萬晶晶,姚莉,李夢琳,甘艷玲,汪晶

宮頸癌(cervical cancer)的發(fā)病機制與癌基因及微小RNA(miRNA)等表達異常有關(guān),越來越多的研究證實癌基因與miRNA可作為宮頸癌病情及預(yù)后評估的標志物,其敏感度及特異度高于傳統(tǒng)的腫瘤標志物及FIGO分期[1-2]。拓撲異構(gòu)酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,TOP2A)在DNA分裂、修復(fù)重組、轉(zhuǎn)錄等過程中具有調(diào)節(jié)DNA拓撲結(jié)構(gòu)功能,研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者TOP2A表達顯著升高且與臨床病理因素相關(guān)[3]。miR-21具有調(diào)控腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學行為,研究發(fā)現(xiàn)miR-21在宮頸癌中表達顯著升高[4]。目前TOP2A及miR-21在宮頸癌病情及預(yù)后評估中的臨床價值尚無相關(guān)研究。因此,現(xiàn)分析TOP2A聯(lián)合miR-21在宮頸癌病情及預(yù)后評估中的價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集2015年1月—2016年12月武漢市第三醫(yī)院和武漢大學人民醫(yī)院婦產(chǎn)科診治的宮頸癌患者80例為CVC組,另選擇同期宮頸良性疾病(包括宮頸息肉、慢性宮頸炎等)患者45例為對照組(CON組)。2組患者在年齡、病程、卡氏評分、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、高血壓、糖尿病、家族史、宮頸炎、HPV感染等方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),具有可比性,見表1,本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(2015011),患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 CVC組與CON組患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①經(jīng)影像學、宮頸活檢或手術(shù)病理組織學檢查確診;②首次診治,既往無宮頸癌病史且未行手術(shù)、放療、化療及靶向藥物等治療;③卡氏評分≥70分,預(yù)計生存期≥3個月,臨床資料完整。(2)排除標準:合并其他腫瘤、嚴重心肺血管病及子宮繼發(fā)性良惡性腫瘤、精神神經(jīng)疾病等。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 miR-21、TOP2A表達檢測:CVC組患者取腫瘤組織及癌旁組織,CON組患者取宮頸組織。采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)法檢測宮頸癌腫瘤組織、癌旁組織、宮頸組織miR-21及TOP2A表達,其中miR-21上游引物序列為5’-GCTTATCAGACTGATGTTG-3’,下游引物序列為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’;TOP2A上游引物序列為5’-CTAGTTAATGCTGCGGACAACA-3’,下游引物序列為5’-CATTTCGACCACCTGTCACTT-3’。提取各組組織總RNA純化并定量,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行PCR擴增(大連寶生物工程公司),反應(yīng)體系為25 μl,反應(yīng)條件為:45℃孵育15 min,95℃預(yù)變性1 min;55℃退火1 min,68℃延伸擴增1 min,30個循環(huán),最后一輪72℃反應(yīng)5 min。TOP2A選擇GAPDH為內(nèi)參,miR-21選擇U6為內(nèi)參,分別采用2-△△Ct計算TOP2A、miR-21相對表達量。qRT-PCR相關(guān)試劑購自大連寶生物工程公司,PCR儀器購自美國ABI公司(型號HT9700)。

1.3.2 預(yù)后隨訪:CVC組宮頸癌患者每3個月電話或門診隨訪1次,內(nèi)容包括:生存質(zhì)量、腫瘤標志物、治療狀況及生存狀況。隨訪時間至2023年4月(隨訪終點)。統(tǒng)計患者1年預(yù)后(死亡、復(fù)發(fā)、進展、繼發(fā)嚴重并發(fā)癥定義為預(yù)后不良)、總生存期及預(yù)后終點事件(死亡或存活)。

2 結(jié) 果

2.1 TOP2A及miR-21表達比較 CVC組患者腫瘤組織TOP2A及miR-21表達均顯著高于癌旁組織及CON組(P<0.01)。癌旁組織與CON組TOP2A及miR-21表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 CON組和CVC組TOP2A及miR-21表達比較

2.2 TOP2A及miR-21表達在不同臨床/病理因素中差異比較 CVC組腫瘤組織TOP2A及miR-21表達在年齡、HPV感染及病理類型方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),分化程度低分化、組織學分級G3、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ+Ⅳ期患者TOP2A及miR-21表達顯著高于分化程度中—高分化、組織學分級G1+G2、肌層浸潤深度<1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ+Ⅱ期患者(P<0.05),見表3。

表3 宮頸癌腫瘤組織TOP2A及miR-21表達與臨床病理因素的關(guān)系

2.3 預(yù)后情況 CVC組宮頸癌患者隨訪至終點(2023年4月)死亡52例,存活28例;疾病進展(包括復(fù)發(fā))56例;繼發(fā)直腸陰道漏12例、膀胱陰道漏9例、Ⅳ度骨髓抑制25例、Ⅳ度肝腎功能損傷21例。

2.4 TOP2A、miR-21與宮頸癌生存期關(guān)系 CVC組宮頸癌TOP2A≥1.82且miR-21≥1.36患者中位生存期(31.4±5.5)個月低于TOP2A<1.82或miR-21<1.36患者(39.6±6.2)個月(Logrank=8.645,P=0.003)。

2.5 TOP2A及miR-21預(yù)測宮頸癌1年預(yù)后不良效能分析 繪制TOP2A及miR-21預(yù)測宮頸癌1年預(yù)后不良ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,TOP2A、miR-21及二者聯(lián)合預(yù)測宮頸癌1年預(yù)后不良的AUC分別為0.815、0.831、0.927,二者聯(lián)合的AUC最大(Z/P=2.542/0.018、2.218/0.021),見表4、圖1。

圖1 TOP2A、miR-21預(yù)測宮頸癌1年預(yù)后不良ROC曲線

表4 TOP2A及miR-21預(yù)測宮頸癌1年預(yù)后不良效能比較

2.6 宮頸癌患者死亡危險因素分析 以宮頸癌患者是否死亡為因變量(賦值:是為“1”;否為“0”),以表3中P<0.05項目為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,分化程度低分化、組織學分級G3、肌層浸潤深度≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、TOP2A表達≥1.82、miR-21表達≥1.36為宮頸癌死亡的獨立危險因素(P<0.05),見表5。

表5 宮頸癌患者死亡危險因素Logistic回歸分析

3 討 論

TOP2A識別DNA結(jié)構(gòu)后形成復(fù)合物可打斷并重新連接DNA雙鏈,在DNA分裂、修復(fù)重組、轉(zhuǎn)錄等生理過程中具有調(diào)節(jié)DNA拓撲結(jié)構(gòu)功能[5]。TOP2A在腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性生物學行為中具有重要作用,在宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)且與其惡性程度及FIGO分期相關(guān)[3]。TOP2A自身或作為其他基因調(diào)節(jié)靶標參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)TOP2A基因可通過靶向調(diào)控PI3K/AKT等信號通路調(diào)控宮頸癌細胞遷移及侵襲[8]。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織TOP2A基因mRNA及蛋白表達均顯著上調(diào),與宮頸癌惡性程度及FIGO分期相關(guān),TOP2A基因高表達宮頸癌患者預(yù)后及生存期差于低表達患者[9-10]。基于目前的研究進展推測TOP2A在宮頸癌病情及預(yù)后評估中可能具有重要價值,可作為宮頸癌病情及預(yù)后評估的標志物。本研究中,宮頸癌患者腫瘤組織TOP2A表達顯著高于癌旁組織及宮頸良性疾病患者,證實TOP2A基因與宮頸癌發(fā)病機制存在關(guān)聯(lián)。本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)TOP2A表達與分化程度、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期、生存期及死亡風險密切相關(guān),表明TOP2A可作為宮頸癌病情及預(yù)后評估的標志物。

miRNA為內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,主要是通過降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達,在細胞增殖、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用[11-14]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA表達異常與宮頸癌發(fā)生與發(fā)展有關(guān),宮頸癌患者可檢測到miRNA表達異常,在宮頸癌病情及預(yù)后評估、臨床診療中具有重要作用[15-16]。miR-21可通過多種機制調(diào)控細胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學行為,在多種惡性腫瘤發(fā)病機制、病情及預(yù)后評估中具有重要價值[17-20]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21與宮頸癌細胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)[21]。miR-21與局部進展期宮頸癌放療不敏感相關(guān)[22]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-21在宮頸癌患者中表達顯著升高,且與病情及預(yù)后相關(guān)[23-24]。本研究中,宮頸癌患者腫瘤組織miR-21表達顯著高于癌旁組織及宮頸良性疾病患者,表明miR-21與宮頸癌發(fā)病機制相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21表達與分化程度、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期、生存期及死亡風險密切相關(guān),表明miR-21在宮頸癌病情及預(yù)后評估中具有重要價值。

目前宮頸癌病情及預(yù)后評估常用的方法包括腫瘤標志物、影像學檢查及FIGO分期等,前者存在敏感度及特異度低等缺點(目前報道的敏感度及特異度均在0.6～0.8),后者存在受檢查者主觀因素影響大、可重復(fù)性及普適性差等缺點,尤其不適用于無法取得明確病理分期患者,故探討新型高效安全的基因水平標志物更具有臨床價值[25-26]。隨著對宮頸癌發(fā)病機制的深入研究及基因檢測水平的提高,基因水平的標志物可能在宮頸癌病情及預(yù)后評估中具有更高的敏感度及特異度,具有檢測快捷方便等優(yōu)點[27-28]。本研究中TOP2A、miR-21預(yù)測宮頸癌1年預(yù)后不良的AUC、敏感度及特異度高于目前報道的分化程度、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期,尤其是TOP2A聯(lián)合miR-21檢測時AUC、敏感度及特異度顯著升高,表明TOP2A聯(lián)合miR-21檢測在宮頸癌病情及預(yù)后評估中的臨床價值高于傳統(tǒng)的檢測指標。

綜上所述,宮頸癌患者TOP2A及miR-21表達顯著升高,與分化程度、組織學分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期相關(guān),可作為宮頸癌病情及預(yù)后評估的標志物。TOP2A聯(lián)合miR-21檢測可顯著提高預(yù)測宮頸癌預(yù)后不良的敏感度及特異度。值得注意的是,本研究中TOP2A及miR-21依賴于病理標本的檢測仍存在普適性差等缺點,不依賴于病理標本的血清學TOP2A及miR-21可能更具有臨床價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

萬晶晶、甘艷玲:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;姚莉:進行統(tǒng)計學分析;李夢琳:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;汪晶:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫