賈董浩,周心雨,詹恩琪,歐陽(yáng)子安,祝 瑩

江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 (鎮(zhèn)江 212013)

隨著人民生活水平的提高,高糖高脂食物攝入偏多,導(dǎo)致肥胖人口比例顯著增高。肥胖不僅影響著人體的身心發(fā)育,還可能引發(fā)高血壓、高血脂、心血管疾病、脂肪肝和糖尿病等多種慢性疾病[1]。但長(zhǎng)期服用降脂藥物的會(huì)產(chǎn)生肝功能損害等毒副作用。因此,從天然作物中探索具有防治脂代謝異常的有效成分將具有重要意義。

苦瓜(MomordicacharantiaL.)含有多糖、皂苷、多肽、類黃酮以及生物堿等活性成分,長(zhǎng)期以來(lái)作為一種藥食同源的食品被用來(lái)預(yù)防和改善肥胖、糖尿病等代謝綜合征[2]?？喙隙嗵鞘且环N苦瓜中重要的生理活性成分[3]。已有研究表明,苦瓜多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降膽固醇、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]?？喙显碥帐且环N植物糖苷,存在于苦瓜的根、莖、葉及果實(shí)中,以三萜皂苷為主,具有調(diào)脂降糖的作用[5]。但對(duì)于苦瓜多糖和皂苷聯(lián)合改善脂代謝、緩解脂質(zhì)沉積的研究較少,為了對(duì)苦瓜資源的開發(fā)提供更科學(xué)的數(shù)據(jù),可深入研究其活性成分聯(lián)合降脂活性。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種非寄生、可獨(dú)立生存且無(wú)毒無(wú)害的線蟲,具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳信息清楚、基因組測(cè)序完成、生長(zhǎng)周期短、繁殖量大、易于培養(yǎng)觀察、無(wú)害等特點(diǎn)[6]。線蟲脂代謝通路被證實(shí)與人類高度相似,且關(guān)鍵調(diào)控基因相似度極高,是一種優(yōu)良的模式生物。線蟲脂代謝調(diào)控的核心通路有胰島素信號(hào)通路和 TGF-β信號(hào)通路、核激素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 SREBP 調(diào)節(jié)的信號(hào)通路、5-羥色胺介導(dǎo)的信號(hào)通路等[7]。

因此,本實(shí)驗(yàn)旨在利用添加葡萄糖建立秀麗隱桿線蟲肥胖模型,探討苦瓜多糖與苦瓜皂苷聯(lián)合作用對(duì)秀麗隱桿線蟲脂質(zhì)沉積的影響,并探究苦瓜多糖與皂苷調(diào)節(jié)脂代謝是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜,購(gòu)自揚(yáng)中綠健苦瓜種植基地;線蟲 N2野生型菌株、大腸桿菌E.coliOP50,實(shí)驗(yàn)室保存。

油紅O染色液,購(gòu)于上海生工生物工程有限公司;甘油三酯(TG)和蛋白檢測(cè)試劑盒,購(gòu)于南京建成生物工程研究所;其他生化試劑,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

體視顯微鏡,南京江南永新光學(xué)有限公司;多功能酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技;正置顯微鏡,尼康光學(xué)儀器(中國(guó))有限公司;線蟲培養(yǎng)箱,上海一恒有限公司;FD-8型真空冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康有限公司;超凈臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1苦瓜多糖和苦瓜皂苷的制備

苦瓜多糖的提取:采用熱水浸提-乙醇沉淀的經(jīng)典方法。稱取25 g苦瓜凍干粉,95%乙醇回流2 h得濾渣,濾渣經(jīng)90 ℃熱水浸提3次,收集濾液,濃縮后采用Sevage法除蛋白,經(jīng)醇沉、透析、凍干后即得苦瓜多糖(BPS)。

苦瓜皂苷的提取:稱取苦瓜凍干粉100 g,石油醚脫脂,殘?jiān)尤?5%乙醇80 ℃回流提取2次,收集濾液,用水飽和的正丁醇萃取3 次,取正丁醇相濃縮至呈褐色粘稠狀時(shí)冷卻,甲醇溶解后加入丙酮充分?jǐn)嚢枋怪a(chǎn)生沉淀,離心,重復(fù)2 次,冷凍干燥得到苦瓜皂苷(BMS)。

1.3.2線蟲培養(yǎng)

線蟲以大腸桿菌OP50 為食,在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

線蟲同步化處理:用M9 緩沖液將處于產(chǎn)卵期的線蟲清洗至EP 管中,離心棄上清,再加入M9 緩沖液清洗兩遍。洗凈之后加入裂解液(0.5 mol/L NaOH 溶液和體積分?jǐn)?shù)2.5% NaClO),渦旋震蕩。線蟲裂解充分后,離心棄上清,M9 緩沖液反復(fù)清洗3 次,將蟲卵轉(zhuǎn)移至20 ℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜得L1 期幼蟲,待試驗(yàn)所用。

1.3.3模型的建立及試驗(yàn)分組

配置含100 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基,將同步化處理的L1期線蟲轉(zhuǎn)到高糖培養(yǎng)皿上培養(yǎng)48 h,即可建立肥胖線蟲模型[8]。試驗(yàn)分為正常組、模型組、BPS組(1 000 μg/mL BPS)、BMS組(100 μg/mL BMS)、BPS+BMS組(500 μg/mL BPS和50 μg/mL BMS),將BPS和BMS分別與大腸桿菌OP50菌液1∶1混勻,在高糖培養(yǎng)皿中加入混合液100 μL/個(gè),將處于L1期幼蟲轉(zhuǎn)到各組NGM培養(yǎng)皿上,恒溫培養(yǎng)48 h,即可進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.3.4線蟲體長(zhǎng)和體寬的測(cè)定

BPS和BMS處理線蟲48 h 后,隨機(jī)挑取30條左右線蟲到M9緩沖液中,60%異丙醇固定后,采用正置顯微鏡拍照,并用Image J對(duì)線蟲體長(zhǎng)和體寬進(jìn)行定量。

1.3.5線蟲運(yùn)動(dòng)指標(biāo)的測(cè)定

BPS和BMS處理線蟲48 h 后,參考白娟等[9]的方法測(cè)定頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率。頭部擺動(dòng)頻率:記錄1 min 內(nèi)線蟲頭部擺動(dòng)次數(shù),一個(gè)往返為擺動(dòng)1次;身體彎曲頻率:記錄1 min 內(nèi)線蟲身體彎曲次數(shù),假設(shè)以咽泵的方向規(guī)定為y軸,在爬行過(guò)程中,線蟲身體沿著x軸方向完成1次正弦運(yùn)動(dòng)即為1個(gè)身體彎曲。每組測(cè)定30 條線蟲。

1.3.6油紅O染色

M9 緩沖液收集BPS和BMS處理48 h 后的線蟲,離心棄上清,加入60%異丙醇脫水固定,離心棄上清,加入500 μL 油紅O 染色液,室溫避光震蕩6～18 h后離心棄上清,加入0.01%Triton-X100,在正置顯微鏡下拍照。

1.3.7甘油三酯含量測(cè)定

BPS和BMS 處理同步化L1 線蟲48 h 后,用M9 緩沖液洗線蟲3 遍,自然沉降,棄上清,加入適量M9 重懸,超聲破碎后離心取上清液。根據(jù)甘油三酯試劑盒說(shuō)明書測(cè)定含量,蛋白質(zhì)含量根據(jù)Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。每組3 個(gè)平行試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用ANOVA 單因素方差分析比較多組間的差異顯著性,p<0.05 為具有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲體長(zhǎng)和體寬的影響

秀麗隱桿線蟲的基礎(chǔ)生理指標(biāo)如體長(zhǎng)、體寬會(huì)受到食物和生長(zhǎng)環(huán)境的影響,可反映其生長(zhǎng)狀態(tài)[10]。圖1展示的是苦瓜多糖和皂苷添加后對(duì)線蟲體長(zhǎng)和體寬的影響。從圖1(a)可知,添加葡萄糖后,線蟲的體長(zhǎng)顯著高于正常組(p<0.05),可能是因?yàn)楦咛黔h(huán)境刺激了線蟲,導(dǎo)致體長(zhǎng)應(yīng)激性增加?？喙显碥仗砑雍?線蟲體長(zhǎng)顯著減小(p<0.05),但苦瓜多糖不能降低高糖誘導(dǎo)的線蟲體長(zhǎng)增加;苦瓜多糖和皂苷聯(lián)合作用后,線蟲的體長(zhǎng)有減小的趨勢(shì),與正常組線蟲無(wú)顯著差異,說(shuō)明苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。從圖1(b)可知,添加葡萄糖后,線蟲的體寬顯著增加,而苦瓜多糖和苦瓜皂苷單獨(dú)添加或聯(lián)合添加均能降低線蟲的體寬,且與模型組具有顯著差異。結(jié)果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效地降低線蟲的體寬,且具有一定協(xié)同作用。

圖1 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲體長(zhǎng)和體寬的影響

2.2 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響

線蟲的頭部擺動(dòng)和身體彎曲是考查其運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo),而線蟲的運(yùn)動(dòng)能力可以反映其能量消耗的情況[11]。從圖2(a)中可看出,各組線蟲的頭部擺動(dòng)頻率無(wú)較大差異,但模型組頭部擺動(dòng)頻率略低于正常組;而添加苦瓜多糖、苦瓜皂苷培養(yǎng)的線蟲頭部擺動(dòng)頻率均高于模型組。如圖2(b)所示,各組線蟲的身體彎曲頻率有一定差異,其中模型組線蟲身體彎曲頻率與正常組相比也有降低的趨勢(shì),但無(wú)顯著差異(p>0.05);添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷培養(yǎng)的線蟲身體彎曲頻率均顯示出高于模型組的現(xiàn)象,且苦瓜多糖和皂苷聯(lián)合添加的線蟲身體彎曲頻率的升高最為顯著(25.79 次數(shù)/min 對(duì)比 18.42 次數(shù)/min)(p<0.05)。以上結(jié)果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能通過(guò)增加線蟲運(yùn)動(dòng)行為增加能量消耗,且二者聯(lián)合添加時(shí)效果最優(yōu),具有協(xié)同增加線蟲能量消耗的作用。預(yù)示苦瓜多糖和皂苷可能具有協(xié)同調(diào)節(jié)脂代謝的作用。

圖2 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響

2.3 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲脂肪沉積的影響

秀麗隱桿線蟲的脂肪主要位于皮下組織及腸道,呈脂滴狀。脂溶性染料油紅O可特異性地附著于中性脂肪分子而使其呈現(xiàn)紅色,因此可直接觀察到線蟲體內(nèi)脂肪沉積的情況。通過(guò)油紅O染色,可以初步判斷脂肪沉積情況。如圖3所示,與正常組相比,模型組線蟲體內(nèi)紅色較深且染色面積較大。BPS100組和BMS100組體內(nèi)紅色均變淺,BPS+BMS組體內(nèi)紅色較淺且染色面積較小。通過(guò)Image J軟件進(jìn)一步分析油紅O染色圖像,測(cè)定線蟲脂肪占比,可以較為準(zhǔn)確的分析功能成分對(duì)線蟲的脂肪沉積影響。從圖4可以看出,模型組的相對(duì)脂肪含量相較正常組有顯著增加(54.24% 對(duì)比62.88%);經(jīng)過(guò)苦瓜多糖和皂苷處理后的線蟲相對(duì)脂肪含量較模型組均顯著降低(p<0.05),其中苦瓜皂苷處理過(guò)的線蟲相對(duì)脂肪含量降低最明顯(55.80%對(duì)比62.88%)。這表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效減少線蟲體內(nèi)的脂肪沉積,且苦瓜多糖和皂苷可以聯(lián)合降低線蟲體內(nèi)脂肪沉積。

圖3 線蟲油紅O染色圖

圖4 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲脂肪沉積的影響

2.4 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲甘油三酯含量的影響

油紅O染色結(jié)果已顯示苦瓜多糖和皂苷可以協(xié)同降低高糖誘導(dǎo)的肥胖線蟲體內(nèi)的脂肪沉積,為進(jìn)一步研究苦瓜多糖和皂苷的協(xié)同降脂作用,我們繼續(xù)測(cè)定線蟲體內(nèi)甘油三酯水平。如圖5所示,模型組線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量明顯高于正常組(0.82 mg/gprot 對(duì)比 1.69 mg/gprot),而添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷后線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量均不同程度地低于模型組(p<0.05),且添加BPS+BMS組線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量最低(0.52 mg/gprot)。線蟲體內(nèi)甘油三酯含量的變化與線蟲脂肪沉積的結(jié)果一致,均表明苦瓜多糖和皂苷可以協(xié)同調(diào)節(jié)線蟲脂代謝。前期研究表明,苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞和線蟲的脂代謝[4-5],而本研究進(jìn)一步證實(shí)了苦瓜多糖和皂苷可以發(fā)揮協(xié)同降脂作用。

圖5 苦瓜多糖和皂苷對(duì)線蟲甘油三酯含量的影響

3 結(jié)論

綜上所述,苦瓜多糖和苦瓜皂苷均對(duì)N2野生型線蟲的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用,且能降低線蟲的體寬、增加身體彎曲頻率,具有一定的協(xié)同作用;同時(shí)還能減少N2野生型線蟲體內(nèi)的脂肪堆積,降低體內(nèi)的甘油三酯含量,且二者聯(lián)合添加時(shí)效果最優(yōu),具有協(xié)同調(diào)節(jié)脂代謝的作用。研究結(jié)果為我們開發(fā)以苦瓜為主要成分的降脂功能食品提供了依據(jù)。