可能與rs9839776位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性有關(guān),rs9839776位點(diǎn)CC等位基因人群膿毒癥發(fā)生率顯著高于TT等位基因[18]。研究發(fā)現(xiàn),脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥動(dòng)物模型中,LncSOX2OT的表達(dá)上調(diào)能夠抑制SOX2的表達(dá),促進(jìn)線粒體分裂蛋白Drp1的表達(dá)升高,引起線粒體功能障礙,過(guò)度氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙及SAE的發(fā)生[6,19]。本研究證實(shí),血清外泌體LncSOX2OT水平能夠評(píng)估SAE患者的生存預(yù)后。其原因可能是LncSOX2OT能加重SAE患者病情嚴(yán)重程度,導(dǎo)致患者不良預(yù)后。有學(xué)者利用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立C57BL/6J雄性小鼠膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn),LncSOX2OT基因敲除可通過(guò)下調(diào)SOX2表達(dá)抑制膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元凋亡,改善小鼠認(rèn)知功能的損傷,抑制LncSOX2OT/SOX2信號(hào)通路可能是治療或預(yù)防膿毒癥相關(guān)性腦病神經(jīng)退行性變的有效方法[20]。筆者進(jìn)一步繪制ROC曲線,發(fā)現(xiàn)血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT聯(lián)合檢測(cè)對(duì)SAE患者生存預(yù)后具有較高的評(píng)估價(jià)值,診斷的敏感度和特異度分別為0.904,0.813。臨床醫(yī)生可根據(jù)血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平對(duì)SAE患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估,及早進(jìn)行干預(yù)治療,從而改善SAE患者的預(yù)后。

綜上所述,老年SAE患者血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平升高,兩者表達(dá)與APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分呈正相關(guān),均參與SAE的疾病進(jìn)展。血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平升高是影響SAE患者28 d生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,兩項(xiàng)聯(lián)合對(duì)SAE患者28 d生存預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究也存在不足,本研究隨訪時(shí)間有限,未能對(duì)血清外泌體LncNEAT1、LncSOX2OT水平在評(píng)估SAE患者長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙中的臨床價(jià)值進(jìn)行深入研究,有待今后設(shè)計(jì)前瞻性多中心臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李雪蓮:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫;冷凌涵:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理;張麗涓:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;向相:課題設(shè)計(jì),論文撰寫;宋家志:核對(duì)、整理資料,檢查數(shù)據(jù);陳陶江:論文審核,論文修改;韓強(qiáng):參與研究設(shè)計(jì)和試驗(yàn)過(guò)程;王平:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)