苗銀萍 趙光升 趙林萍 李 寧 付燕峰

（1.鄭州中道生物技術有限公司， 鄭州 450000； 2.國家市場監(jiān)管重點實驗室 （食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術）， 鄭州 450000； 3.河南省食品和鹽業(yè)檢驗技術研究院， 鄭州 450000）

嘔吐毒素（Vomitoxin）， 又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol， DON）， 是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生的次級代謝產物， 屬單端孢霉烯化合物。 20 世紀70 年代， DON 被YOSHIZAWA 和MOROOKA[1]在受鐮刀菌污染的小麥及禾谷類食物中首次發(fā)現并鑒定。 DON 主要污染谷物類食品，如小麥、 大麥、 玉米及其副產物等， 嚴重影響谷物類食品的品質和安全， 也對人類身體健康造成極大的威脅[2]。 聯合國糧食及農業(yè)組織 （Food and Agriculture Organization of the United Nations， FAO） 和世界衛(wèi)生組織 （World Health Organization， WHO）已經把DON 定為自然產生的最危險的食品污染物，同時也被國際癌癥研究機構認定為3 級致癌物[3～5]。

攝入DON 污染的食物會引起急性胃腸道疾病， 如產生厭食、 嘔吐、 發(fā)燒、 腹瀉和反應遲鈍等癥狀， 嚴重時可導致免疫功能受損、 組織壞死、 內臟出血， 甚至死亡[6]。 DON 污染貫穿于谷物生長、儲運和加工過程中， 在全球范圍內廣泛存在， 因此人們對所食用的小麥等谷物產品的要求越來越嚴格， 目前世界上至少有40 個國家 （地區(qū)） 和組織制定了DON 的限量標準[7]。 其中， 歐盟將未加工的小麥等谷物中DON 的限量值定為1 250～1 750 μg/kg， 對以小麥、 玉米等為原料制成的供人直接食用的面粉、 粗粉或麥片中DON 的限量要求更為嚴格， 限量值定為750 μg/kg； 國際食品法典委員會 （Codex Alimentarius Commission， CAC）將小麥等原糧中DON 的限量值定為2 000 μg/kg， 將小麥等原料制成的面粉、 粗粉或麥片等成品糧中DON的限量值定為1 000 μg/kg[8～10]。 而在我國飲食習慣中， 谷物產品所占日常飲食的比重遠遠高于西方國家， 因此更需要嚴格控制谷物產品中DON 含量。目前， 我國現行標準GB 2761-2017 《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[11]規(guī)定小麥等谷物及其制品中DON 含量不得超過1 000 μg/kg。

目前， 嘔吐毒素的檢測方法較多， 有薄層色譜法、 高效液相色譜法、 氣相色譜法、 氣相色譜-質譜聯用法、 酶聯免疫檢測法、 膠體金免疫層析法、熒光免疫層析法[12～14]。 其中， 熒光免疫層析法是超微量檢測領域一項新興的檢測技術， 是在抗原抗體的特異性反應基礎上建立的一類微量物質檢測技術。 該檢測法是以3 價稀土離子Eu（Ⅲ）、Tb（Ⅲ）、Sm（Ⅲ）等為標志物[15]， 這些離子具有熒光強度高、熒光壽命長、 斯托克斯位移大和信號峰尖銳等特點。 本研究基于熒光免疫層析法， 采用嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡對不同谷物產品樣本進行定量檢測， 從靈敏度、 特異性、 重復性及準確度方面對檢測卡進行性能評價， 并與大型儀器確證方法檢測結果進行比對分析， 為該檢測卡的應用提供理論依據和技術參考。

一、 材料與方法

（一） 試劑與耗材CN140 型硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membrane， NC 膜， 德國賽多利斯集團）； 時間分辨熒光微球 （粒徑200 nm， 固含1%， 含-COOH， 蘇州為度生物技術有限公司）；DON 標準品（100 μg/mL， 純度≥99%， 青島普瑞邦生物工程有限公司）； 兔抗DNP 多抗（洛陽昊華生物技術有限公司）； DON 單克隆抗體、 DONBSA 抗原 （實驗室自制）； RB45 型結合墊、 CH37型吸水紙（上海金標生物科技有限公司）； GL-b04樣本墊、 DB-4 型聚氯乙烯底板（上海杰一生物技術有限公司）； 實驗用水均為Milli-Q 超純水。 其他試劑均為國產分析純。 面粉、 玉米面、 大米等谷物樣本購買于超市。

（二） 主要儀器LC-LX-HLR210D 型高速冷凍離心機（力辰儀器科技有限公司）； JY96-IIN 型超聲儀 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；HM3030 型三維劃膜噴金儀（上海金標生物科技有限公司）； CTS300 型數控裁條機 （上海金標生物科技有限公司）； ZQ200 型自動斬切機 （上海金標生物科技有限公司）； XW-80A 型垂直混勻儀（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）； ZD-001 型干式熒光免疫分析儀（鄭州中道生物技術有限公司）。

（三） 實驗方法

1.DON 單抗的熒光微球標記。 準確移取100 μL 超聲后的納米微球至2 mL 離心管內， 加入900 μL 超純水振蕩混勻， 超聲3 min。 依次加入30 μL碳二亞胺溶液和30 μLN-羧基琥珀酰亞胺溶液，振蕩混勻后在垂直混勻儀上活化20 min。 活化結束后， 以15 000 r/min 離心20 min， 棄去上清液留底部沉淀， 加入900 μL 超純水， 超聲3 min。 在超聲后的微球懸濁液中加入0.1 mg DON 單抗， 繼續(xù)在垂直混勻儀上過夜反應， 加入100 μL 微球封閉液，混勻， 在垂直混勻儀上封閉1 h。 再以15 000 r/min離心20 min， 棄去上清液， 加入900 μL 微球復溶液進行超聲備用。

2.熒光免疫層析檢測卡的組裝。 選取最佳濃度包被抗原、 兔抗DNP 多抗的NC 膜， 以及最佳濃度的熒光抗體標記物噴涂的結合墊。 以聚氯乙烯膠粘板為底板， 依次將NC 膜、 結合墊、 樣本墊和吸水紙粘貼在底板， 相鄰組分間重疊1～2 mm。 使用數控裁條機裁成4 mm 寬， 裝入卡殼， 即為嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡， 封袋置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

3.樣本前處理。 分別稱取2 g 面粉、 玉米面和大米樣本于50 mL 離心管內， 每個樣本3 個平行。加入70%甲醇水， 振蕩5 min， 以6 000 r/min 離心5 min。 取上清液100 μL， 再加入300 μL PBS 緩沖液， 混勻， 該液體即為待檢樣本溶液。

4.定量分析方法。 將制備好的嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡拆封平衡至室溫， 吸取80 μL 上述待檢樣本溶液進行滴卡。 反應15 min 后用熒光免疫分析儀檢測并讀取樣本濃度值。

（四） 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的性能評價

1.靈敏度。 分別選擇20 份空白面粉、 玉米面、大米樣本進行檢測， 以檢測結果的平均值 （） 加3 倍的標準差 （s） 為檢出限， 以檢測結果的平均值（） 加10 倍的標準差（s） 為定量限[16]。

2.批內準確度和重復性。 選取空白面粉、 玉米面、 大米樣本進行加標回收實驗， 使DON 在面粉、 玉米面、 大米樣本中的最終含量為0.5、 1.0、2.0 mg/kg。 用同一批次的嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡進行檢測， 每個樣本重復5 次， 計算加標回收率和批內變異系數。

3.批間準確度和重復性。 選取空白面粉樣本，進行加標回收率實驗， 使樣本中DON 最終含量為0.5、 1.0、 2.0 mg/kg。 用3 個不同批次的嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡進行檢測， 每批次檢測卡進行6 次重復實驗， 計算加標回收率和批間變異系數。

4.特異性評價。 為考察嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的特異性， 避免發(fā)生交叉反應， 保證檢測結果的準確， 分別將其他常見的5 種真菌毒素標準品（玉米赤霉烯酮、 黃曲霉毒素B1、 赭曲霉毒素A、伏馬毒素、 T-2 毒素） 添加在空白面粉樣本中，加標濃度為1 000 μg/kg， 每個樣本做3 個平行。然后按照上述檢測方法進行檢測， 計算不同種類毒素的交叉反應率［計算方法見公式（1）］[16]， 交叉反應率越小， 表明檢測卡特異性越好。

公式（1） 中， CR為交叉反應率；C0為樣本加標濃度；C1為樣本檢測濃度。

5.與免疫親和層析凈化高效液相色譜法檢測結果比對。 在市場選取面粉、 玉米面、 大米和小米各3 份不同批次的盲樣， 采用GB 5009.111-2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》[17]第二法 （免疫親和層析凈化高效液相色譜法）進行檢測。 取粉碎過篩樣品25 g， 加入5.0 g 聚乙二醇和100 mL 水， 振蕩提取20 min， 以6 000 r/min 離心10 min 取上清，再以10 000 r/min 離心5 min 取上清過免疫親和柱，流速為1～2 滴/s， 再洗脫， 洗脫液氮吹、 溶解后檢測。 同時采用本研究制備的嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡檢測， 將兩種方法的檢測結果進行比對分析。

二、 結果與分析

（一） 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的檢出限和定量限使用嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡對20 份空白面粉、 玉米面和大米樣本進行檢測， 結果見表1。 結果顯示， DON 在面粉、 玉米面和大米樣本中的檢出限分別為18.89、 19.65、 21.39 μg/kg， 定量限分別為20.09、 20.77、 24.12 μg/kg。

表1 DON 在不同基質中的檢出限及定量限（n＝20）

（二） 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的準確度和重復性根據國家限量標準以及本檢測卡方法的線性范圍， 選擇在空白面粉、 玉米面和大米中添加低、 中、 高濃度的標準品做加標回收率實驗， 實驗結果見表2。 由表2 可知， DON 在面粉樣本中的批內回收率為89.65%～105.94%， 批內變異系數為3.45%～9.96%； DON 在玉米面樣本中的批內回收率為93.06%～100.05%， 批內變異系數為1.07%～3.33%； DON 在大米樣本中的批內回收率為94.37%～99.68%， 批內變異系數為1.75%～4.42%。 這說明檢測卡在不同樣本檢測中具有較好的批內準確度和重復性。

表2 批內添加回收實驗結果（n＝5）

用不同批次的嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡對面粉樣本進行批間準確度和重復性評價， 結果見表3。 由表3 可知， 批間回收率在90.67%～101.64%，批間變異系數為4.94%～9.45%， 說明該檢測方法具有良好的批間準確度和重復性。

表3 批間準確度和重復性實驗結果（n＝6）

（三） 與免疫親和層析凈化高效液相色譜法檢測結果比對選取面粉、 玉米面、 大米和小米各3份不同批次盲樣， 分別采用嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡和免疫親和層析凈化高效液相色譜法進行檢測， 結果見表4。 由表4 可知， 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡和免疫親和層析凈化高效液相色譜法檢測結果差別不大， 兩者相對誤差≤16.28%， 說明兩種方法有良好的一致性， 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡可滿足谷物產品中DON 快速檢測的要求。

表4 兩種方法檢測DON 結果對比

（四） 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的特異性特異性評價結果表明， 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡與5 種常見的真菌毒素（玉米赤霉烯酮、 黃曲霉毒素B1、 赭曲霉毒素A、 伏馬毒素、 T-2 毒素） 的交叉反應率均小于0.26%（見表5）， 無明顯交叉反應， 表明嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的特異性良好。

表5 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡的特異性評價 （n＝3）

三、 結論

本研究從靈敏度、 準確度及重復性、 特異性等方面對嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡進行了性能評價， 結果顯示， 該檢測卡檢測面粉、 玉米面、 大米3 種谷物產品中DON 的檢出限分別為18.89、19.65、 21.39 μg/kg， 定量限分別為20.09、 20.77、24.12 μg/kg； 批內回收率為89.65%～105.94%，批間回收率為90.67%～101.64%， 批內與批間變異系數均小于10%； 與玉米赤霉烯酮、 黃曲霉毒素B1、 赭曲霉毒素A、 伏馬毒素、 T-2 毒素的交叉反應率分別為0.26%、 0.15%、 0.05%、 0.01%、0.09%， 特異性良好。 本研究還選取了不同基質的樣本進行檢測卡與標準方法檢測的對比驗證， 結果表明， 檢測卡與標準方法檢測結果有良好的一致性。 該檢測卡的準確度與精密度均滿足適用要求，且具有簡便、 快速、 經濟、 時效性等特點， 適用于谷物產品中DON 的快速檢測。 此外， 與傳統(tǒng)膠體金免疫層析檢測技術相比[18]， 嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡以鑭系元素離子螯合物為標記物， 可以在較大程度上避免激發(fā)光和背景熒光信號的干擾， 表現出極高的靈敏度。 同時， 熒光標記結合物分散性較好， 檢測卡的重復性好， 有利于準確性定量檢測。 但是， 嘔吐毒素熒光免疫層析定量檢測卡還存在一些尚需解決優(yōu)化的問題， 如微球抗體標記物沉聚、 檢測產品成本高等問題， 其發(fā)展還任重道遠。

本文引用格式： 苗銀萍， 趙光升， 趙林萍， 等.嘔吐毒素熒光免疫層析檢測卡在谷物產品快速檢測中的應用 ［J］.農產品質量與安全， 2023 （5）： 74-78.

MIAOYinping， ZHAOGuangsheng， ZHAOLinping，et al.Application of fluorescence immunochromatographic detection card for vomitoxin in rapid detection of grain products［J］.Quality and Safety of Agroproducts， 2023 （5）： 74-78.