曾 欣,劉曉玲,褚洪川,汪欣月,張安然,郭長青

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種常見的退行性骨關(guān)節(jié)病,多發(fā)于中老年人群[1]。其病變特征主要是關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的結(jié)構(gòu)改變,同時(shí)還累及周圍的關(guān)節(jié)囊、滑膜、肌肉和韌帶[2-3]。Hurley M V[4]提出肌肉功能障礙導(dǎo)致的關(guān)節(jié)生物應(yīng)力失衡是KOA重要的危險(xiǎn)因素。許多橫斷面研究[5-6]證實(shí)KOA患者的膝關(guān)節(jié)屈伸肌群肌力較正常人明顯降低。Xu J等[7]進(jìn)一步證實(shí)股四頭肌萎縮導(dǎo)致軟骨變性和骨贅形成,影響骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。前期研究[8]已表明針刀干預(yù)能促進(jìn)膝關(guān)節(jié)周圍肌肉的修復(fù),改善軟組織的生物力學(xué)特性以恢復(fù)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性[9-10],但具體機(jī)制尚未完全清楚。p16和p21是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組分[11],能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[12],與肌肉萎縮密切相關(guān)[13]。本研究將通過Western Blot法檢測針刀治療后KOA兔股直肌內(nèi)p16、p21的蛋白表達(dá)變化,探討針刀修復(fù)萎縮股直肌以改善KOA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6月齡雄兔24只,體質(zhì)量(2.50±0.2)kg,購買自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司(動(dòng)物批號:SYXK京2016-0013,清潔級新西蘭大白兔,質(zhì)量合格證號:DH201601958)。本實(shí)驗(yàn)于北京中醫(yī)藥大學(xué)良鄉(xiāng)校區(qū)動(dòng)物房完成,恒溫20～22 ℃,相對濕度40%～60%,單籠飼養(yǎng),自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵守北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會的倫理要求。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 4%多聚甲醛、伊紅和蘇木素(北京百諾威生物科技有限公司);50%/70%/80%/90%/95%/100%酒精(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);二甲苯(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司);石蠟(北京化學(xué)試劑公司);HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);PMSF蛋白酶抑制劑(美國Thermo Scientific公司);RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、1.5MTris·HCl緩沖液、1.0MTris·HCl緩沖液、30%丙烯酰胺、10×SDS-PAGE電泳緩沖液、10×蛋白電轉(zhuǎn)緩沖液10×封閉、洗滌緩沖液和Tween20(北京索萊寶科技有限公司);AP(北京PPLYGEN有限公司);TEMED(美國Sigma公司);蛋白彩色Marker(北京博邁德生物技術(shù)有限公司);山羊抗兔IgG(美國Abcam公司);PVDF膜(Millipore公司);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、Anti-p16、Anti-p21、新型抗體稀釋液和GAPDHR(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.2.2 儀器 華友牌針刀(0.4 mm×40 mm,北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司);脫水機(jī)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);石蠟切片機(jī)(美國Thermo Scientific公司);Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司);FMIOO制冰機(jī)(美國GRANT公司);-20℃/4℃冰箱、-80℃冰箱(日本SANYO公司);液氮罐(上海博谷公司);微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);手掌型離心機(jī)(LX-100型,江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司);蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、Chem Doc XRS+成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司);電子天平(ME203E/02型,上海梅特勒-托利多儀器有限公司);超純水機(jī)(AK-RO-C2型,艾肯水精靈);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京利康科技發(fā)展有限公司);水平搖床(北京TAYASAF公司);多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司);X線暗盒、D72顯影粉和D72定影粉(北京PPLYGEN有限公司);感光膠片(北京CWBIO有限公司)。

1.3 分組與造模

1.3.1 分組 24只新西蘭兔編號,按隨機(jī)數(shù)表法分為正常組、模型組、針刀組與電針組,每組6只。

1.3.2 造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,模型組、針刀組和電針組均采用Videman左后膝伸直位固定制動(dòng)法建立KOA模型。將兔麻醉后,仰臥固定于兔臺上,牽拉左下肢使膝關(guān)節(jié)伸直180°位,踝關(guān)節(jié)背屈60°位。用樹脂繃帶包繞經(jīng)熱水浸泡軟化的脫脂棉墊,從腹股溝到趾頭固定動(dòng)物左下肢,再用醫(yī)用紗布將樹脂繃帶固定,外纏2層高分子樹脂繃帶,并外套絲襪防動(dòng)物撕咬,制動(dòng)6周。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 正常組 正常飼養(yǎng),不予任何處理。

1.4.2 模型組 造模后正常飼養(yǎng),不予干預(yù)治療。

1.4.3 針刀組 造模成功1周后進(jìn)行針刀治療,遵循《針刀醫(yī)學(xué)》[14]中針刀操作四步規(guī)程法。將KOA兔固定后,在(股內(nèi)、外側(cè)肌腱、股二頭和鵝足腱囊)股直肌周圍選擇2～3個(gè)條索結(jié)節(jié)點(diǎn),常規(guī)備皮后,左手加壓分離,右手持針刀垂直皮膚刺入,保持刀柄方向與肌腱走勢相同,著重松解條索結(jié)節(jié)以及肌腱和骨面連接處,每點(diǎn)松解2～3刀,操作完成后拔出針刀并按壓止血。每周治療3次,治療3周,共治療9次。

1.4.4 電針組 造模成功1周后進(jìn)行電針治療,根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[15]結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法,選取梁丘、血海、內(nèi)膝眼和外膝眼穴,用毫針刺入5 mm,針柄分別連接韓式穴位神經(jīng)刺激儀,進(jìn)行電針治療(波形疏密波,頻率2/100 Hz,強(qiáng)度3 mA,10 min/次)。每周治療3次,治療3周,共治療9次。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 兔行為學(xué)評價(jià) 分別在造模成功后和治療結(jié)束后,采用改良的Lequesne MG[16]膝關(guān)節(jié)級別評估法對各組KOA兔患肢膝關(guān)節(jié)進(jìn)行測量評估。總評價(jià)包括疼痛、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動(dòng)度及關(guān)節(jié)腫脹程度,兩名實(shí)驗(yàn)人員同時(shí)評估并各自打分,結(jié)果取均值并記錄。并采用關(guān)節(jié)測量角度尺測量各組KOA兔左后肢膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)范圍(Passive range of motion,PROM)。分別測量關(guān)節(jié)伸展角度與屈曲角度,計(jì)算差值并記錄。

1.5.2 取材方法 將各組家兔麻醉處死,左后肢備皮干凈后于股骨近髕骨的前側(cè)開口,剝離淺層筋膜,于髕上2 cm處切除兩份規(guī)格為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的股直肌標(biāo)本。一份迅速裝瓶并液氮保存,另一份生理鹽水沖洗后浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h,以備光鏡觀察。

1.5.3 兔股直肌形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色法,將固定的肌肉組織取出,梯度酒精脫水,透明,浸蠟,包埋,切片,蘇木素染色,返藍(lán),伊紅染色,常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封片。在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍照,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野的圖像,采用ImagePro Plus 6.0軟件分析圖像并計(jì)算固定視野內(nèi)肌纖維數(shù)和肌纖維平均橫截面積,觀察肌肉及肌腱病理改變情況。

1.5.4 兔股直肌中p16、p21蛋白表達(dá)檢測 采用Western Blot法檢測,取凍存的兔左后肢的股直肌組織,研磨后,于冰上用RIPA裂解液進(jìn)行裂解,離心取上層清液,BCA法測定蛋白濃度。電泳后進(jìn)行電轉(zhuǎn)、封閉,并用PBS稀釋液稀釋一抗p16、p21(稀釋度1∶2 000),4 ℃搖床過夜, 充分漂洗后加山羊抗兔IgG(二抗)(稀釋度1∶20 000),孵育后充分漂洗?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色,用GAPDH做內(nèi)參重復(fù)以上步驟。顯影后用ImageLab進(jìn)行蛋白條帶的數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兔行為學(xué)評價(jià)

2.1.1 Lequesne MG指數(shù)評分 模型組、針刀組及電針組的兔Lequesne MG評分均顯著高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后,針刀組與電針組均低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針組比較,針刀組Lequesne MG評分降低程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組兔Lequesne MG指數(shù)評分比較

2.1.2 膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)范圍 模型組、針刀組及電針組的兔PROM均顯著低于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后,針刀組與電針組均高于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針組比較,針刀組PROM增高程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組兔膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)范圍比較

2.2 兔股直肌形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1 兔股直肌HE染色結(jié)果 正常組肌束排列整齊有序、大小均勻,細(xì)胞間隙勻稱且未見水腫及炎細(xì)胞浸潤。模型組肌束排列紊亂、大小不一,多個(gè)肌纖維萎縮,細(xì)胞間質(zhì)水腫,少量炎細(xì)胞浸潤。針刀組及電針組較模型組均出現(xiàn)肌細(xì)胞的增大和再生,細(xì)胞間質(zhì)水腫及炎細(xì)胞浸潤減輕。見圖1。

圖1 各組股直肌肌纖維橫截面形態(tài)圖(200×)

2.2.2 兔股直肌纖維橫截面積 與正常組比較,模型組肌纖維橫截面積顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);干預(yù)后,針刀組和電針組與模型組相比,肌纖維橫截面有所恢復(fù),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針組比較,針刀組肌纖維橫截面積增多程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組股直肌肌纖維橫截面積與肌細(xì)胞數(shù)量比較

2.2.3 兔股直肌肌細(xì)胞數(shù)量 與正常組比較,模型組肌細(xì)胞數(shù)量顯著增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);干預(yù)后,針刀組和電針組與模型組比較,肌細(xì)胞數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針組比較,針刀組肌細(xì)胞數(shù)量減少程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.3 股直肌中p16、p21蛋白表達(dá)情況

Western blot法檢測各組實(shí)驗(yàn)兔股直肌中p16、p21蛋白表達(dá)。與正常組比較,模型組p16蛋白表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,針刀組和電針組p16蛋白表達(dá)均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與電針組比較,針刀組p16蛋白表達(dá)降低程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較,模型組、針刀組和電針組的p21蛋白表達(dá)均呈不同程度升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,針刀組和電針組p21蛋白表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與電針組比較,針刀組p21蛋白表達(dá)降低程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組兔股直肌p16和p21蛋白表達(dá)條帶

表4 各組兔股直肌p16和p21蛋白表達(dá)比較

3 討論

股四頭肌是唯一伸膝關(guān)節(jié)肌群,在維持膝關(guān)節(jié)力學(xué)平衡中至關(guān)重要。新的研究表明[7],肌肉質(zhì)量和力量的下降使關(guān)節(jié)容易疲勞,從而影響軟骨的營養(yǎng)供應(yīng)與軟骨下骨的異常變化。伴隨疼痛和局部腫脹等病理變化的發(fā)生,KOA患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙改變了膝關(guān)節(jié)局部生物力學(xué)平衡,進(jìn)一步導(dǎo)致股四頭肌肌力減退,并形成惡性循環(huán)[17]。這與中醫(yī)對KOA的認(rèn)識相符。

膝骨關(guān)節(jié)炎又稱“痹證”,存在由“筋痹”到“骨痹”的轉(zhuǎn)變過程[18]。邱峰等[19]認(rèn)為,“膝之筋”由膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉、肌腱、韌帶及關(guān)節(jié)囊等構(gòu)成,“膝為筋之府”,經(jīng)筋在膝關(guān)節(jié)的力學(xué)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[20-22]。針刀治療KOA恰恰是通過松解膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉、韌帶等軟組織的粘連和攣縮,改善膝關(guān)節(jié)的超負(fù)荷應(yīng)力狀態(tài),同時(shí)使局部血管、神經(jīng)末梢得以恢復(fù),促進(jìn)組織的修復(fù)。即通過“調(diào)筋”以恢復(fù)經(jīng)筋“束骨利關(guān)節(jié)”的功能[23]。本研究團(tuán)隊(duì)前期證實(shí)了針刀能夠促進(jìn)股直肌的蛋白質(zhì)合成及抑制其降解,改善肌肉力學(xué)性能,延緩軟骨退變,促進(jìn)軟骨的修復(fù),以實(shí)現(xiàn)“調(diào)筋治骨”,可見“調(diào)筋”是針刀治療KOA關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

細(xì)胞衰老是指由各種類型的應(yīng)激導(dǎo)致的不可逆的細(xì)胞周期停滯和獨(dú)特的細(xì)胞表型改變的過程,包括基因表達(dá)、抗凋亡通路激活、促炎癥分泌或衰老相關(guān)分泌表型(SASP)的表達(dá)[24-25]。積累的衰老細(xì)胞產(chǎn)生SASP分子,通過自分泌或旁分泌方式作用于衰老細(xì)胞以及鄰近細(xì)胞,從而加劇和傳播促衰老效應(yīng)[12,26],最終損害再生并介導(dǎo)生物組織的炎癥[27]。這可能是肌肉細(xì)胞衰老和肌纖維萎縮的基礎(chǔ)[13]。相關(guān)研究[28]表明衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)重塑蛋白和生長因子,被證實(shí)與KOA炎癥的介質(zhì)重疊。因此,局部消除衰老細(xì)胞以阻斷SASP獲取,抑制細(xì)胞衰老進(jìn)程和減少骨骼肌萎縮被認(rèn)為是KOA可能有效的治療策略[12]。綜上所述,抑制KOA股直肌細(xì)胞的衰老成了針刀干預(yù)改善股直肌功能的突破口。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合Lequesne MG指數(shù)評分和PROM評估的結(jié)果,證實(shí)針刀干預(yù)能夠顯著地改善實(shí)驗(yàn)兔的膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)范圍,恢復(fù)膝關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能,是對前期針刀干預(yù)促進(jìn)KOA兔股直肌修復(fù)作用機(jī)制的進(jìn)一步深入。

一般認(rèn)為,分子應(yīng)激反應(yīng)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯,其中兩個(gè)最主要的信號通路為p53-p21 Cip1通路和p16 Ink4a-Rb通路[29]。而p21和p16是細(xì)胞周期進(jìn)展負(fù)調(diào)節(jié)中兩個(gè)關(guān)鍵的組成部分[28,30]。p21 Waf1/Cip1能與各種細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinases,CDK)相互作用并使其失活,而p16INK4A能直接與CDK4/6結(jié)合并阻斷cyclinD-CDK4/6復(fù)合物形成[31],二者分別導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein,Rb)過度磷酸化,促進(jìn)抑制性Rb-E2F復(fù)合物形成,從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[13]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),p16表達(dá)的增多導(dǎo)致早期細(xì)胞衰老,而p16表達(dá)的下調(diào)可以恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的正常功能[11]。p53、p21 Cip1和p15 Ink4b也在衰老細(xì)胞中增加。

在本實(shí)驗(yàn)中,造模之后,p16、p21的蛋白表達(dá)顯著升高,提示造模膝關(guān)節(jié)周圍骨骼肌造成應(yīng)激損傷后,引發(fā)了細(xì)胞周期停滯和獨(dú)特的細(xì)胞表型改變,介導(dǎo)鄰近組織的炎癥,造成衰老細(xì)胞的積累和骨骼肌的萎縮。且HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示模型組肌束排列紊亂,有少量炎細(xì)胞浸潤,肌纖維橫截面積顯著減少且股直肌纖維總數(shù)顯著增多,證實(shí)局部炎癥和肌肉萎縮的發(fā)生。

而治療后,與模型組比較,針刀組和電針組的p16、p21蛋白表達(dá)均顯著降低,針刀及電針干預(yù)均下調(diào)了該通路,提示股直肌細(xì)胞的衰老效應(yīng)被抑制。針刀干預(yù)和電針干預(yù)后肌纖維橫截面恢復(fù)及肌纖維股直肌細(xì)胞數(shù)量的減少較模型組具有極顯著差異,進(jìn)一步證實(shí)針刀對股直肌萎縮的修復(fù)作用。以上結(jié)果與行為學(xué)結(jié)果相印證?？梢妰煞N干預(yù)均打破了KOA膝周“力學(xué)失衡-股直肌萎縮”的惡性循環(huán),有效地阻遏了膝骨關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展。

研究表明,電針治療膝骨關(guān)節(jié)炎具有良好的鎮(zhèn)痛作用[32],可通過調(diào)節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡實(shí)現(xiàn),以此緩解關(guān)節(jié)軟骨損傷并促進(jìn)修復(fù)[33]。而與電針干預(yù)相比,針刀干預(yù)后p21蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與兔膝關(guān)節(jié)行為學(xué)及兔股直肌HE染色形態(tài)學(xué)結(jié)果不一致,這可能是針刀與電針改善肌萎縮機(jī)制的不同之處,有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于樣本量不足以及缺乏干預(yù)更長時(shí)間后的指標(biāo)檢測,有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)完善。

綜上,針刀干預(yù)可能通過下調(diào)p16、p21的蛋白表達(dá),抑制股直肌細(xì)胞衰老,以改善骨骼肌萎縮以恢復(fù)力學(xué)功能,重塑膝關(guān)節(jié)內(nèi)部的應(yīng)力平衡,從而達(dá)到治療KOA的目的。