徐建群, 周利君, 程津津, 方 思, 王紅娟, 郭紅榮, 戴 芹

武漢市第三醫(yī)院呼吸內科,武漢 430071

肺癌是最常見的癌癥之一,其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85%,包括兩種主要病理類型:腺癌和鱗狀細胞癌[2]。手術、化療、放療、靶向、免疫治療等方法可以延長肺癌患者的生存時間,但其5年生存率仍然僅為15%[3]。DNA損傷修復對于維持細胞正常的生理活動至關重要,調控細胞周期阻滯、DNA修復、衰老和凋亡[4-5],其異?？蓪е露喾N病理結果。研究發(fā)現,調節(jié)細胞N6-甲基腺苷(m6A)水平,能夠誘導包括DNA損傷修復相關基因的差異化表達[6]。m6A是真核生物mRNA最普遍和最豐富的RNA修飾,能通過多種生物學機制影響細胞生物學行為,其水平異常時對腫瘤的增殖、轉移、分化以及免疫逃逸有促進作用[7]。甲基轉移酶樣3(METTL3)是參與m6A修飾的主要酶之一,在多種癌癥中起著至關重要的作用[8]。研究表明,METTL3的敲低顯著增強了癌細胞和小鼠異種移植物對DNA損傷修復因素的敏感性[9],但是對于肺癌發(fā)生發(fā)展的影響目前仍未被闡明。順鉑是NSCLC的主要化療藥物之一,可以通過直接損傷DNA導致腫瘤特有基因組的不穩(wěn)定性,在NSCLC的治療中發(fā)揮關鍵作用[10]。

因此,本研究基于A549肺癌細胞構建順鉑誘導DNA損傷模型,探討METTL3差異表達對肺癌細胞m6A修飾水平的影響和作用機制,對闡明肺癌的發(fā)病機制及尋找潛在的治療靶點提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑

A549肺癌細胞購于中國科學院上海細胞庫。胎牛血清購于Gibco公司,貨號10270-106;Opti-MEM購于Gibco公司,貨號31985-062;Lipofectamine?RNAiMAX購于Invitrogen公司,貨號13778030;CCK-8、RIPA組織細胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于Solarbio公司,貨號CA1210、R0010、PC0020;順鉑購于Sigma公司,貨號P4394;Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和PI/RNase染色劑緩沖液購于BD公司,貨號556547、550825;Trizol購于Ambion公司,貨號15596026;m6A RNA甲基化定量試劑盒購于英國Abcam公司,貨號ab185912;PVDF轉移膜和化學發(fā)光試劑購于Millipore公司,貨號IPVH00010、WBKLS0500;抗體METTL3、H2AX、β-Catenin、ERCC1、NDRG1、ATM、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG購于Bioswamp公司,貨號PAB35845、PAB30724、PAB30112、ab129267、PAB33225、PAB34313、PAB36269、SAB43714。

1.2 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱購于Thermo公司,型號311;倒置熒光顯微鏡購于Leica公司,型號DMIL LED;酶標儀購于杭州奧盛儀器公司,型號AMR-100;流式細胞儀購于艾森儀器公司,型號NovoCyte;PCR儀購于杭州柏恒公司,型號GE48527;熒光定量PCR儀購于Bio-Rad公司,型號CFX-Connect 96;全自動化學發(fā)光分析儀購于上海天能公司,型號Tanon-5200。

1.3 方法

1.3.1 構建順鉑誘導細胞損傷模型 A549細胞在含10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內進行傳代培養(yǎng)。收集傳代完成的細胞,調整細胞懸液濃度為1×105個細胞/孔,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。用正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h作為對照組細胞;在培養(yǎng)液中加入終濃度為10 μmol/L順鉑,培養(yǎng)24 h作為順鉑誘導組[11]。

1.3.2 細胞轉染 調整細胞濃度為5×105個細胞,種于6孔板,待細胞融合度達到70 %進行轉染。按照轉染試劑盒說明書,用Opti-MEM分別稀釋METTL3 siRNA和Lipofectamine? RNAiMAX,混勻稀釋后的液體,室溫孵育20 min,加入含有細胞和新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)板孔中,37℃、5% CO2轉染4 h。然后更換新鮮培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,qRT-PCR檢測轉入基因表達情況。

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖活力 根據METTL3的序列(GI號1519312280)合成干擾RNA(siRNA)和空載質粒(NC),按照1.3.2中方法將siRNA和NC轉染至順鉑誘導的A549細胞,將細胞分為對照組、順鉑誘導組、順鉑誘導+siRNA組和順鉑誘導+NC組。收集細胞,調整懸液濃度為3×103個細胞/孔,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,使細胞貼壁。按照分組處理細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,用酶標儀在450 nm處測量各孔的吸光度值。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集1.3.3中各組細胞,取1×106個于培養(yǎng)液中重懸細胞,離心棄上清,重懸于200 μL PBS中,加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI,4℃避光孵育30 min,進行流式細胞術檢測。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞周期 取1.3.3中各組樣本,1×107個細胞,離心棄上清,PBS重懸沉淀,加入無水乙醇-20℃固定細胞24 h以上,離心后用預冷的PBS洗滌2次。用0.5 mL PI/RNase染色劑緩沖液重懸細胞沉淀,室溫孵育15 min,用流式細胞儀進行細胞DNA含量的測定,確定細胞在各細胞周期所占比例。

1.3.6 qRT-PCR檢測細胞中METTL3表達 收集細胞,用Trizol法提取總RNA,反轉錄獲得cDNA,將制備好的cDNA進行PCR擴增。擴增體系為95℃ 3 min,95℃變性5 s,56℃退火10 s,72℃延伸25 s,循環(huán)40次。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成,序列為:METTL3-F:5′-TGCAACGCATCATTCGGACA-3′,METTL3-R:5′-TCCTTTGACACCAACCAAGCA-3′,GAPDH-F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,GAPDH-R:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。

1.3.7 Western blot法檢測METTL3、H2AX、ERCC1、NDRG1、ATM、β-catenin表達 收集各組A549細胞,用細胞裂解緩沖液提取總蛋白并變性,BCA試劑盒測定蛋白質濃度。每個樣品每道20 μg總蛋白進行12% SDS-PAGE電泳。電泳后,蛋白質在90 V電壓下轉移到聚偏氟乙烯膜上,持續(xù)50 min。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉過夜,然后與METTL3、H2AX、β-Catenin、ERCC1、NDRG1、ATM的特異性抗體(1∶1000)在室溫孵育1 h,然后與偶聯HRP的二抗(1∶20000)孵育1 h。加入ECL發(fā)光液,通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。用靶蛋白的灰度值與GAPDH蛋白灰度值的比值作為最終結果,進行半定量分析。

1.3.8 m6A水平檢測 在1.3.3分組的基礎上,設計不加引物序列的陰性對照組驗證PCR體系是否污染,和隨機序列的陽性對照組驗證整個PCR體系是否正確。提取各組細胞的總RNA,按照說明書使用m6A RNA甲基化定量試劑盒測定RNA中m6A的總體水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行分析,計量資料用均數±標準差表示。多組間均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 誘導DNA損傷模型的構建

用順鉑誘導A549細胞24 h后,與對照組細胞相比,順鉑誘導組的細胞活力顯著下降(P<0.01,圖1)。

2.2 siRNA METTL3轉染驗證

轉染METTL3 siRNA后,細胞中METTL3 mRNA表達水平見圖2。3條siRNA成功轉染后,METTL3 mRNA表達量均被降低。與對照組相比,siRNA-1組表達量為對照組的11%,干擾效率高達89%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);siRNA-2和siRNA-3組表達量分別為對照組的29%和26%,干擾效率高達71%和74%,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。此外,3條siRNA轉染后METTL3 mRNA表達量分別為siRNA陰性對照組的9%、25%和22%,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

1:對照組;2:siRNA-1;3:siRNA-2;4:siRNA-3;5:siRNA-NC;與對照組比較,*P<0.05圖2 細胞轉染siRNA METTL3后METTL3 mRNA表達水平Fig.2 METTL3 mRNA expression level in cells after transfection of siRNA METTL3

2.3 各組細胞增殖能力變化

CCK-8檢測各組細胞增殖能力變化,結果見圖3。與對照組相比,順鉑誘導組細胞增殖能力顯著下降(P<0.01);與順鉑誘導組相比,順鉑誘導+siRNA組細胞增殖能力顯著下降(P<0.01),順鉑誘導+NC組細胞增殖能力變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1:對照組;2:順鉑誘導組;3:順鉑誘導+siRNA組;4:順鉑誘導+NC組;與對照組比較,**P<0.01;與順鉑誘導組比較,##P<0.01圖3 CCK-8檢測各組細胞增殖能力變化Fig.3 Changes in cell proliferation ability in each group detected by CCK-8 in each group

2.4 各組細胞凋亡和周期變化

流式細胞術檢測細胞凋亡變化,結果見圖4。與對照組相比,順鉑誘導組細胞凋亡率顯著上升(P<0.01);與順鉑誘導組相比,順鉑誘導+siRNA組細胞凋亡率顯著上升(P<0.01),順鉑誘導+NC組細胞凋亡率變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1:對照組;2:順鉑誘導組;3:順鉑誘導+siRNA組;4:順鉑誘導+NC組;與對照組比較,**P<0.01;與順鉑誘導組比較,##P<0.01圖4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡變化Fig.4 Changes in cell apoptosis ability in each group detected by flow cytometry

流式細胞術檢測細胞周期變化,結果見圖5。與對照組相比,順鉑誘導組細胞周期G0～G1期延長,S期和G2～M期均縮短(均P<0.01);與順鉑誘導組相比,順鉑誘導+siRNA組細胞周期G0～G1期延長,S期和G2～M期均縮短(均P<0.01),順鉑誘導+NC組與順鉑誘導組的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

1:對照組;2:順鉑誘導組;3:順鉑誘導+siRNA組;4:順鉑誘導+NC組;與對照組比較,**P<0.01;與順鉑誘導組比較,##P<0.01圖5 流式細胞術檢測各組細胞周期差異Fig.5 Differences in cell cycle in each group detected by flow cytometry

2.5 各組細胞METTL3 mRNA和蛋白相對表達變化

分別用qRT-PCR和Western blot檢測各組細胞中METTL3 mRNA和蛋白表達情況,見圖6。與對照組相比,順鉑誘導后細胞中METTL3 mRNA和蛋白表達水平顯著下調(均P<0.01);與順鉑誘導組相比,順鉑誘導+siRNA組METTL3 mRNA和蛋白表達水平顯著下調(均P<0.01),順鉑誘導+NC組變化無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

1:對照組;2:順鉑誘導組;3:順鉑誘導+siRNA組;4:順鉑誘導+NC組;A:qRT-PCR檢測METTL3 mRNA表達水平;B:Western blot檢測蛋白表達水平;與對照組比較,**P<0.01;與順鉑誘導組比較,##P<0.01圖6 各組細胞METTL3相對表達變化Fig.6 Changes in relative expression of METTL3 in each group

2.6 各組細胞中H2AX、ERCC1、NDRG1、ATM和β-catenin的蛋白表達變化

Western blot檢測細胞中DNA損傷分子標記物H2AX,DNA損傷修復基因ERCC1、NDRG1、ATM及凋亡基因β-catenin蛋白表達變化,結果見圖7。與對照組相比,順鉑誘導組H2AX、ERCC1、NDRG1蛋白表達均顯著上升(均P<0.01),ATM和β-catenin蛋白表達顯著下降(均P<0.01);與順鉑誘導組相比,順鉑誘導+siRNA組H2AX、ERCC1、NDRG1蛋白表達均顯著上升(均P<0.01),ATM和β-catenin蛋白表達顯著下降(均P<0.01),順鉑誘導+NC組變化無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

1:對照組;2:順鉑誘導組;3:順鉑誘導+siRNA組;4:順鉑誘導+NC組;與對照組相比,**P<0.01;與順鉑誘導組相比,##P<0.01圖7 Western blot檢測各組細胞中H2AX、ERCC1、NDRG1、ATM和β-catenin的蛋白表達Fig.7 Protein expressions of H2AX,ERCC1,NDRG1,ATM and β-catenin in cells of each group detected by Western blotting

2.7 m6A水平檢測

試劑盒測定各組細胞RNA中m6A的總體水平,結果見圖8。與陰性對照組相比,陽性對照和對照組細胞中m6A水平顯著上升(均P<0.01)。與對照組相比,順鉑誘導后細胞中m6A水平顯著下調(P<0.01);與順鉑誘導組相比,順鉑誘導+siRNA組m6A水平顯著下調(P<0.01),順鉑誘導+NC組變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1:陰性對照組;2:陽性對照組;3:對照組;4:順鉑誘導組;5:順鉑誘導+siRNA組;6:順鉑誘導+NC組;與對照組比較,**P<0.01;與順鉑誘導組比較,##P<0.01;與陰性對照組比較,&&P<0.01圖8 各組細胞中m6A水平變化Fig.8 Changes in m6A levels in cells of each group

3 討論

肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因,其主要組織病理學亞型是NSCLC。對于沒有靶向藥物的NSCLC患者,基于鉑類的化療仍然是不可代替的標準療法[12]。同時,對于晚期NSCLC患者和需要誘導輔助治療的早期疾病患者,順鉑更是有效的鉑類藥物。順鉑的作用機制是誘導交聯DNA加合物的形成,阻斷DNA復制,與DNA結合并誘導DNA損傷,最終導致線粒體介導的細胞凋亡[13]。此外,DNA損傷還會阻滯細胞周期,將周期阻滯在G1期[14]。本研究中,順鉑誘導細胞DNA損傷模型中,細胞的增殖能力下降,凋亡率顯著上升,細胞周期被阻滯,DNA斷裂形成的標志蛋白H2AX表達增加,說明順鉑誘導肺癌細胞造成DNA損傷,進而促進細胞凋亡。

研究發(fā)現,METTL3在癌細胞生長、存活和侵襲中起著驅動作用。METTL3能抑制細胞分化和促進凋亡,通過增加相關蛋白的翻譯促進細胞增殖,調控細胞生物學功能和自我更新[15]。在髓系白血病患者中,METTL3表達增加,并發(fā)揮致癌作用[16]。Li等[17]發(fā)現METTL3過表達可促進肝細胞癌的增殖和遷移,而降低METTL3則可能抑制細胞的生長和轉移。在NSCLC組織中,METTL3的表達上調,促進了NSCLC的細胞活力和遷移[18]。因此,METTL3可能是NSCLC治療的新靶點。本研究中,對照組A549肺癌細胞中METTL3高表達,順鉑誘導細胞DNA損傷模型中METTL3表達顯著下降。且METTL3敲低進一步抑制了順鉑誘導A549細胞的增殖能力,并提高了凋亡率。這說明METTL3促進NSCLC發(fā)展,而敲低METTL3能加速肺癌細胞凋亡。

METTL3敲低還能提高癌細胞對化療藥物的敏感性并增加DNA損傷的積累。H2AX是DNA損傷的特異性生物標志物,H2AX被ATM磷酸化,富集DNA修復因子等到DNA斷裂位點,參與損傷修復[19-20]。ATM是調節(jié)DNA損傷反應的主要蛋白激酶,METTL3通過m6A修飾破壞ATM穩(wěn)定性,從而影響DNA損傷反應[21]。此外,在DNA損傷過程中,BRCA1和NDRG1通過調節(jié)細胞周期,參與基因修復蛋白質之間的相互作用,提高機體對鉑類藥物的敏感性[22-23]。本研究中,METTL3敲低后,H2AX、ERCC1、NDRG1蛋白表達增加,ATM的蛋白表達下降,其變化差異與順鉑誘導相比更加顯著,說明METTL3敲低抑制了DNA損傷修復,使鉑類藥物治療效果更加明顯。

METTL3被公認為關鍵的甲基轉移酶,在m6A修飾的調節(jié)過程中至關重要。作為真核生物中最普遍的mRNA修飾,m6A修飾能夠在轉錄后影響RNA剪接、穩(wěn)定性和翻譯,從而參與多種生物學和病理學過程,包括細胞增殖、凋亡、腫瘤侵襲和轉移[24]。METTL3能夠以m6A依賴的方式調節(jié)RNA表達,調控組織癌變、腫瘤進展和耐藥性,介導癌癥細胞的凋亡[25]。抑制METTL3能調節(jié)m6A修飾降低同源重組修復效率并增加阿紅霉素誘導的DNA損傷,調節(jié)乳腺癌的化療反應[26]。本研究中,METTL3敲低可以降低m6A水平,說明METTL3通過介導m6A修飾進而調控肺癌細胞DNA損傷。

研究表明,降低β-catenin能有效降低m6A甲基化,抑制結直腸癌干細胞樣細胞的干性和致瘤性[27-28]。RNA m6A甲基化通過調節(jié)β-catenin的表達和膜定位來調節(jié)癌細胞的傳播,METTL3表達與β-catenin的轉錄、mRNA衰變、翻譯和亞細胞定位相關[29]。本研究中,METTL3敲低后,細胞中β-catenin蛋白表達顯著下降,與m6A水平變化趨勢一致。該結果說明,在NSCLC中,β-catenin可能是METTL3介導的m6A修飾的直接靶點。

綜上所述,METTL3的敲低使NSCLC細胞對順鉑敏感,并增加了DNA損傷的積累。其作用機制可能是METTL3敲低通過m6A修飾β-catenin抑制順鉑誘導肺癌細胞中的DNA損傷修復,這為進一步揭示METTL3介導的m6A修飾在肺癌中的作用機制和靶向治療提供了參考依據。