李俊花 劉 浩 張海平 趙曉軍 曾 皓 錢發(fā)聰 鄧 綱

（1 云南大學農(nóng)學院，昆明 650504；2 云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051）

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，每年由于病蟲害的發(fā)生導致糧食減產(chǎn)24%，其中有10%的減產(chǎn)是由蟲害導致的[1]。董大志等[2]在2010-2011 年期間開展云南煙草害蟲調查，發(fā)現(xiàn)云南煙草害蟲有96 種，主要害蟲優(yōu)勢種有小地老虎、銅綠麗金龜?shù)?。長時間以來，受數(shù)量效益型經(jīng)濟發(fā)展方式的影響，化學方法仍是煙草病蟲害防治的主要方法，而長期使用化學防治導致的煙葉農(nóng)藥殘留、蟲害抗藥性增加以及生態(tài)環(huán)境問題日益突出[3-4]。為了減少農(nóng)藥的使用量，維持生物多樣性，很多煙草科技工作者意識到在煙草上從事生物防治的重要性[5]。而隨著對食品安全和環(huán)境保護的重視，越來越多的高效低毒生物類殺卵劑被廣泛應用，如苦參堿·印楝素、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）等[6]。這類生物源農(nóng)藥的作用機制機理不同于一般普通的化學類農(nóng)藥，比如生物源農(nóng)藥不易導致害蟲產(chǎn)生抗藥性[7-8]，對農(nóng)作物安全且無殘留物危害，而且有的生物源農(nóng)藥有利于作物生長，如印楝素乳油和蘇云金桿菌乳劑對有機水稻有顯著的增產(chǎn)效果[9]。生防細菌具有直接獲取、定殖快速、適應力強、效果穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點，在防治植物細菌性或真菌性的病害中廣泛利用[10]。近年研究已發(fā)現(xiàn)一些用于防治蟲害和促生長的生防細菌，如綠僵菌不僅可以防治蟲害，同時其能夠在植物根際和根內宿存，促進植物生長[11-13]；貪噬菌屬（Variovorax）可以通過與根際環(huán)境互作維持根系正常發(fā)育[14]。

基于煙草對農(nóng)藥殘留、高品質以及生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的要求，本文設置不同生物菌劑處理對煙草蟲害防控和煙草生長的影響進行研究，以期獲得一種具有防蟲和促生長雙重效果的生物菌處理，并得到該處理下的農(nóng)藝和生理指標變化規(guī)律，為未來煙草高效蟲害綠色防控提供新的技術和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試品種供試煙草品種為云煙87。田間試驗的種子、煙苗均由云南省昆明市煙草公司嵩明縣分公司阿子營煙站提供。

1.1.2 供試藥劑苦參·印楝素：總有效成分含量為1%，苦參堿含量為0.4%，印楝素含量為0.6%，購自云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司；蘇云金桿菌：即蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），屬于芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，是近年來應用最廣泛的微生物殺蟲劑，有效成分含量為16000IU/mg，購自云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司；金龜子綠僵菌：屬于子囊菌門、麥角菌科、綠僵菌屬，是一種廣譜性的殺蟲真菌，有效成分含量為100 億孢子/mL，購自云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司；微生物菌W-1：即聚硼貪噬菌，屬于貪噬菌屬，可調控生長素濃度，維系根系健康生長。將分離純化的微生物菌W-1 在搖床150r/min，25℃設置下培養(yǎng)4d，使菌液濃度達到對數(shù)期，即106以上，呈比較渾濁的狀態(tài)即可。煙草蟲害常規(guī)對照處理（CK）不施用任何菌劑。

1.1.3 供試肥料有機肥為烤煙生產(chǎn)專用有機肥，N+P2O5+K2O ≥5%，有機質含量≥45%，水分≤30%，購自云南納若生物工程有限責任公司；復合肥為云南煙草專用肥，總養(yǎng)分≥47%（含硝態(tài)氮），N∶P2O5∶K2O=15∶8∶24，購自云南歐羅漢姆肥業(yè)科技有限公司；農(nóng)家肥：由昆明市嵩明縣煙草公司阿子營煙站提供，由當?shù)氐目葜∪~堆積半年以上發(fā)酵后而成，主要養(yǎng)分為氮、磷、鉀和有機質；農(nóng)業(yè)用硝酸鉀為云南煙草專用肥，總氮≥13.5%，氧化鉀≥44.5%，氯離子≤1.2%，購自云南歐羅漢姆肥業(yè)科技有限公司；農(nóng)業(yè)用硫酸鉀為云南煙草專用肥，水溶性氧化鉀≥52%，硫含量≥17%，氯含量≤1.5%，購自國投新疆羅布泊鉀鹽有限責任公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗地點該試驗選取蟲害較為嚴重的地塊，位于云南省昆明市嵩明縣阿子營村，紅壤土，試驗地海拔2100m，25.338958°N、102.783402°E，年平均氣溫14℃，年降水量1100mm，土壤pH 值為4.61，有機質22.90g/kg，水解性氮（N）132.71mg/kg，有效磷（P）99.17mg/kg，速效鉀（K）194.35mg/kg，電導率237.00μs/cm，陽離子交換總量3.82cmol/kg，適宜種植玉米和烤煙等農(nóng)作物。

1.2.2 試驗設計本試驗共設計4 個處理（表1），每個處理3 次重復，共12 個小區(qū)，各小區(qū)隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積50m2（60 株煙），種植密度行間距120cm，株距80cm，試驗區(qū)外設置2 行煙草作為保護行。

表1 不同試驗處理施用的生物菌劑

1.2.3 田間管理試驗中各個處理所施用的生物菌劑有所不同，煙草蟲害常規(guī)對照處理（CK）不施用任何菌劑，但各個處理施用底肥和追肥所用肥料種類及含量均相同，即每hm2施用底肥所用的有機肥為1500kg、復合肥300kg、農(nóng)家肥1200kg，施用方式為穴施，施用時間4 月26 日（移栽期）；每hm2追施農(nóng)業(yè)用硝酸鉀150kg，農(nóng)業(yè)用硫酸鉀225kg，施用方式為穴施，施用時間6 月1 日（旺長期）。其他田間栽培管理一致，及時修剪病蟲枝葉，保持田間干凈，避免滋生病害。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 不同生物菌劑處理煙草農(nóng)藝性狀的測定測量煙草農(nóng)藝性狀時間為7 月1 日（旺長期），各處理小區(qū)選擇有代表性的5～10 株煙株掛牌標記，按YC/T 142—1998《煙草農(nóng)藝性狀調查方法》的標準，測定煙株的農(nóng)藝性狀，包括煙株的株高、最大葉長、最大葉寬、莖圍、有效葉片數(shù)，取平均值后為1 次重復，測量3 個重復小區(qū)，即所有指標皆設生物學重復3 次。

1.3.2 不同生物菌劑處理煙草酶活性的測定在煙草采收前期（8 月5 日）進行煙草葉片的采集，在每個小區(qū)隨機選取煙株中部葉子，即從根部第1 片往上數(shù)大約第8 片煙葉，每個小區(qū)取10 片葉子混成1個樣為1 次重復（約10g），3 個小區(qū)即為3 次生物學重復。所取葉片測定相關生理生化指標，包括葉片葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL），均采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的相應試劑盒按照說明書進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)取3 次重復的平均值，試驗數(shù)據(jù)及表格制作采用Microsoft Excel 2021軟件進行處理，統(tǒng)計分析運用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，采用LSD 多重比較法（P＜0.05）進行方差分析，采用Pearson 相關性檢驗進行數(shù)據(jù)相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同生物菌劑對煙株農(nóng)藝性狀的影響由表2 可知，施用不同生物菌劑的處理相對于CK 處理，煙株的不同農(nóng)藝性狀變化不同。本試驗中施用不同生物菌劑對煙株農(nóng)藝性狀的株高、莖圍影響較小，各處理與CK 均無顯著差異，但T3 處理的株高相對于CK 處理呈上升現(xiàn)象，株高最大，為38.22cm，株高大小順序為T3＞CK＞T2＞T1，T2 和T1 處理較CK 分別下降0.94%、5.09%，T3 處理提升9.20%。莖圍與株高類似，各個處理間差異不顯著，最大值和最小值分別為8.36cm（T2）、8.11cm（T1），兩者相差很小，說明各個處理對莖圍影響較小。CK 處理與T1、T2 處理的葉長差異不顯著，與T3 處理差異顯著，但不同生物菌劑處理的葉長相對于CK 處理均有所增加，煙株葉長最大值為66.11cm（T3），最小值為58.67cm（CK），葉長大小順序為T3＞T1＞T2＞CK，3 個生物菌劑處理較CK 葉長分別提升了12.68%（T3）、7.38%（T1）、3.97%（T2）。煙株葉寬與葉長變化相類似，最大值為29.67cm（T3），最小值為23.56cm（CK），葉寬大小順序為T3＞T1＞T2＞CK，T3 處理與CK 處理差異顯著，3 個生物菌劑處理較CK 葉寬分別提升了25.93%（T3）、8.49%（T1）、7.05%（T2）。T2、T3 處理煙株有效葉片數(shù)與CK處理相比較差異不顯著，但3 個生物菌劑處理有效葉片數(shù)均低于CK 處理，有效葉片數(shù)大小順序為CK＞T3＞T2＞T1。綜合以上農(nóng)藝性狀指標結果，各處理之間株高和莖圍差異不顯著，3 個生物菌劑處理較對照葉長、葉寬有不同程度增加，有效葉片數(shù)減少，但T2、T3 處理減少不顯著。因此相對于T1 和T2 處理，T3 處理對煙株的生長促進作用更強。

表2 不同處理對煙株農(nóng)藝性狀的影響

2.2 不同生物菌劑對煙草生理生化指標的影響由圖1 可知，不同生物菌劑處理后與CK 相比較，T3處理顯著抑制SOD 活性；T2 和T3 處理均顯著抑制CAT 活性；T1 和T2 處理顯著抑制Pro 含量，且對可溶性蛋白含量也有顯著抑制作用；3 個處理均顯著抑制PAL 活性，但與對照葉綠素含量均差異不顯著；T3 處理對POD 和可溶性糖含量有顯著促進作用，其中T3 處理POD 活性為3697.87U/g，可溶性糖含量為51.25mg/g，CK 處理POD 活性為2093.93U/g，可溶性糖含量為42.18mg/g，即相對于CK 處理，T3處理POD 活性增加了76.60%，可溶性糖含量增加了21.50%；T1、T2 和T3 處理均顯著促進PPO 活性，PPO 活性大小順序為T2＞T1＞T3＞CK，分別提升80.46%（T2）、64.94%（T1）、61.19%（T3）。植物遭受逆境時會產(chǎn)生SOD、POD、CAT、PPO、PAL等來抵御逆境所帶來的傷害，則這些酶活性越高抗逆性相對來說較強。而MDA 在植物體內積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，MDA 含量越高則植物細胞受到的損傷越大，脯氨酸（Pro）和可溶性蛋白是植物體內理想的滲透調節(jié)物質，可溶性糖影響烤后煙葉的水溶性總糖和還原糖，葉綠素隨著煙葉的成熟而逐漸減少，若葉綠素含量過少則影響煙葉的成熟度進而影響烘烤煙葉的品質。綜合煙草葉片生理生化指標結果，T3 處理對煙株病害的抗逆性強于T1 和T2 處理。

圖1 不同處理對煙草葉片生理生化指標的影響

2.3 不同生物菌劑處理煙草農(nóng)藝性狀及葉片酶活性的相關性分析分別對不同生物菌劑處理煙草農(nóng)藝性狀的株高、葉長、葉寬、莖圍、有效葉片數(shù)和煙草葉片SOD、POD、CAT、PPO、PAL 酶活性及MDA、Pro、可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素之間的相關性進行分析（表3）。由結果可見，SOD 與POD、MDA、株高呈極顯著或顯著負相關，POD、MDA、株高三者之間呈極顯著正相關，POD 與可溶性糖呈顯著正相關，CAT 與PAL 呈顯著正相關，PPO 與PAL呈極顯著負相關，MDA 與可溶性糖和葉寬呈顯著正相關、與株高呈極顯著正相關，Pro 與可溶性蛋白和有效葉片數(shù)呈顯著正相關，可溶性糖與株高呈極顯著正相關，可溶性蛋白與有效葉片數(shù)呈極顯著正相關，葉長與葉寬呈顯著正相關。

表3 不同生物菌劑處理對煙草農(nóng)藝性狀及葉片酶活性的相關性分析

3 結論

植物生長會遭遇許多逆境，煙草侵染性病害的發(fā)生嚴重影響著煙葉的產(chǎn)量和品質，制約著煙草生產(chǎn)的發(fā)展[15-16]，而蟲害侵襲是影響植物生長品質的一個重要因素。在本試驗中5 月中旬至5 月底天氣連續(xù)下雨，影響煙草生長發(fā)育速度，使得煙草團棵期推遲，推測為本試驗施用不同生物菌劑煙株相對于對照煙株的農(nóng)藝性狀多出現(xiàn)下降的原因。而3 種處理相對于對照處理在防御病蟲害的情況下，對煙株的葉長、葉寬有促進作用，且微生物菌W-1（T3）處理相對于苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理促進作用更強，但是對煙株的有效葉片數(shù)無促進作用，推測微生物菌W-1 可促進單個葉片的長寬，而對有效葉片數(shù)并無顯著促進作用。

植物本身在遭遇蟲害時會做出一系列反應來抵御蟲害，通常將植物體抵御蟲害的機制分為組成型抗性和誘導型抗性[17-18]，誘導型抗性是植物遭遇蟲害時產(chǎn)生并激活防御酶活性，生成防御物質。SOD、POD 及CAT 是植物體內活性氧清除系統(tǒng)的主要保護酶，具有抵抗逆境脅迫的防御作用[19-21]。本研究中微生物菌W-1（T3）處理的SOD 酶活性顯著低于CK 處理，POD 酶活性顯著高于CK 處理，其余生物菌劑處理與對照均無顯著差異，金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）和微生物菌W-1（T3）處理的CAT 酶活性顯著低于CK 處理。SOD、POD及CAT 酶活性并不是都顯著高于CK 處理，而是有一定的差別，推測可能是在煙草采收前期進行取樣，煙草體內的酶活性已經(jīng)有一定程度的降低?？寡趸赶到y(tǒng)也包括PPO，在植物遭受逆境時，提高植株體內PPO 酶的活性，從而使植物細胞免受因氧化作用而產(chǎn)生的破壞，本研究中3 個生物菌劑處理的PPO 含量均顯著高于CK 處理，這與范艷玲等[22]研究的棗樹遭受蟲害后，其PPO 酶活性快速增加從而提高抗逆性一致。植物器官在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA 是膜脂過氧化主要產(chǎn)物之一，一般認為MDA 在植物體內積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，它的含量是判斷膜脂過氧化程度的一個重要指標[23]。本研究中微生物菌W-1（T3）處理MDA 含量顯著高于CK 處理，因此抗逆性低于CK處理，而苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理與CK 處理無顯著性差異。脯氨酸（Pro）在生物體內不僅是理想的滲透調節(jié)物質，還可作為膜和酶的保護物質及自由基清除劑，從而對植物在滲透脅迫下的生長起到保護作用，本研究中苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理脯氨酸含量與CK 處理相比顯著降低，表明這2 個處理的抗逆性在脯氨酸方面較CK 處理差。PAL 參與植物抗蟲性與產(chǎn)生的木質素和植保素的苯丙烷類代謝途徑有關，木質素的積累加厚細胞壁，影響昆蟲取食，植保素有毒害和趨避作用，而本研究中3 個生物菌劑處理的PAL 酶活性均低于對照處理，這與Constabel等[24]在JA 和SA 循環(huán)代謝途徑中，蟲害脅迫常會造成植物體內PAL 活性升高的研究結果完全相反，推測可能是與煙株所受蟲害的昆蟲有關。可溶性糖含量高的煙葉較柔軟，色澤鮮亮。董傳媛[25]研究表明，油茶葉片的可溶性糖含量呈遞增趨勢，與發(fā)病率呈正相關。而可溶性蛋白作為植物體內重要的滲透調節(jié)物質，與植食性害蟲的寄主選擇行為有關，植物中可溶性蛋白含量升高，害蟲的存活率、生長發(fā)育速度及生殖力會相對提高[26]。本研究中微生物菌W-1（T3）處理可溶性糖與CK 處理有顯著差異，明顯高于對照處理，而3 個生物菌劑處理的可溶性蛋白含量都低于CK 處理，但是微生物菌W-1（T3）處理的可溶性蛋白含量高于苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理。本研究中不同處理煙株葉綠素無顯著差異，不同生物菌劑的施用對葉綠素影響不大。綜合以上煙草抗逆相關指標，3 個生物菌劑處理以微生物菌W-1 處理最佳。

影響煙草農(nóng)藝性狀和葉片酶活性的因素有很多，比如施肥種類、品種、生產(chǎn)條件等。本研究中POD 和MDA、可溶性糖、株高，CAT 和PAL，MDA 和可溶性糖、株高、葉寬，Pro 和可溶性蛋白、有效葉片數(shù)，可溶性糖和株高，可溶性蛋白和有效葉片數(shù)，葉長和葉寬均呈顯著或極顯著正相關，說明它們關系密切。其中POD 與株高、MDA、可溶性糖呈正相關，這與孟莉等[27]的研究發(fā)現(xiàn)POD 活性在煙葉生長過程中與總酚的含量呈現(xiàn)正相關趨勢研究一致，其他具體原因有待深究。

通過對施用不同害蟲生防菌劑對煙草農(nóng)藝性狀、葉片生理生化指標及兩者的相關性，綜合本文研究可得施用微生物菌W-1 控制煙草蟲害，煙草生長生理指標最優(yōu)。