魏凌， 孫麗， 王倩倩， 朱偉

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 檢驗科，江蘇 昆山 215300）

近年來，程序性死亡受體1（programmed death-1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed deathligand 1, PD-L1）是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點之一。PD-L1 在多種腫瘤中表達，通過與活化T 細胞上的PD-1 結(jié)合導(dǎo)致T 細胞功能受損，從而抑制T 細胞的激活，還能與其他免疫抑制信號協(xié)同作用，促進免疫抑制微環(huán)境的形成[1]。有研究表明，阻斷多發(fā)性骨髓瘤細胞PD-L1 的表達后，T 細胞對骨髓瘤細胞的細胞毒性明顯增強[2]。在非小細胞肺癌中，PD-L1 可通過作用于巨噬細胞，誘導(dǎo)CD4+T細胞向Treg 細胞分化，促進腫瘤進展[3]。間充質(zhì)干細胞作為腫瘤微環(huán)境中重要的基質(zhì)細胞之一，具有自我更新及多向分化的潛能[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞通過細胞間相互作用和旁分泌功能在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。研究表明，胃癌來源的間充質(zhì)干細胞（gastric cancer mesenchymal stem cell, GCMSC）通過分泌白細胞介素-8（Interleukin-8, IL-8），上調(diào)胃癌細胞PD-L1 的表達，促進腫瘤免疫逃逸和耐藥[6-7]。然而，GCMSC 促進胃癌細胞PD-L1 表達的具體特征不明確。本研究觀察GCMSC 對胃癌細胞PD-L1表達的促進作用，并探究胃癌細胞PD-L1 表達對GCMSC 的反應(yīng)性和異質(zhì)性，為進一步研究GCMSC調(diào)控腫瘤細胞PD-L1 的表達機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

1.1.1 GCMSC分離與胃癌細胞株的培養(yǎng) GCMSC 的分離獲得江蘇大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。將江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院收治的胃癌患者手術(shù)取得的新鮮胃癌組織置于75%乙醇中30 s，沖洗表面的血液等雜質(zhì)后轉(zhuǎn)移至含有10 000 u/mL 鏈霉素和青霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）中15 min備用。在超凈臺中將胃癌組織用無菌手術(shù)剪和鑷子分成約1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，均勻鋪于60 mm 細胞培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min 后加入1 mL 含有10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的無菌α-MEM 營養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)10 d 左右，每隔3 天更換新鮮培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察胃癌組織附近細長梭形呈漩渦狀分布的細胞即為GCMSC，待GCMSC 密度擴增至70%～80%時，將GCMSC 用0.25%胰蛋白酶消化離心后繼續(xù)擴增6～10 代，選擇狀態(tài)較好的細胞用于實驗。原代胃癌細胞來源于患者的胃癌組織，將患者的新鮮胃癌組織絞碎，在3 mg/mL Ⅳ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司，cas：9001-12-1）中分離，并在37 ℃下稀釋，然后將組織懸液置于培養(yǎng)皿中，在含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。胃癌細胞株SGC-7901 和MGC-803[美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection, ATCC）]用含10 %FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用2.5 g/L 胰酶消化細胞，每3～5 d 傳代。

1.1.2 制備GCMSC 條件培養(yǎng)基（GCMSC condition medium, GCMSC-CM） GCMSC 在100 mm 細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合度達70%左右時更換新鮮培養(yǎng)基。48 h 后收集細胞培養(yǎng)上清液，3 300 r/min離心5 min，采用33 mm、0.22 μm 一次性針頭式濾器過濾上清液，置入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 GCMSC 成脂成骨誘導(dǎo) 將 0.1 mL Supplement Mix Ⅰ和Supplement Mix Ⅱ 加入100 mL基礎(chǔ)分化培養(yǎng)基中配制成完全分化培養(yǎng)基。取3～6 代GCMSC 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，用含有10%FBS 的α-MEM 置于37 ℃、5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后觀察細胞，待細胞融合度達到80%左右時更換 2 mL BI MSCgo?間充質(zhì)干細胞成脂或成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）繼續(xù)培養(yǎng)12 d，每3 d 換液。油紅O 及茜素紅染色步驟參照Viva Cell Biosciences 試劑盒（上海龍?zhí)锷锛夹g(shù)有限公司）說明書。根據(jù)試劑盒說明書步驟對誘導(dǎo)完成的細胞進行染色，觀察細胞內(nèi)脂滴及礦化結(jié)節(jié)形成大小和數(shù)量。

1.2.2 流式細胞儀檢測表面標(biāo)記及細胞分選PD-L1陰性和PD-L1 陽性胃癌細胞 取待測胃癌細胞株SGC-7901 按5×105個/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)48 h。0.25%胰酶消化細胞，3 300 r/min 離心 5 min，PBS洗滌3 次，棄上清液，收集細胞團塊保存于1.5 mL EP 管中，400 μL PBS 重懸，分別加入3 μL 相應(yīng)流式抗體。4 ℃避光孵育30 min，3 300 r/min離心5 min后200 μL PBS 重懸。流式細胞儀檢測表面標(biāo)記表達，F(xiàn)lowJo 7.6 軟件分析檢測結(jié)果。采用流式細胞儀分選PD-L1 陰性和PD-L1 陽性胃癌細胞。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測PDL1 mRNA 表達 在GCMSC-CM 中加入IL-8 和IL-6的中和抗體，濃度為5 μg/mL，室溫孵育1 h 后作用于胃癌細胞株SGC-7901 和MGC-803，24 h 后收集細胞。將細胞分為4 組：以GCMSC-CM 未處理組為Control 組、GCMSC-CM 處理組、GCMSC-CM+anti-IL-8 組及GCMSC-CM+anti-IL-6 組。向各組收集好的細胞中加入1 mL TRIzol 裂解液，室溫靜置10 min 后用移液槍吹打細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管。加入200 μL 氯仿，手動震蕩30 s，4 ℃靜置15 min直至分層。吸取300 μL 上清液，加入300 μL 異丙醇，4 ℃下靜置2 h。4 ℃、11 441 r/min 離心15 min，棄上清液，加入DEPC 水配制的75%乙醇，4 ℃、9 342 r/min 離心10 min。棄上清液，自然晾干至沉淀呈半透明狀，加入20 μL DEPC 水溶解沉淀，分光光度計檢測RNA 純度及濃度，置入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。qRT-PCR 檢測mRNA，嚴(yán)格按照試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，CW2602M）說明書操作。將提取的RNA、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript 及無RNA 酶水置于冰上解凍備用，按比例配制20 μL 反應(yīng)體系：dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 2 μL， 5 × RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，Total RNA 1 μg，HiFiScript 1 μL，RNase free ddH2O 補足至20 μL。采用定量分析儀（ABI Quanstudio 3）進行逆轉(zhuǎn)錄，42 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 min，進行qRT-PCR，得出CT 值后采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA 相對表達量。PDL1：正向引物5'-TCACTTGGTAATTCTGGGAGC-3'，反向引物5'-CTTTGAGTTTGTATCTTGGATGCC-3'，引物長度124 bp。內(nèi)參基因GAPDH：正向引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物5'-GG CTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'，引物長度197 bp。

1.2.4 Western blotting 檢測PD-L1 蛋白表達 在GCMSC-CM 中加入IL-8 中和抗體及IgG，濃度為5.0 μg/mL，室溫孵育1 h 后作用于胃癌細胞株SGC-7901，24 h 后收集細胞。Rapamycin 預(yù)處理胃癌細胞株SGC-7901，濃度為0.1 μmol/L，DMSO 量與Rapamycin 一致，1 h 后撤除并加入GCMSC-CM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細胞。將細胞分為6 組：以GCMSC-CM 未處理組為Control 組、GCMSC-CM 處理組、GCMSC-CM+IgG 組、GCMSC-CM+anti-IL-8 組、GCMSC-CM+Reparixin 組及GCMSC-CM+DMSO 組。采用PIPA 裂解液提取收集好的細胞全蛋白，BCA蛋白測定試劑盒（CWBIO）定量檢測PD-L1 蛋白表達。以150 μg 為蛋白上樣量，向電泳槽中加入1 L電泳液，60 V 電泳2 h 后配制轉(zhuǎn)膜液預(yù)冷，將蛋白分離膠轉(zhuǎn)印至甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride, PVDF）膜上（350 mA，2 h，4 ℃），50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2～3 h，倒去封閉液，加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜。次日將PVDF 膜置于TBST 緩沖液中，于室溫輕輕搖動洗膜30 min，每10 min 更換TBST 緩沖液。倒去TBST，加入相應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 清洗30 min。滴加HRP 發(fā)光底物用全自動凝膠成像儀進行PVDF膜成像。內(nèi)參蛋白是GAPDH（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）。

1.2.5 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗（enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA）檢測血清游離PD-L1和IL-8水平 收集胃癌患者手術(shù)前血清樣本，分裝后-80 ℃冷凍保存，采用ELISA 檢測血清游離PDL1（sPD-L1）和IL-8 的水平，具體步驟參照ELISA試劑盒（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析的Newman-Keuls 檢驗，兩兩比較用非配對t檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GCMSC鑒定結(jié)果

體外成脂成骨誘導(dǎo)實驗顯示，GCMSC 可誘導(dǎo)分化為骨細胞和脂肪細胞（見圖1A）。免疫表型分析顯示，GCMSC 中CD45、CD34、CD19 呈低表達，CD105、CD90 和CD29 呈高表達（見圖1B）。

圖1 GCMSC鑒定

2.2 GCMSC-CM 促進胃癌細胞株P(guān)D-L1表達的持續(xù)性

GCMSC-CM 處理SGC-7901 細胞24、48 和72 h后，PD-L1 mRNA 相對表達量分別為（5.07±0.45）、（5.09±0.53）、（4.93±0.20），去除GCMSC-CM 24、48 h 后，PD-L1 mRNA 相對表達量分別為（2.26±0.18）、（1.84±0.14），未處理為（1.01±0.16）。6 個不同時間的PD-L1 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.670，P=0.000）。GCMSC-CM 處理SGC-7901 細胞24、48、72 h 后，SGC-7901 細胞的PD-L1 mRNA 相對表達量較未處理時均上調(diào)；去除GCMSC-CM 后48 h，SGC-7901 細胞的PD-L1 mRNA相對表達量逐漸恢復(fù)（見圖2A）。

圖2 不同時間胃癌細胞株P(guān)D-L1 mRNA和蛋白表達的比較

GCMSC-CM 處理MGC-803 細胞24、48 和72 h后，PD-L1 mRNA 相對表達量分別為（3.22±0.05）、（2.39±0.27）、（2.20±0.01），去除GCMSC-CM 24、48 h 后，PD-L1 mRNA 相對表達量分別為（1.88±0.56）、（0.60±0.10），未處理為（1.08±0.42）。6 個不同時間的PD-L1 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.310，P=0.000）。GCMSC-CM 處理MGC-803 細胞24、48 和72 h 后，MGC-803 細胞的PD-L1 mRNA 相對表達量較未處理時均上調(diào)；去除GCMSC-CM 48 h 后，MGC-803 細胞的PD-L1 mRNA相對表達量逐漸恢復(fù)（見圖2B）。

Western blotting 結(jié)果也顯示，GCMSC-CM 處理SGC-7901 細胞24 h 后PD-L1 蛋白表達增加，PD-L1蛋白相對表達量為（1.07±0.12），去除GCMSC-CM后72 h 內(nèi)PD-L1 的表達逐漸恢復(fù)，去除GCMSCCM 24、48、72 h 后，PD-L1 蛋白相對表達量分別為（0.9±0.05）、（0.72±0.03）、（0.52±0.11），未處理為（0.78±0.06）（見圖2C）。

2.3 GCMSC通過分泌IL-6和IL-8上調(diào)胃癌細胞株中PD-L1的表達

IL-8 或IL-6 中和抗體作用GCMSC-CM 后處理SGC-7901 和MGC-803 細胞24 h，采用qRT-PCR 檢測PD-L1 mRNA 表達。結(jié)果表明，GCMSC-CM 處理后，SGC-7901 細胞PD-L1 mRNA 相對表達量為（3.87±0.29），使用IL-8 或IL-6 中和抗體作用GCMSC-CM 處理組分別為（2.42±0.33）、（3.09±0.26），未處理為（1.01±0.12）。不同處理組SGC-7901 細胞PD-L1 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=42.300，P=0.000）（見圖3A）。

圖3 GCMSC-CM促進胃癌細胞PD-L1表達

MGC-803 細胞在接受GCMSC-CM 后處理后，PD-L1 mRNA 相對表達量為（3.76±0.32），使用IL-8 或IL-6 中和抗體作用GCMSC-CM 處理組分別為（1.62±0.53）、（3.22±0.05），未處理為（1.05±0.33）。不同處理組MGC-803 細胞PD-L1 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.410，P=0.000）（見圖3B）。

Western blotting 結(jié)果也顯示，當(dāng)加入Reparixin時，GCMSC-CM 對GC 細胞PD-L1 的促進作用顯著降低。GCMSC-CM 未處理組PD-L1 蛋白相對表達量為（0.52±0.06），GCMSC-CM 處理后，SGC-7901 細胞PD-L1 蛋白相對表達量為（0.94±0.08），GCMSCCM+IgG 組和使用IL-8 中和抗體作用GCMSC-CM 處理組分別為（0.87±0.07）和（0.70±0.11），GCMSCCM+Reparixin 組和GCMSC-CM+DMSO 組PD-L1 蛋白相對表達量分別為（0.4±0.05）和（0.7±0.09）（見圖3C）。

2.4 GC患者sPD-L1與IL-8的相關(guān)性

35 例GC 患者血清sPD-L1 水平為（38.78±1.96），IL-8 水平為（32.76±9.71）（見圖4）。GC 患者血清IL-8 與sPD-L1 水平呈正相關(guān)（r=0.347，P=0.041）。見圖5。

圖4 GC患者血清IL-8和sPD-L1的水平

圖5 GC患者IL-8和sPD-L1的相關(guān)性

2.5 GCMSC-CM促進PD-L1表達存在GC異質(zhì)性

GCMSC-CM 處理SGC-7901 24 h 后，流式細胞術(shù)分離PD-L1 陰性和PD-L1 陽性細胞，再次用GCMSC-CM 處理分選細胞，檢測PD-L1 的表達。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，再次用GCMSC-CM 處理后，PD-L1 陽性細胞組PD-L1 表達水平升高（P＜0.05），而PD-L1 陰性細胞組PD-L1 表達并未升高（P＞0.05）（見圖6A）。GCMSC-CM 處理GC 組織中分離出的原代GC 細胞，結(jié)果顯示，原代GC 細胞PD-L1水平也升高。將GCMSC-CM 組的PD-L1 陽性和PDL1 陰性細胞進行分選（見圖6B），用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，撤除GCMSC-CM后，PD-L1 陽性的原代GC 細胞中PD-L1 的表達降低（見圖6C）。

圖6 GC 細胞中PD-L1表達存在對GCMSC-CM 反應(yīng)異質(zhì)性

3 討論

腫瘤微環(huán)境中，免疫細胞和細胞因子在調(diào)控腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。PD-L1 作為一個免疫抑制分子能夠被腫瘤細胞等多種細胞調(diào)控。近年來，免疫檢查點抑制劑（ICIs）療法，尤其是抗PD-1/PD-L1 療法，已成為除化療和放療外應(yīng)用最普遍的胃癌治療手段之一。但PD-L1 在腫瘤微環(huán)境中具體受到哪些細胞影響尚未闡明[8-15]。

間充質(zhì)干細胞是一群多能干細胞，擁有自我更新及多向分化的能力，具有免疫調(diào)節(jié)功能，最初是骨髓中分離獲得，目前已經(jīng)可以從多種組織中獲取，如臍帶、皮膚、肌肉、牙髓和脂肪組織等[16-18]。早期實驗研究證明骨髓間充質(zhì)干細胞通過旁分泌可溶性細胞因子或Exosomes 促進腫瘤體內(nèi)生長及血管形成[19-20]。骨髓間充質(zhì)干細胞對腫瘤具有趨向性，在多種趨化因子的作用下到達腫瘤微環(huán)境并被馴化為腫瘤相關(guān)間充質(zhì)干細胞[21]。多發(fā)性骨髓瘤患者來源的骨髓間充質(zhì)干細胞可通過PD-1/PD-L1 軸誘導(dǎo)CD8+T 細胞死亡，抑制CD8+T 細胞穿孔素和顆粒酶B 的釋放并促進骨髓瘤細胞免疫逃逸[22]。本團隊在臨床胃癌組織中分離培養(yǎng)出較骨髓間充質(zhì)干細胞具有更強促瘤潛能的GCMSC[23]。實驗結(jié)果表明，胃癌微環(huán)境中T 細胞、GCMSC 及腫瘤細胞相互作用共同調(diào)節(jié)PD-L1 表達，進一步促進胃癌細胞抵抗CTL 的細胞毒性作用并發(fā)生免疫逃逸[24-26]。

本研究從胃癌患者組織中分離培養(yǎng)出GCMSC并收集GCMSC 上清液。胃癌細胞與GCMSC-CM 共培養(yǎng)24、48 和72 h 后，PD-L1 表達均明顯升高，然而當(dāng)撤除GCMSC-CM 后，胃癌細胞的PD-L1 表達均無法保持在一個較高水平，表明胃癌細胞PD-L1 表達的升高依賴于GCMSC-CM 的持續(xù)作用。為了進一步驗證GCMSC 對胃癌細胞PD-L1 的作用，本研究使用IL-6 和IL-8 的中和抗體抑制了胃癌細胞中IL-6和IL-8 的表達，當(dāng)使用IL-6 或IL-8 中和抗體阻斷GCMSC-CM IL-6 或IL-8 與其受體結(jié)合時，GCMSCCM 促進PD-L1 表達作用被逆轉(zhuǎn)，尤其是阻斷IL-8后效果更明顯，表明IL-8 通過與CXCR1/2 相互作用激活偶聯(lián)G 蛋白，進而激活信號分子調(diào)控基因表達。Reparixin 是CXCR1/2 激活的非競爭性變構(gòu)抑制劑。Western blotting 檢測結(jié)果也顯示，當(dāng)加入Reparixin時，GCMSC-CM 對GC 細胞PD-L1 的促進作用明顯減弱。同時，ELISA 結(jié)果顯示胃癌患者血清IL-8 和PD-L1 的表達呈正相關(guān)，進一步證明GCMSC 通過IL-6 和IL-8 促進PD-L1 的表達。為進一步探討GCMSC 上調(diào)胃癌細胞PD-L1 表達是否存在異質(zhì)性，本研究用流式細胞術(shù)將GCMSC-CM 處理后的胃癌細胞分為PD-L1 陰性和PD-L1 陽性細胞群，結(jié)果顯示，PD-L1 陽性細胞群被GCMSC-CM 再次作用后，PD-L1 水平持續(xù)升高而PD-L1 陰性細胞群沒有明顯變化。這些結(jié)果表明GCMSC 對胃癌細胞PD-L1 的上調(diào)作用的異質(zhì)性，不同細胞對GCMSC-CM 處理的反應(yīng)不同，其具體機制還需進一步探索。WEI 等[27]分析9 769 例腫瘤患者的臨床資料，其中包含32 種不同類型的腫瘤，發(fā)現(xiàn)不同免疫微環(huán)境下PD-L1 陽性腫瘤細胞存在異質(zhì)性。巨噬細胞通過激活NFκB 信號上調(diào)腫瘤細胞PD-L1 表達，進而促進腫瘤細胞惡性增殖、血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移，并抵抗傳統(tǒng)化療藥物、CTL 的細胞毒性作用及抗PD-1/PD-L1 抗體治療；而活化的T 細胞激活STAT1 信號形成的PDL1 陽性腫瘤細胞則敏感且易發(fā)生凋亡。此現(xiàn)象揭示了腫瘤內(nèi)部微環(huán)境的復(fù)雜性，深入了解腫瘤微環(huán)境，闡明腫瘤細胞PD-L1 表達的調(diào)控機制對提高免疫治療效率非常關(guān)鍵。

綜上所述，GCMSC-CM 通過IL-6 和IL-8 上調(diào)胃癌細胞中PD-L1 的表達并且這種上調(diào)作用依賴于GCMSC-CM 的持續(xù)作用。此外，GCMSC-CM 對胃癌細胞的作用取決于胃癌細胞本身PD-L1 的表達。本研究僅闡述了GCMSC-CM 影響胃癌細胞PD-L1 的異質(zhì)性，后續(xù)將深入探索其具體機制，為GCMSC 治療胃癌提供新的思路。