穆清爽,劉順,熱依拉·牙合甫,楊新玲

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種進行性呼吸道疾病,被認為是全世界最嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病之一[1]。COPD的具體發(fā)病機制尚不清楚,主要治療方法是改善COPD患者的癥狀,但不能延緩病情進展或降低病死率[2]。因此,需要對COPD的發(fā)病機制不斷進行新的探索以更好地提高COPD預后。目前研究發(fā)現多種微小核糖體核苷酸(micro RNA,miR)參與并影響了呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程,其中miR-155在肺癌、急性肺損傷、肺炎等疾病中均扮演重要角色[3]。除了呼吸系統(tǒng)癥狀及肺功能水平降低外,COPD患者大多伴有不同程度睡眠障礙。以往流行病學調查發(fā)現COPD患者出現失眠癥的概率為35%～77%[4]。合并失眠癥的COPD患者更易產生焦慮、抑郁等負性情緒,日常生活及治療效果也會受到嚴重影響。關于COPD患者失眠癥的發(fā)生發(fā)展機制尚不明晰,其中“生物鐘”學說得到國內外廣泛認可。生物鐘是機體一種內源性的調控系統(tǒng),與人類睡眠質量、睡眠時間及節(jié)律密切相關[5]。以往研究發(fā)現生物鐘相關調節(jié)基因眾多,其中腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1(brain and muscle arnt-like protein1,BMAL1)基因與失眠的出現具有緊密聯系[6]。但miR-155及BMAL1 mRNA在COPD伴失眠的患者中表達特征尚不明晰。基于此,現分析miR-155及BMAL1 mRNA在COPD合并失眠癥患者中的表達水平及與失眠的相關性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年6月—2023年4月新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經內科診治急性發(fā)作伴失眠的COPD患者60例作為觀察組,另外選取同期急性發(fā)作非失眠的COPD患者60例作為對照組。觀察組:年齡(53.97±3.42)歲;體質量指數(BMI)(23.27±2.77)kg/m2;COPD病程(14.56±4.22)年;每日吸煙(13.62±2.05)支,吸煙史(10.17±1.96)年;合并高血壓28例、合并糖尿病31例;COPD分級:Ⅰ級10例,Ⅱ級20例,Ⅲ級21例,Ⅳ級9例。對照組:年齡(53.98±3.96)歲;BMI(23.80±2.59)kg/m2;COPD病程(14.56±4.22)年;每日吸煙(13.07±2.20) 支,吸煙史(10.68±1.76)年;合并高血壓28例、合并糖尿病31例;COPD分級:Ⅰ級11例,Ⅱ級21例,Ⅲ級20例,Ⅳ級8例。2組患者臨床資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準(K20210526-08),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合2021年GOLD指南中氣流嚴重程度分級為2級(中度)的COPD急性發(fā)作診斷標準[7];②符合《失眠癥中醫(yī)臨床實踐指南(WHO/WPO)》中失眠的診斷標準且為首次診斷失眠癥[8];③年齡≥45歲的男性;④有明確、長期吸煙史。(2)排除標準:①COPD發(fā)病前出現失眠癥狀與表現者;②合并嚴重心、肝、腎功能障礙及心血管病、糖尿病等;③合并哮喘、肺氣腫及其他呼吸系統(tǒng)疾病;④藥物濫用者(尼古丁濫用除外);⑤合并睡眠呼吸暫停與其他睡眠障礙。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 樣品采集及保存:患者入院時采集空腹外周血10 ml,于室溫下離心留取上層血清,通過外泌體提取試劑盒(北京愛必信生物科技有限公司生產,貨號 abs50035)提取血清中外泌體并經BM-21AWY透射電子顯微鏡(寰熙醫(yī)療科技有限公司,型號BBF-4)確認,形態(tài)呈杯口狀,直徑40～150 nm。將提取好的外泌體及血清凍存于-80℃冰箱中待后續(xù)檢測。于患者入院第3天行支氣管鏡(徐州益柯達電子科技有限公司)肺泡灌洗術。將氣管鏡嵌入右肺或左肺上葉舌段的一個亞段,注入37℃的生理鹽水120 ml,采集研究對象的第2瓶肺灌洗回收液約50 ml;經四層紗布過濾去除黏液和不溶性粉塵顆粒,4℃保存,分裝后高速離心,留取上清-80℃凍存待測。

1.3.2 miR-155及BMAL1 mRNA表達水平的檢測:上述血清外泌體和肺泡灌洗液上清采用qRT-PCR法檢測miR-155和BMAL1 mRNA表達水平。使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司生產,貨號 15596026) 提取血清外泌體及肺泡上清液樣本中總RNA,使用反轉錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司生產,貨號 RP1105))將提取的總RNA反轉錄為cDNA文庫,所有步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。應用朗基Q2000B-實時熒光定量PCR儀(蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司生產)及天根生化科技(北京)有限公司生產的多重PCR擴增試劑盒(貨號KT109)對miR-155、BMAL1及GAPDH內參進行擴增,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,見表1。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)采用德國QIAGEN公司生產的miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒,qRT-PCR每孔反應體系為20 μl,包括樣本cDNA 2 μl、miScript SYBR Green Mix 10 μl、正向、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μl、ddH2O為6.4 μl。qRT-PCR反應體系設置為95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s,采集信號,共設置45個循環(huán)。每份樣品均設置3個重復孔,通過2-△△CT法計算患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA的相對表達水平。

表1 目標基因及內參基因引物序列

2 結 果

2.1 血清外泌體、肺泡灌洗液miR-155與BMAL1 mRNA水平比較 觀察組患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA表達水平均高于對照組(P<0.01),見表2。

表2 2組COPD患者血清外泌體及肺泡灌洗液上清中miR-155、BMAL1 mRNA水平比較

2.2 miR-155、BMAL1 mRNA水平與失眠癥的相關性分析 將發(fā)生失眠癥賦值=1,未發(fā)生失眠癥賦值=0,通過Spearman相關性分析發(fā)現COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA水平與失眠癥的發(fā)生均存在顯著正相關性(P<0.01),見表3。

表3 COPD患者miR-155、BMAL1 mRNA水平與失眠癥的相關性分析

2.3 COPD患者失眠癥的危險多因素二元Logistic回歸分析 以COPD患者是否發(fā)生失眠癥為因變量,以COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA水平為自變量,進行二元Logistic回歸分析,結果表明:COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA水平增高均是發(fā)生失眠癥的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 Logistic回歸分析影響COPD患者預后的危險因素

2.4 miR-155及BMAL1 mRNA預測COPD患者失眠癥發(fā)生的價值分析 繪制miR-155及BMAL1 mRNA預測COPD患者失眠癥發(fā)生的價值ROC曲線,并計算AUC,結果顯示:COPD患者血清外泌體、肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA獨立及四項聯合預測失眠癥發(fā)生的AUC分別為0.679、0.706、0.719、0.733、0.839,四項聯合優(yōu)于各自單獨預測效能(Z=2.932、2.771、2.693、2.553,P均<0.001),見表5、圖1。

圖1 miR-155及BMAL1 mRNA對COPD患者失眠癥發(fā)生的預測價值ROC曲線

表5 miR-155及BMAL1 mRNA預測COPD患者失眠癥發(fā)生的價值比較

3 討 論

COPD是一種以持續(xù)氣流受限為特征的進行性呼吸系統(tǒng)疾病?？諝馕廴炯又?、吸煙時間增加、吸煙量增多等因素均會導致COPD發(fā)病率及嚴重程度增高,嚴重影響患者生命健康及日常生活,也為家庭和社會帶來沉重的醫(yī)療和經濟負擔[9]。除了嚴重的呼吸系統(tǒng)癥狀和肺功能進行性降低外,COPD患者普遍存在不同嚴重程度的睡眠障礙。關于COPD患者失眠癥發(fā)生的具體機制尚不明晰,可能與患者夜間癥狀加重、持續(xù)負性情緒、反復憋喘等相關[10]。盡管臨床不斷提高對于COPD患者睡眠質量的關注及干預,但效果仍不理想。因此,及早預測COPD患者是否會發(fā)生失眠并在疾病早期進行對癥治療及藥物干預可能更有利于阻止COPD病情加重及合并癥的出現。而尋找特異度高、預測效能大的指標也逐漸成為該領域的研究熱點[11-13]。

miRNA在COPD等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。其中,miR-155作為一種多功能miRNA,在免疫激活、炎性反應、心血管疾病及呼吸系統(tǒng)疾病中均發(fā)揮一定作用[14]。以往研究發(fā)現,miR-155可通過調節(jié)多種miRNAs及促炎性細胞因子的表達間接參與并調節(jié)哮喘、肺炎、肺結核、肺癌等多種肺部疾病[15]。此外,有研究發(fā)現老年COPD患者血清miR-155表達水平顯著增高,且急性加重期的患者增高幅度更明顯,提示血清miR-155水平與COPD的嚴重程度存在相關性[16]。由于miR-155大多參與并調節(jié)不同疾病的炎性反應過程,因此其在COPD中的作用可能也與調控炎性因子水平相關。睡眠節(jié)律相關基因是調控人體睡眠—覺醒活動的主要基因,也被稱為生物鐘相關性基因。人類的生物鐘系統(tǒng)結構較為復雜,主要由視上核交叉(suprachiasmatic nucleus,SCN)和附屬的外周生物鐘系統(tǒng)組成[17]。目前國內外研究確認的生物鐘基因成分包括Clock、BMAL1、Cry1、Cry2、Per1、Per2及Per3等[18-19]。以往研究發(fā)現,在睡眠剝奪的小鼠模型中,SCN組織內BMAL1基因、蛋白水平均顯著升高,提示了BMAL1與失眠發(fā)生的相關性[20]。本研究發(fā)現,合并失眠癥的COPD患者無論血清外泌體還是肺泡灌洗液上清中miR-155及BMAL1 mRNA的表達水平均顯著較高,且經過統(tǒng)計學分析及建模發(fā)現miR-155及BMAL1對于預測COPD患者失眠發(fā)生均具有較好的效能。分析原因,miR-155參與COPD患者失眠發(fā)生的過程可能與促進肺臟及氣道持續(xù)性炎性反應水平增高有關。miR-155在血清及肺泡灌洗液中表達水平增高導致局部促炎性細胞因子分泌增加、抑炎性細胞因子減少,加重了COPD患者氣道反應性及炎性反應微環(huán)境,進而導致患者癥狀加重并影響睡眠[21]。BMAL1基因作為SCN中2類興奮性調節(jié)基因,不論其轉錄水平還是蛋白表達增高均可能引起神經興奮性增強,從而導致患者入睡困難、睡眠質量降低及睡眠時間減少,而持續(xù)性的神經興奮增強必然導致失眠癥的發(fā)生。同時,COPD患者由于癥狀加重或夜間急性發(fā)作導致正常睡眠終止,這種由于疾病本身引起的晝夜節(jié)律紊亂也可能反向導致BMAL1基因表達的失衡。此外,BMAL1基因作為重要的生物鐘基因,可調控生命周期和器官衰老的多種途徑,當BMAL1表達紊亂時,可能導致COPD患者肺部炎性反應水平增高、中性粒細胞浸潤加重及氣道上皮細胞、肺內皮細胞等多種細胞代謝及再生紊亂[22]。

本研究也存在一定局限性。由于受到實際醫(yī)療條件及倫理學的要求限制,無法直接檢測入組患者腦部或SCN組織中miR-155及BMAL1的轉錄水平特征。其次,在多種生物鐘相關基因中,僅選擇了最具有代表性、與失眠發(fā)生相關性較顯著的BMAL1基因作為主要觀察指標,Cry、Per等基因在合并失眠癥的COPD患者體內表達水平變化仍未可知?；谝陨喜蛔?后續(xù)將收集相關標本并篩選其他可能與COPD患者失眠發(fā)生相關的潛在靶點基因。盡管如此,本研究發(fā)現COPD患者血清外泌體及肺泡灌洗液中miR-155及BMAL1水平升高與失眠癥的發(fā)生顯著相關,提示miR-155及BMAL1可能參與COPD相關性失眠的發(fā)生、發(fā)展過程,為未來進一步探究COPD患者失眠的神經病理機制提供潛在靶點。

利益沖突：所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

穆清爽:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;劉順:實施研究過程,分析試驗數據;熱依拉·牙合甫:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改,進行統(tǒng)計學分析;楊新玲:課題設計,論文撰寫