田玲玲, 羅志輝,顧曉磊,閆 鵬△

(1.荊州市第二人民醫(yī)院,湖北 荊州 434000;2.湖北中醫(yī)藥大學,湖北 武漢 430065)

關節(jié)軟骨指覆蓋于長骨表面的一層薄薄的透明軟骨[1]。由軟骨細胞、蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖、膠原和70%～80%的水組成[2-3]。在運動過程中,負重關節(jié)特別是膝關節(jié)軟骨會承受自身體重數倍的負荷,長期的反復運動或者瞬時的暴力沖擊均會導致關節(jié)損傷[4]。損害后的修復以纖維性愈合為主,這種軟骨不具備透明軟骨的機械性能,容易崩解退變,最終進展為骨性關節(jié)炎并導致關節(jié)疼痛和功能障礙[5-7]。所以,讓關節(jié)軟骨維持在透明軟骨的穩(wěn)定狀態(tài)是治療骨關節(jié)炎的最終目的。

從臨床觀察來看,毫火針對膝骨關節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)療效確切,不僅能夠緩解患者的疼痛程度,還可以改善患者的生活質量[8-9]。但毫火針治療KOA的具體機制尚不十分清楚?；诖?本研究首先建立KOA模型大鼠,然后分組進行干預。著重從以下4個方面進行評估,一是觀察毫火針對KOA運動功能的改善情況;二是觀察毫火針對關節(jié)內炎性微環(huán)境的調節(jié)作用;三是觀察毫火針對KOA分子機制的改變及通路的調節(jié)情況;四是觀察毫火針對關節(jié)軟骨病理改變的修復程度。

由此我們可以清楚地看到，王鉆清在詩歌寫作中，并非像某些詩歌寫作者那樣，僅僅是滿足于卡拉OK似的自娛自樂，而是有著更加開闊的詩歌藝術境界和宏偉的寫作抱負。王鉆清是一個博覽群書，對于中國傳統(tǒng)文化有著深厚學養(yǎng)的學者型和性情詩人。在詩歌寫作中，他不屑于表現那種個人的小情趣和井蛙之見，而常常將目光轉到整個的人類和古老的歷史，正是因為有了這樣密切關乎人類命運和心靈的哲學思考，我們在閱讀王鉆清的詩歌時，才能夠深深地感受到那種與眾不同，直擊人心，撼人心魄的藝術力量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

48只清潔級SD大鼠,雌雄各半,體質量155～170 g,購自湖北省實驗動物研究中心[許可證號:SCXK(鄂)-2020-0018]。所有動物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院中心實驗室,室內空氣流通,室溫(25±2)℃,相對濕度為60%,并進行12 h晝夜循環(huán)光照條件。經適應性喂養(yǎng)1 周后按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、毫火針組和普通毫針組,每組12只。整個實驗全程遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 木瓜蛋白酶(貨號:P4762,sigma公司);0.30 mm×25 mm華佗牌毫針(蘇州醫(yī)療用品有限公司);聚合酶鏈反應(qRT-PCR)相關試劑:SYBR(DBI公司,德國);ELISA試劑盒(北京歐北生物科技有限公司);6×上樣緩沖液、TRIZOL、逆轉錄試劑盒和核酸(TAKALA公司);單克隆抗體COL-Ⅱ和IL-1β(武漢博士德生物技術有限公司)。

與空白組比較,模型組的COL-Ⅱ和SOX9顯著下降(P<0.01),IL-1β和TNF-α顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,毫火針組的COL-Ⅱ和SOX9明顯升高(P<0.05或P<0.01),IL-1β和TNF-α明顯降低(P<0.05);毫針組的COL-Ⅱ顯著升高(P<0.05),其余沒有明顯變化。與毫火針組比較,毫針組的COL-Ⅱ和SOX9明顯下降,但差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05);IL-1β和TNF-α顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見表4和圖1。

1.3 造模方法

“老婆，咱們終于發(fā)達了！”他一邊說，還一邊打著嗝，隔老遠都能聞到酒味，不一會兒酒味就充斥了整個屋子。看到他滿臉潮紅，我心里有說不出的滋味。

首先制備4%的木瓜蛋白酶溶液,除正常組外大鼠按照0.25 mL/kg進行右膝關節(jié)腔注射。注射時間為第1、3與7天。正常組膝關節(jié)腔注射等量生理鹽水[10]。在此期間密切觀察大鼠飲食、精神、大小便和右后肢末梢循環(huán)。

1.4 干預方式

空白組不做任何處理,僅同時抓取捆綁。其余3組抓取捆綁固定后,用酒精燈外焰將毫針燒至紅白,快速點刺患肢的“內膝眼”“犢鼻”“足三里”,每穴3～5下,點刺深度為1～2 mm,每周3次。參照《實驗針灸學》[11]和大鼠穴位圖譜進行取穴,每周3次,1個月后觀察療效。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 行為學觀察 于造模成功后和每周干預結束后對大鼠進行步態(tài)和爪壓的行為學進行評估。將大鼠放入3 m×3 m的無障礙場地中,自由活動5 min后觀察大鼠步態(tài);將大鼠置于大小為25 cm×25 cm×20 cm的透明玻璃室中,在玻璃室下面有一面呈45°放置的鏡子,以便清晰地觀察大鼠足部,使其自由活動5 min,評估大鼠右后爪壓[12]。

公共圖書館的服務品牌是服務項目或服務機構加上之外的附加值。在公共圖書館的服務項目和服務活動中，體現出服務的優(yōu)勢、特色和強項并據以展示其服務的美譽度和影響力，是一個圖書館最具識別度的形象文化呈現。最優(yōu)秀的服務品牌往往是一個圖書館、乃至一個城市甚至一個國家文化的名片。

1.5.2 分子生物學檢測 行為學評估結束后,用1%戊巴比妥(0.6 mL/100 g)腹腔注射進行麻醉,將其仰臥固定于手術臺上,右側膝關節(jié)剃毛后常規(guī)消毒,然后用注射器抽取關節(jié)液進行ELISA檢測。檢測指標為白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。軟骨組織于液氮中研磨,加入RIPA裂解液以及1 mol/L的PMSF進行超聲勻漿裂解,然后以4 ℃、12 000 r/min離心15 min取上清液5 μL進行蛋白定量,將裂解后的蛋白樣品按1∶4的比例加入5×的SDS蛋白上樣緩沖液混勻,最后在100 ℃沸水中加熱5 min使蛋白充分變性,儲存于-20 ℃保存待測。蛋白樣品經10%的分離膠和5%濃縮膠凝膠電泳后,根據Marker位置切取目的條帶和內參條帶,再將蛋白于預冷的轉膜液里轉至PVDF膜,PVDF膜經5%脫脂牛奶封閉1～2 h后,孵育一抗過夜,次日孵育二抗洗膜30 min后按1∶1比例配制ECL顯影液滴加到膜上于ScnImage image analysis software凝膠成像系統(tǒng)中拍攝掃描圖片,Image J軟件分析條帶灰度值,以GAPDH灰度值為內參。用Trizol裂解液收集各組軟骨組織并提取總RNA,然后用Nano Drop蛋白核酸定量儀檢測RNA濃度。用日本TOYOBO公司的反轉錄試劑盒把提取出來的RNA反轉錄為cDNA。構建熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)體系,20 μL包括10 μL SYBR Mixture,1μL的上游引物和下游引物,1μL的cDNA樣本,然后加DEPC水至20 μL。設置反應條件,39個循環(huán)后檢測溶解曲線,每組設3個復孔,以GAPDH 內參。各組 CT值按公式 2-ΔΔCT,然后計算相關指標的相對表達量。相關基因的引物序列見表1。

表1 目的基因和內參基因的引物序列

1.5.3 病理學檢測 取材后將軟骨標本置于4%多聚甲醛中固定,24 h后純水沖洗,石蠟包埋。結束后用冰凍切片機切成2～3 μm的切片,然后進行免疫組織化學染色和甲苯胺藍染色。根據染色切片觀察軟骨膠原纖維修復情況,評估其修復程度。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有實驗數據表示為均值±標準差。使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,使用GraphPad 6.0軟件進行數據轉化。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.1.2 材料和儀器 CCR9、TLR4引物來源于北京鼎國生物技術有限公司。9700PCR儀來源于美國ABI公司。兔抗人CCR9、TLR4及羊抗兔二抗來源于美國SantCruz公司。

2 結果

2.1 各組步態(tài)及爪壓評估

用ELISA法檢測各組大鼠關節(jié)液中炎癥相關指標白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。與空白組比較,模型組的IL-1β和TNF-α均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,毫火針組和毫針組的IL-1β和TNF-α均顯著下降(P<0.05或P<0.01)。與毫火針組比較,毫針組的IL-1β和TNF-α均顯著升高(P<0.01)。見表6。

表2 各組大鼠步態(tài)評估

表3 各組大鼠爪壓評估

2.2 毫火針對軟骨炎性微環(huán)境mRNA的影響

1.2.2 儀器 實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司,美國);電泳儀及轉膜儀(Bio-Rad公司,美國);微量移液槍(Sanyo,日本);超凈工作臺VCM-620(再鑫儀器有限公司,中國);恒溫搖床MR-570(優(yōu)寧博儀器有限公司,中國);ELB700酶標儀( Bio-Tek 公司,美國);熒光倒置相差顯微鏡(LEICA公司,德國);低溫高速離心機D3035(SCILOGEX公司,美國);斡旋振蕩器和瞬時離心機YN-3524(優(yōu)寧博儀器有限公司,中國)。

石英占礦物總量的56.1%，主要呈他形、半自形粒狀以及粒狀集合體分布(圖1a、圖1c)，粒度約為0.1～8 mm。黃鐵礦、黃銅礦、閃鋅礦和磁黃鐵礦等硫化物礦物常分布于石英粒間以及多個石英顆粒組成的粒間孔洞中；黃銅礦、閃鋅礦和方鉛礦等硫化物礦物集合體常發(fā)育于石英裂隙和粒間孔洞中(圖1a、圖1b)，由于受到應力作用的影響，粒徑較大的石英常具波狀消光及應力裂紋。

圖1 mRNA溶解曲線圖

表4 毫火針對軟骨炎性微環(huán)境mRNA的影響

2.3 毫火針對大鼠軟骨表型蛋白的影響

問題一：寫作范圍大而無當，寫作內容雜亂無章。有些學生在習作中描寫美麗的校園，從小學部寫到幼兒園，從大樟樹到農場里的蔬菜，東拉西扯，雜亂無章，導致文章雖然篇幅很長，但卻不能突出重點。

二型膠原(COL-Ⅱ)是軟骨組織的特異性表達蛋白,是維持軟骨穩(wěn)態(tài)重要的參考依據。與空白組比較,模型組的COL-Ⅱ顯著下降(P<0.05),IL-1β顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,毫火針組的COL-Ⅱ明顯升高(P<0.01),IL-1β顯著降低(P<0.01);毫針組的COL-Ⅱ顯著升高(P<0.01),IL-1β顯著降低(P<0.01)。與毫火針組比較,毫針組的COL-Ⅱ顯著下降(P<0.05),IL-1β顯著升高(P<0.05)。見圖2、表5。

圖2 毫火針對大鼠軟骨表型蛋白的表達情況

表5 毫火針對OA大鼠軟骨表型蛋白相對表達量

2.4 毫火針對大鼠炎性微環(huán)境的影響

經過4周的干預,與空白組比較,模型組的步態(tài)和爪壓評分均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較,毫火針組與毫針組均顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與毫火針組比較,毫針組步態(tài)和爪壓評分均顯著更高(P<0.01)。見表2和表3。

表6 毫火針對大鼠炎性微環(huán)境的影響

2.5 免疫組織化學分析軟骨損壞情況

COL-Ⅱ是軟骨組織的標志性表達蛋白,而IL-1β是評估軟骨炎性程度的重要指標。與空白組比較,COL-Ⅱ模型組表達相對較少,經過干預后的毫火針組表達增多,而單純的毫針組改變不明顯。IL-1β的表達情況則相反,在模型組表達較多,經治療后的毫火針組明顯減少,單純的毫針治療不及毫火針治療效果好。見圖3。

圖3 免疫組織化學分析軟骨損壞情況(200×)

2.6 甲苯胺藍染色評估各組軟骨形態(tài)

各組大鼠的膝關節(jié)軟骨組織經包埋、脫蠟、切片及染色后鏡下觀察可知,空白組關節(jié)面較平滑,以透明軟骨為主。模型組的關節(jié)面出現了崩塌,后期的恢復絕大部分以纖維軟骨為主,極易發(fā)展為骨關節(jié)炎并持續(xù)循環(huán)加重。經毫火針治療的關節(jié)軟骨平面明顯優(yōu)于模型組。與毫火針組比較,單純的毫針治療效果不及毫火針。見圖4。

圖4 甲苯胺藍染色評估各組軟骨形態(tài)(200×)

3 討論

關節(jié)軟骨是覆蓋于骨關節(jié)表面的透明軟骨,成人厚度約為3 mm[13]。從軟骨表面到干骺端依次分為淺表區(qū)、中間區(qū)、深區(qū)和鈣化區(qū)4層[14]。主要由軟骨細胞、膠原、蛋白聚糖和大量的水組成,光滑有序的排列降低了運動時的摩擦系數,減輕磨損程度。因缺乏潛在的干細胞龕和軟骨前體細胞,軟骨細胞數量少和豐富的細胞外基質包繞遷移能力弱,所以軟骨損傷后的自然修復以纖維軟骨為主,最終會進展為骨性關節(jié)炎導致關節(jié)疼痛和功能障礙[15-16]。軟骨穩(wěn)態(tài)就是利用一切方法讓軟骨保持在一個相對平穩(wěn)的狀態(tài)。二型膠原是軟骨組織的特異性表達蛋白,他的表達從一定程度上表達了軟骨狀態(tài)的優(yōu)劣[17]。白介素-1β是對關節(jié)炎性程度的一個直接切入點,通過不同的干預方式綜合觀察軟骨的特異性表達蛋白和炎性程度,可以對KOA的進程和轉歸進行一個粗略的評估[18]。

膝骨性關節(jié)炎在中醫(yī)學中隸屬于“膝痹”“骨痹”等范疇。病因病機表現為風寒之邪侵襲經絡,瘀滯不通,發(fā)而為病。臨床常見的癥狀有雙膝冷痛,遇寒加重,得溫痛減[19]。治寒以熱,毫火針既有普通針刺的疏通作用,又具備了火針的溫熱之性,在臨床治療中取得較好的效果[20-21]。李志娟等[12]的研究中,把火針的這種治療作用總結為“破”和“立”的關系,通關打破一個舊的、病理的狀態(tài),引發(fā)一系列的級聯(lián)反應,最終創(chuàng)立一個新的,生理的穩(wěn)態(tài),來達到一個健康水平。王研[19]運用毫火針留刺法對30例寒濕痹阻型KOA患者進行治療,結果顯示,毫火針組的治療總有效率為89.66%,高于單純普通毫針治療的70%。并且毫火針組的VAS評分、Lysholm膝關節(jié)評分和中醫(yī)證候群評分均高于普通針刺組。上述可知,毫火針能有效緩解膝關節(jié)疼痛、功能障礙,并且在一定程度上延緩其病理進程。

在本實驗結果中也發(fā)現,毫火針不僅可以緩解疼痛和功能障礙,在減輕炎癥和病理形態(tài)的損傷方面,也有一定的作用。從行為學角度而言,毫火針的治療可以明顯緩解因炎癥導致的步態(tài)和爪壓的異常改變。從分子生物學角度來看,軟骨特異性表達蛋白COL-Ⅱ和SOX9在毫火針治療后都有明顯的高表達,而炎性相關指標IL-1β和TNF-α均顯著下降。從病理形態(tài)學來看,模型組的關節(jié)面粗糙,后期的恢復絕大部分以纖維軟骨為主,極易發(fā)展為骨關節(jié)炎并持續(xù)循環(huán)加重。經毫火針治療的關節(jié)軟骨平面明顯改善。前述可知,毫火針這一療法不僅可以改善KOA患者的功能,在生理病理上對骨關節(jié)炎的防治作用也是有積極意義,可以在臨床中普遍開展并推廣。

綜上所述,本研究用木瓜蛋白酶注射關節(jié)造成SD大鼠體內KOA模型,探討毫火針對KOA的軟骨穩(wěn)態(tài)維持作用。毫火針可以有效促進二型膠原的表達,同時還可以減輕SD大鼠的炎性損傷。其發(fā)揮作用的具體機制可能是激活SOX9通路進而影響軟骨的穩(wěn)態(tài),但其中的具體關系還需要進一步地研究和探索。