何丹,石艷宏,王崢,張曉煒,王冠杰

非肌層浸潤膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer,NMIBC)是最常見的膀胱癌類型,治療手段包括手術、灌注化療等,但腫瘤術后極易復發(fā)[1-2]。尋找能夠反映患者預后的腫瘤標志物,具有重要臨床意義。核糖核酸結合蛋白15(RNA binding motif protein 15,RBM15)是一種甲基轉移酶,參與mRNA N6-甲基腺苷修飾(N6-methyladenosine,m6A)。研究發(fā)現,RBM15在鼻咽癌、腎癌等腫瘤中表達增加能促進腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成,導致腫瘤侵襲和轉移[3-4]。泛素特異性肽酶24(ubiquitin specific peptidase 24,USP24) 屬于半胱氨酸蛋白酶家族成員,能夠與底物蛋白上的泛素分子結合,發(fā)揮去泛素酶活性[5]。另有研究發(fā)現,肺癌、急性淋巴細胞白血病等腫瘤中USP24的過度表達能抑制腫瘤細胞凋亡,發(fā)揮腫瘤促進作用[6-7]。本研究通過檢測膀胱癌組織中RBM15、USP24的表達,探討兩者的臨床意義,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年1月西安市中心醫(yī)院腫瘤科診治NMIBC患者90例為研究對象,男52例,女38例,年齡33～79 (63.17±4.78)歲;有吸煙史40例;腫瘤數目:單發(fā)63例,多發(fā)27例;腫瘤分期:T1期50例,Ta/Tis期40例;病理分級:低級別尿路上皮癌47例,高級別尿路上皮癌43例;腫瘤大小:>3 cm者29例,≤3 cm者61例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準通過(2017MJ076),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者均接受經尿道膀胱腫瘤電切,經術后病理明確診斷為NMIBC;②首次診治,術前未接受其他治療;③臨床資料和隨訪資料完整。(2)排除標準:①合并其他器官惡性腫瘤;②合并嚴重肝腎功能障礙;③合并嚴重尿道狹窄、脊柱畸形及凝血功能障礙等經尿道手術禁忌證者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 膀胱癌組織USP24、RBM15蛋白表達:術中留取膀胱癌組織和癌旁組織,10%中性甲醛固定后,常規(guī)石蠟包埋切片,常規(guī)進行免疫組化染色。USP24兔單克隆抗體購于英國Abcam公司(貨號ab129064)。RBM15兔多克隆抗體購自美國CST公司(貨號60386)。組織標本梯度酒精脫水后中性樹脂包埋,切片置于顯微鏡下(日本Olympus公司,型號DX31,×200),觀察染色情況,每張切片隨機選取5個視野﹐腫瘤細胞中出現棕褐色染色為陽性表達,淺黃色或無著色為陰性表達。根據膀胱癌組織RBM15、USP24蛋白表達,分為RBM15陽性組(n=60)和陰性組(n=30)以及USP24陽性組(n=67)和陰性組(n=23)。

1.3.2 術后隨訪:病理確診膀胱癌后每3個月電話或門診隨訪1次,隨訪內容為腫瘤復發(fā)進展及患者生存情況,隨訪終點為2023年2月1日。腫瘤進展定義為腫瘤發(fā)生復發(fā)、轉移或發(fā)生腫瘤相關死亡。無進展生存時間(progression free survival,PFS)定義為自確診之日至腫瘤復發(fā)、轉移或腫瘤相關死亡的間隔時間。

2 結 果

2.1 NMIBC癌及癌旁組織中RBM15、USP24表達 RBM15蛋白棕黃色陽性染色位于細胞核,USP24棕褐色陽性染色位于細胞膜和細胞漿。膀胱癌組織中RBM15、USP24陽性率分別為66.67%(60/90)和74.44%(67/90),高于癌旁組織中RBM15、USP24陽性率6.67%(6/90)、11.11%(10/90),差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=69.761、73.739,P均<0.001),見圖1。

圖1 NMIBC癌組織及癌旁組織中RBM15、USP24蛋白表達比較(免疫組織化學染色,×200)

2.2 NMIBC癌組織中RBM15與USP24表達的相關性 Spearman秩相關分析顯示,NMIBC癌組織中RBM15與USP24表達呈顯著正相關(r=0.716,P<0.001)。

2.3 RBM15、USP24表達在不同臨床病理特征中的差異比較 NMIBC癌組織中RBM15、USP24陽性率在腫瘤分期T1期、病理分級高級別中分別高于腫瘤分期Ta/Tis期及病理分級低級別(P均<0.001),而在其他臨床病理特征中比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 RBM15、USP24蛋白表達在不同臨床病理參數中比較 [例(%)]

2.4 RBM15、USP24表達對NMIBC患者無進展生存預后的影響 隨訪期間,發(fā)生腫瘤進展36例,3年無進展生存率為60.00%(54/90)。RBM15陽性組和陰性組3年無進展生存率分別為45.00%(27/60)、90.00%(27/30)。USP24陽性組和陰性組3年無進展生存率分別為50.75%(34/67)、86.96%(20/23)。RBM15陽性組、USP24陽性組累積無進展生存率明顯低于RBM15陰性組、USP24陰性組(Log Rankχ2=8.057、15.379,P=0.005、<0.001),見圖2。

圖2 Kaplan-Meier曲線分析RBM15、USP24表達對NMIBC患者無進展生存預后的影響

2.5 影響NMIBC患者無進展生存預后的多因素COX回歸分析 以NMIBC患者是否發(fā)生腫瘤進展為因變量(1=發(fā)生,0=未發(fā)生),以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素COX回歸分析,結果顯示:病理分級高級別、腫瘤分期T1期、RBM15陽性、USP24陽性是影響NMIBC患者無進展生存預后的獨立危險因素(P<0.01),見表2。

表2 影響NMIBC患者無進展生存預后的多因素COX回歸分析

3 討 論

膀胱癌是全球第十大常見惡性腫瘤,我國每年新發(fā)病例達8.2萬例,發(fā)病率為5.8/10萬,嚴重威脅我國人民健康[8]。NMIBC是最常見的膀胱癌類型,其發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程,吸煙、環(huán)境中有毒物質及遺傳等因素均是重要的致病因素。目前NMIBC的治療以手術、化療及免疫治療為主,但由于NMIBC具有較高的異質性,且術中難以徹底切除微小腫瘤病灶,術后可發(fā)生腫瘤復發(fā)轉移,導致患者死亡[9]。深入研究NMIBC發(fā)生發(fā)展的機制,尋找能夠評估NMIBC患者預后的分子標志物,有利于選擇相應的治療方案及隨訪方案,改善高?；颊叩呐R床預后。

m6A修飾是mRNA中腺嘌呤的第6位氨基發(fā)生甲基化的修飾方式[10]。RBM15作為一種甲基轉移酶,是m6A修飾的書寫者,能夠調控癌基因mRNA的表達,在腫瘤干細胞更新分化、免疫調節(jié)及藥物敏感性等的調節(jié)中,發(fā)揮重要的生物學作用[11-12]。本研究發(fā)現,NMIBC癌組織中RBM15表達升高,提示RBM15參與NMIBC的腫瘤發(fā)生過程。NMIBC中RBM15表達升高可能與非編碼RNA的表達調控有關。有學者報道,環(huán)狀RNA CTNNB1能夠與RBM15相互作用,增加RBM15蛋白穩(wěn)定性,RBM15通過m6A修飾促進己糖激酶2、葡萄糖-6-磷酸異構酶的表達,促進腫瘤細胞無氧糖酵解,促進腫瘤惡性進展[13]。此外,亦有學者發(fā)現,腎癌腫瘤細胞中EP300/CBP復合體能夠誘導RBM15基因啟動子的組蛋白3乙酰化修飾,轉錄水平促進RBM15基因的表達[4]。本研究中,RBM15表達與NMIBC不良臨床病理特征有關,提示RBM15促進NMIBC的腫瘤進展。分析其機制,可能是RBM15的表達影響腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤。有學者報道,膀胱癌組織中RBM15的表達升高能夠促進髓源性抑制細胞、粒細胞的浸潤,并能夠促進T淋巴細胞表面程序性死亡因子1的表達,從而誘導腫瘤細胞的免疫逃逸的發(fā)生,導致患者不良預后[14]。Zeng等[4]報道,腎癌中RBM15的表達上調能夠促進腫瘤細胞中CXC趨化因子配體11的分泌,促進腫瘤相關巨噬細胞浸潤和M2型極化,繼而增強腫瘤細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲等惡性潛能。本研究中,RBM15陽性NMIBC患者無進展生存預后較差,表明RBM15是新的NMIBC預后相關腫瘤標志物。筆者分析,RBM15作為一種m6A修飾中的關鍵因子,其可能通過促進腫瘤干性、腫瘤抑制免疫微環(huán)境的形成,增強腫瘤細胞對化療藥物、免疫檢查點抑制劑治療的抵抗性,增加NMIBC患者腫瘤局部復發(fā)進展的風險[15]。另外,RBM15陽性表達的腫瘤細胞增殖和遷移能力顯著增強,經尿道膀胱腫瘤電切術中病灶難以徹底清除,病灶周圍微小轉移病灶不易被發(fā)現,造成術后腫瘤復發(fā)[3]。臨床醫(yī)生可根據膀胱癌組織中RBM15蛋白表達,對患者臨床預后進行評估,對于高危復發(fā)進展的患者予以積極化療及隨訪,以改善患者臨床預后。

USP24基因位于1p32.3,編碼蛋白是一種去泛素酶,可以特異性識別并去除靶蛋白中的泛素分子,在蛋白質水平參與炎性反應、惡性腫瘤及帕金森病等多種疾病的病理生理學過程[3]。研究發(fā)現,肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中USP24的表達上調通過調控DNA損傷修復相關基因的表達,促進腫瘤的惡性增殖和轉移,導致腫瘤進展[16]。本研究中,NMIBC中USP24表達升高,提示USP24參與NMIBC的腫瘤發(fā)生過程。USP24表達升高的機制與USP24基因的單核苷酸多態(tài)性有關。有學者報道,腫瘤基因組中USP24的單核苷酸多態(tài)性發(fā)生改變,RNA編輯異常引起突變體930C/T和7656T/C的比例顯著增加,USP24-930T和USP24-7656C通過增加RNA穩(wěn)定性增加USP24表達水平[17]。本研究中,USP24與NMIBC不良臨床病理特征有關,提示USP24參與促進NMIBC的腫瘤進展。分析其原因,可能與USP24能夠誘導NMIBC中免疫抑制微環(huán)境形成有關。研究發(fā)現,USP24的表達上調能夠穩(wěn)定p300蛋白,增加腫瘤細胞內核因子κB的水平,誘導肺癌細胞中白介素-6的表達,進而促進單核巨噬細胞向M2型極化,形成免疫抑制微環(huán)境,導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸,促進腫瘤進展[18]。此外,USP24可通過促進表皮生長因子受體Ser1616、Ser2047位點的磷酸化激活,增加腫瘤細胞內Bax和p300水平,促進細胞周期G1/S的轉換,促進腫瘤細胞增殖,抑制腫瘤細胞凋亡,導致腫瘤進展[19]。本研究中,USP24陽性表達是影響NMIBC患者無進展生存預后的獨立危險因素,提示檢測USP24表達有助于評估NMIBC患者的臨床預后。其原因可能與USP24影響化療的敏感性有關。有研究表明,USP24能夠與損傷特異性DNA結合蛋白2結合,抑制其泛素化蛋白酶體途徑降解,進而促進DNA損傷修復,增強對化療藥物抵抗性[20-21]。尚有學者在急性淋巴細胞白血病中,應用WP1130直接靶向結合USP24,抑制USP24及下游髓樣細胞白血病-1的表達,干擾線粒體跨膜電位,誘導腫瘤細胞凋亡[7]。因此,NMIBC中USP24的表達參與促進NMIBC腫瘤的發(fā)生發(fā)展,是NMIBC預后相關腫瘤標志物,以USP24為靶點的治療可能是潛在的NMIBC治療方案。本研究中,RBM15與USP24表達呈顯著正相關,提示兩者可能存在協(xié)同的作用關系。有學者發(fā)現,腫瘤中USP24與RBM15具有較強的相關性,USP24可通過增加RBM15蛋白的穩(wěn)定性,促進癌細胞的惡性增殖和侵襲[22]。但NMIBC中兩者的具體作用機制有待今后進行深入的實驗研究。

綜上所述,NMIBC癌組織中RBM15、USP24表達均升高,兩者表達與腫瘤分期、病理分級有關,共同參與膀胱癌的疾病進展。癌組織中RBM15、USP24陽性表達NMIBC患者無進展生存預后較差,是影響患者無進展生存預后的獨立危險因素。本研究尚存在一定的不足之處,一方面本研究樣本量有限,未能對NMIBC患者不同類型進行分層分析,有待今后擴大樣本含量進一步研究;另一方面,本研究未能對RBM15、USP24在NMIBC中具體作用機制進行研究,有待今后進行深入探索。

利益沖突：所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

何丹:設計研究方案,實施研究過程,數據獲取,論文撰寫;石艷宏:實施研究過程,資料搜集整理;王崢:分析試驗數據,論文審核;張曉煒:進行統(tǒng)計學分析;王冠杰:論文撰寫,論文修改