蘇 明 張愛民 李 琴 趙 娟 馮鵬玖 黃 倩 秦明秀 黃恒藝

(1 柳州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科,廣西柳州市 545000; 2 四川省腫瘤醫(yī)院.研究所,四川省癌癥防治中心,電子科技大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科,四川省成都市 610041; 3 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院疼痛科,廣西南寧市 530007)

帶狀皰疹后神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia,PHN)是由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起的疼痛,是臨床上常見的神經(jīng)病理性疼痛[1]。PHN的臨床表現(xiàn)主要為痛覺過敏、痛覺異常及自發(fā)性疼痛,該病遷延不愈,部分患者甚至終身都受影響。口服藥物治療在一定程度上可改善PHN患者的癥狀,但長(zhǎng)期服藥易出現(xiàn)難以耐受的不良反應(yīng)[2]。而神經(jīng)阻滯治療及微創(chuàng)介入治療需要反復(fù)治療,且因PHN的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制尚未完全明確,因此療效欠佳。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),采用樹脂毒素誘導(dǎo)的PHN動(dòng)物模型的脊髓背角組織中神經(jīng)元凋亡顯著性增加[3],由此推測(cè)抑制脊髓背角組織的神經(jīng)元凋亡可能是治療PHN的重要切入點(diǎn)[4]。但脊髓中樞在接受外周疼痛信號(hào)后,疼痛信號(hào)是如何誘導(dǎo)脊髓背角組織的神經(jīng)元發(fā)生凋亡,目前并未完全清楚。

單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是真核細(xì)胞的重要能量感受器,單磷酸腺苷/三磷酸腺苷值升高時(shí),處于激活狀態(tài)的AMPK啟動(dòng)細(xì)胞分解代謝、抑制合成代謝[5]。既往研究表明,AMPK不僅可通過調(diào)控蛋白翻譯、抑制炎癥反應(yīng)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá),以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性等途徑來緩解疼痛[6-8],還可通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)磷酸化程度來抑制中樞神經(jīng)組織的凋亡[9]。但AMPK是否也參與PHN的脊髓組織神經(jīng)元凋亡過程,目前鮮見有報(bào)告。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上,建立樹脂毒素誘導(dǎo)的PHN大鼠模型,進(jìn)一步探討AMPK/MTOR信號(hào)通路在介導(dǎo)PHN大鼠脊髓組織神經(jīng)元凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只無特定病原體級(jí)SD雄性大鼠均由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可號(hào):SCXK桂-2014-0002),體重150～200 g,鼠齡3～4個(gè)月。由實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一飼養(yǎng)大鼠,喂養(yǎng)環(huán)境的溫度控制在21 ℃左右,自然晝夜節(jié)律,給予大鼠正常飲食、飲水,避免噪聲和強(qiáng)光刺激。將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。本研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與藥品 樹脂毒素(Adooq Bioscience公司,批號(hào):57444-62-9),AMPK激動(dòng)劑阿卡地新(Acadesine,AICAR;Sigma Aldrich Lab &Production Materials公司,批號(hào):HPA021012),兔抗鼠AMPK α2抗體(Abcam公司,批號(hào):ab105028),兔抗鼠磷酸化AMPK α2 (phosphorylated AMPK α2,p-AMPK α2)抗體(Abcam公司,批號(hào):ab23875),兔抗鼠MTOR抗體(Abcam公司,批號(hào):ab134903),兔抗鼠磷酸化MTOR(phosphorylated MTOR,p-MTOR)抗體(Abcam公司,批號(hào):ab63552),兔抗鼠B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體(Abcam公司,批號(hào):ab182858),兔抗鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(Abcam公司,批號(hào):ab182733),兔抗鼠Caspase-3抗體(Abcam公司,批號(hào):13847),兔抗鼠GAPDH抗體(Abcam公司,批號(hào):ab8245)。熒光TUNEL試劑盒(Roche公司,批號(hào):TUN11684817),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):A0192),二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):P0012),RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):ml076982),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):P0012A),PVDF膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):FFP19)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的建立 (1)分組:使用SPSS 22.0軟件的隨機(jī)數(shù)字發(fā)生器將30只SD大鼠分為對(duì)照組、PHN組、PHN-AMPK激動(dòng)組(AICAR組),每組10只。(2)相關(guān)藥物配置方法:參考文獻(xiàn)[10]的方法配置樹脂毒素溶液,即將樹脂毒素溶解于新鮮配制的吐溫80、乙醇和生理鹽水混合液中(三者的比例為1 ∶1 ∶8),制成濃度為40 μg/mL的樹脂毒素溶液備用。參照說明書配置AICAR,用0.5%二甲基亞砜溶解AICAR后,再用PBS將AICAR稀釋為20 mol/L備用。(3)建模及給藥方法:除對(duì)照組外,參考文獻(xiàn)[11]對(duì)其余兩組大鼠腹腔注射0.2 μg/g的樹脂毒素以構(gòu)建PHN模型,如注射樹脂毒素后3 d,與對(duì)照組大鼠相比,PHN組與AICAR組大鼠的機(jī)械刺激縮足閾值(paw mechanical withdrawal threshold,PMWT)顯著下降且熱刺激縮足潛伏期(paw thermal withdrawal latency,PTWL)顯著延長(zhǎng),則提示建模成功。注射樹脂毒素7 d后,給予AICAR組大鼠腹腔注射10 mg/kg的AICAR,給予PHN組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水,兩組給藥均為1次/d,連續(xù)給藥7 d。實(shí)驗(yàn)期間正常喂養(yǎng)對(duì)照組大鼠,不給予任何干預(yù)。

1.4 標(biāo)本的獲取與保存 于給藥結(jié)束后次日,完成各組大鼠的行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)后,使用10%水合氯醛麻醉后處死各組大鼠,獲取L4～6脊髓組織。將一部分脊髓組織立即放入液氮中速凍30 min后取出并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?將另外一部分脊髓組織使用甲醛固定后行石蠟包埋、制作切片備用。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 行為學(xué)指標(biāo):參考文獻(xiàn)[3],在注射樹脂毒素前1 d及注射樹脂毒素后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d,分別使用Von Frey纖維絲(Danmic Global公司)檢測(cè)各組大鼠的PMWT,采用熱板法檢測(cè)大鼠的PTWL。(1)PMWT的檢測(cè)方法。首先使用0.4 g纖維絲垂直刺激大鼠右側(cè)后爪內(nèi)側(cè)同一區(qū)域皮膚,每次刺激1.5 s,連續(xù)3次,每次間隔5 min,若出現(xiàn)嘶吼、舔足、甩尾及彈腿等任一行為則提示該力度陽性,選擇小于此力度的下一型號(hào)纖維絲刺激,直到刺激出現(xiàn)陰性為止,將此時(shí)纖維絲的力度值記為PMWT,當(dāng)使用在0.07 g的纖維絲刺激時(shí)仍為陽性,則統(tǒng)一計(jì)數(shù)為0.07 g。若使用0.4 g纖維絲刺激時(shí)為陰性則選擇大于該力度的纖維絲刺激,直到呈現(xiàn)陽性,且將此時(shí)的力度值記為PMWT。(2)PTWL的檢測(cè)方法。將控制面板溫度設(shè)定為(55.0±0.5)℃進(jìn)行熱板實(shí)驗(yàn)。將各組大鼠置于熱痛閾檢測(cè)玻璃透明盒中,待其適應(yīng)環(huán)境后取出大鼠,將玻璃透明盒置于底部為已預(yù)熱的冷熱板痛覺測(cè)試儀(安徽耀坤生物科技有限公司,型號(hào):ZL-021)上,再將大鼠放入盒中,按動(dòng)“start”鍵,以大鼠舔足、抬足或躲避反應(yīng)作為疼痛反應(yīng)指標(biāo),當(dāng)大鼠出現(xiàn)上述反應(yīng)后立即按動(dòng)“stop”鍵以停止測(cè)量,記錄大鼠自置于熱板上至其出現(xiàn)疼痛反應(yīng)的時(shí)間,即為PTWL。

1.5.2 脊髓組織的細(xì)胞凋亡情況:參考文獻(xiàn)[3]的方法,采用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。取大鼠L4～6脊髓組織石蠟切片,常規(guī)進(jìn)行脫蠟水化,經(jīng)蛋白酶K工作液浸泡后使用PBS漂洗。配制TUNEL反應(yīng)混合液,即將50 μL TdT和450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻。在切片中滴加100 μL DNase Ⅰ,在37 ℃環(huán)境下反應(yīng)30 min,待玻片干后,滴加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液,加封口膜在濕盒中37 ℃下反應(yīng)1 h。經(jīng)PBS漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片,在熒光顯微鏡(OLYMPUS公司,型號(hào):BX53)100倍鏡(激發(fā)波長(zhǎng)為450～500 nm)下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的凋亡細(xì)胞數(shù),取平均值。

1.5.3 脊髓組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)量:采用Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量。取置于-80 ℃冰箱保存的脊髓組織30 mg,加入RIPA裂解液后行超聲勻漿,提取總蛋白,采用二喹啉甲酸法檢測(cè)其濃度。將蛋白煮沸5 min使其變性,取40 μg總蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE以分離蛋白,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶常溫封閉膜1 h,分別加入兔抗鼠AMPK α2、p-AMPK α2、MTOR、p-MTOR、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH抗體(稀釋比均為1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜后復(fù)溫30 min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1 ∶2 000)常溫孵育2 h,經(jīng)ECL法顯色后,在凝膠成像儀(Bio-Rad公司,型號(hào):12003153)獲取蛋白條帶, 使用Image Lab軟件測(cè)量目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值,以兩者的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠PMWT的比較 數(shù)據(jù)不滿足球形分布(P<0.001),故進(jìn)行Greenhouse-Geisser校正,結(jié)果顯示,3組大鼠PMWT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=207.859,P組間<0.001),PMWT有隨時(shí)間延長(zhǎng)而變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=168.380,P時(shí)間<0.001),分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=6.895,P交互<0.001)。進(jìn)一步行分組因素和時(shí)間因素的單獨(dú)效應(yīng)分析,結(jié)果顯示,在注射樹脂毒素后3～15 d各時(shí)間點(diǎn),PHN組和AICAR組大鼠的PMWT低于對(duì)照組,但在注射樹脂毒素后9～15 d各時(shí)間點(diǎn),AICAR組大鼠的PMWT高于PHN組(P<0.05);PHN組和AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后3～7 d各時(shí)間點(diǎn)的PMWT低于注射樹脂毒素前1 d和注射樹脂毒素后1 d的PMWT,但AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后9～15 d各時(shí)間點(diǎn)的PMWT高于注射樹脂毒素后3～7 d各時(shí)間點(diǎn)的PMWT(P<0.05),見表1。

2.2 3組大鼠PTWL的比較 數(shù)據(jù)不滿足球形分布(P<0.001),故進(jìn)行Greenhouse-Geisser校正,結(jié)果顯示,3組大鼠的PTWL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=70.789,P組間<0.001),PTWL有隨時(shí)間延長(zhǎng)而變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=79.380,P時(shí)間<0.001),分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=12.945,P交互<0.001)。進(jìn)一步行分組因素和時(shí)間因素的單獨(dú)效應(yīng)分析,結(jié)果顯示,在注射樹脂毒素后3～15 d各時(shí)間點(diǎn),PHN組和AICAR組大鼠的PTWL長(zhǎng)于對(duì)照組,但在注射樹脂毒素后9～15 d各時(shí)間點(diǎn),AICAR組大鼠的PTWL短于PHN組(P<0.05);PHN組和AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后3～7 d各時(shí)間點(diǎn)的PTWL長(zhǎng)于注射樹脂毒素前1 d和注射樹脂毒素后1 d的PTWL,但AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后9～15 d各時(shí)間點(diǎn)的PTWL短于注射樹脂毒素后3～7 d各時(shí)間點(diǎn)的PTWL(P<0.05),見表2。

表2 在不同時(shí)間3組大鼠的PTWL比較(x±s,s)

2.3 3組大鼠脊髓組織凋亡細(xì)胞數(shù)的比較 與對(duì)照組比較,PHN組和AICAR組大鼠的脊髓組織凋亡細(xì)胞數(shù)增加;與PHN組比較,AICAR組凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),見圖1、表3。

表3 3組大鼠脊髓組織凋亡細(xì)胞數(shù)的比較(x±s,個(gè))

圖1 3組大鼠脊髓組織的細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×40)

2.4 3組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值、p-MTOR/MTOR值及Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)量的比較 與對(duì)照組比較,PHN組和AICAR組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值降低,p-MTOR/MTOR值和Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)量增加;與PHN組比較,AICAR組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值和Bcl-2的蛋白表達(dá)量增加,p-MTOR/MTOR值和Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)量降低(P<0.05),見圖2和表4。

圖2 3組大鼠脊髓組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況的條帶圖

表4 3組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值、p-MTOR/MTOR值及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

脊髓神經(jīng)元凋亡是神經(jīng)病理性疼痛的重要致病機(jī)制。既往研究表明,PHN小鼠脊髓組織的過度自噬導(dǎo)致γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的凋亡[3];脈沖射頻可通過減少脊髓神經(jīng)元凋亡,減輕坐骨神經(jīng)分支損傷模型大鼠的疼痛程度[4]。這提示深入了解脊髓神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制對(duì)解釋神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。為此,本研究使用樹脂毒素誘導(dǎo)建立PHN大鼠模型,以探討神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,在腹腔注射樹脂毒素后3 d,大鼠的PMWT降低,PTWL延長(zhǎng),與PHN患者機(jī)械疼痛敏化、熱痛缺失的臨床特征一致,說明成功構(gòu)建PHN大鼠模型。

研究表明,外周神經(jīng)損傷后,疼痛刺激持續(xù)性傳入使脊髓背角神經(jīng)元的敏感性增加,表現(xiàn)為過度興奮及傷害性神經(jīng)元的可塑性改變[12]。此外,MTOR信號(hào)通路參與神經(jīng)病理性疼痛中的脊髓背角突觸可塑性調(diào)節(jié),是神經(jīng)源性疼痛時(shí)程增長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[13]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,MTORC1)由3種成分組成,分別為MTOR、Raptor和mLST8,與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理變化相關(guān),其中MTOR是其關(guān)鍵核心成分[14]。研究表明,p-MTOR可通過蛋白激酶B等信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[15]。同時(shí),MTOR在急性疼痛大鼠模型脊髓背角淺表層中表達(dá),這與傷害性疼痛信號(hào)傳入定位一致[16]。而采用雷帕霉素抑制MTOR的磷酸化后,慢性疼痛超敏反應(yīng)的啟動(dòng)、建立和維持均受到抑制[17]。因此,MTOR介導(dǎo)的脊髓背角組織神經(jīng)元凋亡可能是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide,CGRP)是C類神經(jīng)纖維的主要神經(jīng)遞質(zhì),通過下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的AMPK表達(dá)而使機(jī)體對(duì)神經(jīng)性疼痛的敏感性增加[18]。研究表明,敲除AMPK可使小鼠出現(xiàn)痛覺過敏行為,使用AMPK激活劑后可以顯著緩解神經(jīng)病理性疼痛中背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元的電興奮性[19]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在采用白藜蘆醇激活A(yù)MPK后,背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角組織中神經(jīng)元MTORC1信號(hào)傳導(dǎo)受阻,切口損傷引起的機(jī)械性超敏反應(yīng)也降低[20],這表明AMPK和MTOR是治療神經(jīng)病理性疼痛的潛在新靶點(diǎn)。本研究中,PHN大鼠出現(xiàn)機(jī)械疼痛敏化和熱痛缺失,脊髓組織凋亡細(xì)胞數(shù)增加,且AMPK磷酸化水平降低,MTOR的磷酸化水平增加,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)上調(diào);而采用AICAR激活A(yù)MPK后,PHN大鼠的機(jī)械疼痛敏化和熱疼痛缺失均得到改善,脊髓組織凋亡細(xì)胞數(shù)減少,且AMPK磷酸化水平升高、MTOR磷酸化水平降低,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá)受到抑制,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增加。因此,推測(cè)AMPK/MTOR信號(hào)通路可能參與PHN大鼠脊髓背角組織神經(jīng)元凋亡的過程,激活脊髓背角組織AMPK的表達(dá)或?qū)⒊蔀橹委熒窠?jīng)病理性疼痛的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述,刺激AMPK發(fā)生磷酸化后,PHN大鼠的機(jī)械疼痛敏化和熱疼痛缺失得到改善,脊髓組織MTOR磷酸化水平降低、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡受到抑制,AMPK/MTOR信號(hào)通路可能參與PHN大鼠脊髓背角組織神經(jīng)元凋亡的過程。本研究結(jié)果為PHN中的脊髓神經(jīng)元凋亡機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)研究提供了新思路。但本研究?jī)H使用了AMPK的激活劑,未分別使用AMPK抑制劑、MTOR激活劑與抑制劑進(jìn)一步觀察其對(duì)PHN大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響,今后將完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以深入研究相關(guān)機(jī)制。