咼文靜，鄧 慧，宋 萍，張孟賢，*

(1.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 襄陽 441000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430030)

彌漫性膠質(zhì)瘤是成人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有腦腫瘤的30%，腦惡性腫瘤的80%。彌漫性較低級(jí)別膠質(zhì)瘤約占所有膠質(zhì)瘤的15%，5 年生存率在30%～80%，預(yù)后差異較大。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是成人最常見的惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的15%，盡管目前存在包括手術(shù)、放療和替莫唑胺同步化療[1]以及近來發(fā)展起來的免疫治療、靶向治療和腫瘤電場治療等在內(nèi)的多種標(biāo)準(zhǔn)治療模式，其5 年生存率仍低于5%[2]。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)和更加深入探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制非常必要。

轉(zhuǎn)化生長因子β 誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor β-induced protein，TGFBI)，是一種能結(jié)合整合素和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的連接蛋白，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、黏附、遷移、分化和炎癥等過程中發(fā)揮著重要作用[3]。有研究表明TGFBI 在不同腫瘤中發(fā)揮不同的功能。TGFBI 在胃癌[4]、膀胱癌[5]和食管鱗癌[6]中異常過表達(dá)，提示其可能扮演促癌基因的角色；然而，在間皮瘤、乳腺癌和肺癌中，TGFBI 的表達(dá)水平明顯降低[7-8]，因此它亦可能是一種抑癌基因。目前，關(guān)于TGFBI 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究仍然很少，因此，本文旨在探討TGFBI 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機(jī)制。

本研究利用癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Altas，TCGA)、中國腦膠質(zhì)瘤圖譜(Chinese Glioma Genome Altas，CGGA)和腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(Rembrandt)分析TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響，并通過免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。此外，本研究還采用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TGFBI 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響。然后采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)研究TGFBI 在腫瘤中可能參與并調(diào)控的通路，為后續(xù)確定TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價(jià)值及明確其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)均購于美國Gibco公司；TGFBI 抗體購于美國Abcam 公司；二抗來自普諾森試劑盒；TRIzol 試劑購于上海普飛生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒、顯色液均購于上海碧云天生物技術(shù)公司；CCK-8、PI均購于默克Sigma公司；Annexin Ⅴ-APC 凋亡檢測(cè)試劑盒購于eBioscience公司；侵襲實(shí)驗(yàn)染色試劑盒購于美國Corning公司；內(nèi)參基因和目的基因引物由吉?jiǎng)P基因設(shè)計(jì)和合成。

1.2 數(shù)據(jù)庫和組織標(biāo)本

從TCGA、CGGA 和Rembrandt 數(shù)據(jù)庫下載膠質(zhì)瘤患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息，然后利用Graphpad Prism 8.0 軟件整合分析并繪制TGFBI mRNA 在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，分析TGFBI mRNA 與患者生存時(shí)間的關(guān)系并繪制Kaplan-Meier 曲線。本研究使用的腦膠質(zhì)瘤組織芯片購自上海吉?jiǎng)P生物有限公司，陣列編號(hào)GL805b，該芯片包含35 例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和5例正常腦組織。

1.3 免疫組化

組織芯片采用二甲苯脫蠟2 次，每次15 min，梯度乙醇水化，在微波爐里高火加熱檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)至沸騰后低火維持20 min，待組織切片自然冷卻后PBS 洗一次，一抗4 ℃孵育過夜，TBS 洗2次，5 min/次，加二抗室溫孵育60 min，TBS 洗4次，5 min/次。DAB 染色，蘇木素復(fù)染30 s，中性樹膠封片。晾干，觀察結(jié)果，拍照。綜合考慮染色強(qiáng)度評(píng)分和染色陽性率評(píng)分，兩者相乘得到IHC 評(píng)分，用于評(píng)估TGFBI 的表達(dá)水平。染色強(qiáng)度評(píng)分：按顏色深淺分別賦予0(陰性)、1(弱)、2(中)、3 分(強(qiáng))；染色陽性率評(píng)分：陽性率0 為0 分，>0～25%為1 分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。IHC 評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×染色陽性率評(píng)分，分?jǐn)?shù)越高代表TGFBI表達(dá)水平越高。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和U373均來自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。兩種細(xì)胞系均用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長情況分別進(jìn)行換液或傳代。

1.5 慢病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞

從上海吉?jiǎng)P生物有限公司購買已設(shè)計(jì)好的針對(duì)TGFBI 序列的shRNA 慢病毒和相應(yīng)的空載序列慢病毒，并轉(zhuǎn)染U87 和U373 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完畢后在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嘌呤霉素篩選后用Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.6 CCK-8法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞為帶有針對(duì)TGFBI序列的shRNA的慢病毒，而對(duì)照組則為帶有轉(zhuǎn)染了相應(yīng)的空載序列的慢病毒。隨后將其接種于96 孔板中，每孔培養(yǎng)基總量100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將接種細(xì)胞的培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，分別孵育24、48、72、96 和120 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，孵育結(jié)束后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm波長處的吸光度值D(450)。

1.7 Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的U87和U373細(xì)胞置于侵襲小室上層，含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于侵襲小室的下層，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h 后，用棉簽將小室上層細(xì)胞刮下去除，然后用4%多聚甲醛將小室下層細(xì)胞固定20 min，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察，每個(gè)上室隨機(jī)取5 個(gè)100 倍視野拍照并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的U87和U373細(xì)胞，用PBS洗滌2次后加入200 μL的結(jié)合緩沖液，加入10 μL的Annexin Ⅴ-APC 吹打混勻，室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的U87和U373細(xì)胞分別用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，吸1 mL 細(xì)胞懸液離心后加入1 mL 70%的預(yù)冷乙醇，4 ℃固定過夜，PBS洗去乙醇后加入0.3 mL的PI，4 ℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.10 基因集富集分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載膠質(zhì)瘤患者的mRNA 數(shù)據(jù)，按照TGFBI mRNA表達(dá)水平中位數(shù)分為TGFBI高表達(dá)組和低表達(dá)組并制做成表型數(shù)據(jù)文件(cls 格式)，同時(shí)將mRNA 數(shù)據(jù)制作成與表型數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)譜文件(gct 格式，矩陣形式)。然后，使用GSEA(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)網(wǎng)站提供的基于IAVA環(huán)境的GSEA軟件(version 3.0)分析比較TGFBI高低表達(dá)組之間可能存在的差異表達(dá)基因及信號(hào)通路。在GSEA 分析中使用GSEA 官方提供的Molecular Signature Database(MsigDB)作為通路注釋源，通過1 000次循環(huán)的排列組合尋找顯著富集的信號(hào)通路。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用Graphpad Prism 6 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和制圖，應(yīng)用SPSS 18.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，二獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于數(shù)據(jù)庫分析TGFBI mRNA 的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

從TCGA、CGGA和Rembrandt數(shù)據(jù)庫下載GBM和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息進(jìn)行分析。如圖1 所示，TGFBI mRNA 的表達(dá)水平與世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)定義的膠質(zhì)瘤分級(jí)相關(guān)，隨著腫瘤級(jí)別和惡性程度的增加，TGFBI mRNA 的表達(dá)水平也逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Kaplan-Meier 生存分析顯示TGFBI mRNA 的表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，見圖2)。然后，本研究通過免疫組化檢測(cè)TGFBI 蛋白在腫瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，TGFBI 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)呈棕黃色和棕褐色的顆粒(見圖3)，35 例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織的免疫組化染色評(píng)分為5.96±4.01，高于對(duì)照組的評(píng)分0(P<0.05)。

圖1 TGFBI mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平

圖2 TGFBI mRNA不同表達(dá)水平膠質(zhì)瘤患者的生存分析

2.2 TGFBI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

采用慢病毒轉(zhuǎn)染干擾TGFBI 的表達(dá)，構(gòu)建TGFBI低表達(dá)的U87 和U373 細(xì)胞系，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組sh-TGFBI中TGFBI蛋白的表達(dá)水平顯著下降，說明轉(zhuǎn)染成功(圖4A)。應(yīng)用CCK-8 試劑盒分別對(duì)對(duì)照組和sh-TGFBI 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞在24、48、72、96和120 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)。結(jié)果顯示，sh-TGFBI 組U87 和U373 細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組明顯降低(P<0.05，圖4B)。表明敲低TGFBI基因表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖4 TGFBI蛋白低表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

2.3 TGFBI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示，不同光鏡視野中實(shí)驗(yàn)組兩株膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的數(shù)目明顯少于對(duì)照組(P<0.05)，表明敲低TGFBI 的表達(dá)能顯著抑制U87 和U373膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

圖5 敲低TGFBI后對(duì)U87和U373膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

2.4 TGFBI對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況(圖6)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了sh-TGFBI慢病毒顆粒的U87 和U373 細(xì)胞凋亡率分別為(7.92±0.57)%、(6.89±0.56)%，而陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為(3.94±0.23)%、(4.45±0.44)%。以上數(shù)據(jù)表明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染了sh-TGFBI 慢病毒顆粒的U87和U373細(xì)胞處于S期的細(xì)胞數(shù)減少，G2/M期細(xì)胞數(shù)增多(均為P<0.05)，而處于G1期的細(xì)胞無顯著變化。

圖6 U87和U373細(xì)胞敲低TGFBI對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

2.5 TGFBI的功能基因集富集分析

為了進(jìn)一步研究TGFBI 參與腫瘤的調(diào)控機(jī)制，利用TCGA 數(shù)據(jù)庫，通過GSEA 方法分析了TGFBI 的表達(dá)所參與的信號(hào)通路，結(jié)果顯示，TGFBI 高表達(dá)可能通過TOLL 樣受體信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展(圖7)。

3 討論

人腦膠質(zhì)瘤是高度惡性的顱內(nèi)腫瘤，它表現(xiàn)為對(duì)正常腦組織的破壞，對(duì)常規(guī)治療的抵抗以及廣泛侵襲整個(gè)大腦[9]。世界衛(wèi)生組織根據(jù)膠質(zhì)瘤的組織病理學(xué)特征將其分為四級(jí)(I～I(xiàn)V)。盡管有最佳的治療模式，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(IV 級(jí))患者的中位生存期仍只有15～18個(gè)月[10]。在本文中，我們討論了在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的一個(gè)潛在的分子標(biāo)志物，可能為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究帶來新的機(jī)遇。

研究證實(shí)TGF-β信號(hào)在癌前狀態(tài)下發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，而在晚期癌癥中則作為腫瘤促進(jìn)劑發(fā)揮作用[11]。TGFBI，作為TGF-β信號(hào)通路的下游分子，有文獻(xiàn)報(bào)道其在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮促進(jìn)和抑制的雙重作用[12-13]。近年來，多項(xiàng)研究表明TGFBI 在不同類型腫瘤中的作用，如在卵巢癌[14]、食管鱗狀細(xì)胞癌[6]、腎細(xì)胞癌[15]、黑色素瘤[16]、結(jié)腸癌[17]和肺腺癌[18]中發(fā)揮促腫瘤作用，而在白血病[19]、間皮瘤、乳腺癌[8]和肺癌[7]中起抑癌作用，因此，TGFBI 可能是一個(gè)廣譜的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式和確切作用尚不清楚。

A：JAK-STAT信號(hào)通路；B：NOD樣受體信號(hào)通路；C：TOLL樣受體信號(hào)通路.

在本研究中，我們用生物信息學(xué)方法證實(shí)了TGFBI 的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度分級(jí)存在顯著相關(guān)性，膠質(zhì)瘤分級(jí)越高，其表達(dá)越豐富。并且TGFBI 高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。隨后免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示TGFBI 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常腦組織?；谏鲜鼋Y(jié)果我們推測(cè)TGFBI 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能扮演了癌基因的角色，為了進(jìn)一步了解TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能，我們通過CCK-8、Transwell 小室實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，敲低TGFBI基因表達(dá)后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 和U373的增殖速度減慢，侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡率升高，并促使細(xì)胞滯留于G2/M 期。這些結(jié)果均提示TGFBI 在膠質(zhì)瘤中可能作為一個(gè)促癌因子存在。Guo等[20]的實(shí)驗(yàn)通過pSUPER-shTGFBI 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87 和U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGFBI表達(dá)增強(qiáng)可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移，此與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Zhu 等[21]通過體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TGFBI主要由M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌，并作用于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，促進(jìn)干細(xì)胞特性而發(fā)揮作用。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示TGFBI可能作為膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步探索TGFBI在GBM惡性進(jìn)展中可能存在的分子機(jī)制，我們采用了GSEA 富集分析，結(jié)果顯示TGFBI 在人膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制可能與Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號(hào)通路、NOD 樣受體(Nod-like receptors，NLRs)信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路密切相關(guān)。TLRs是一類重要的模式識(shí)別受體，參與人類自身免疫性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)TLRs 和相關(guān)的信號(hào)通路能夠介導(dǎo)膠質(zhì)瘤和其微環(huán)境中浸潤的巨噬細(xì)胞之間的相互作用，聯(lián)合激活巨噬細(xì)胞中TLR3/9可以更有效的抑制膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展[24]。故而我們推測(cè)TGFBI可能由M2型巨噬細(xì)胞自分泌后與自身TLRs 結(jié)合從而調(diào)控膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為。NLRs同樣是一種胞內(nèi)模式識(shí)別受體，在介導(dǎo)免疫和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[25]。已有研究報(bào)道NLRs參與膠質(zhì)瘤血管生成[26]并且Nod樣受體家族的分子NLRP3可通過白介素-1β和NF-κB通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲[27]，提示TGFBI 可能通過與NLRs相互作用參與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。TLRs和NLRs均是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，因此我們推測(cè)TGFBI 可能通過影響膠質(zhì)瘤的免疫微環(huán)境或者系統(tǒng)或局部的免疫反應(yīng)參與調(diào)控腫瘤的惡性生物學(xué)行為，具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。JAK-STAT 信號(hào)通路在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要，該通路的失調(diào)通常與人類惡性腫瘤相關(guān)[28]。近來有研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT 通路參與免疫調(diào)節(jié)過程，包括對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。Henrik 等[29]發(fā)現(xiàn)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中JAK-STAT 通路后可以將促炎/抗炎的平衡轉(zhuǎn)向促炎環(huán)境，提示TGFBI 可能通過該通路影響微環(huán)境而對(duì)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控，這些結(jié)果為后續(xù)研究TGFBI如何影響膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展提供了方向。

綜上所述，我們的研究強(qiáng)調(diào)了TGFBI 表達(dá)水平的升高與高的腫瘤分級(jí)和較差的腫瘤預(yù)后有關(guān)，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TGFBI 的高表達(dá)能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性增殖，增強(qiáng)其侵襲性，抑制凋亡和改變細(xì)胞周期的作用。然而TGFBI 對(duì)促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的機(jī)制尚需進(jìn)一步探索，此外，對(duì)于TGFBI 的促癌作用尚需在人腦的其他細(xì)胞系、膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)加以證實(shí)。