張 晶

（福建省農產品質量安全檢驗檢測中心， 福州 350003）

鹽酸多西環(huán)素是四環(huán)素類抗生素， 主要用于治療生豬感染革蘭氏陽性菌和陰性菌引起的消化道疾病、 支原體引起的呼吸道疾病[1]； 氟苯尼考為酰胺醇類抗生素， 用于敏感細菌所致的豬細菌性疾病，對呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染治療效果好[2]。 兩種藥物均為廣譜抗菌藥， 在生豬養(yǎng)殖中廣泛應用。 經調查， 每生產1 t 生豬 （毛重）， 抗菌藥的使用量為35.7～448.98 g[3]， 其中多西環(huán)素和氟苯尼考使用量約占22%和15%。 這些抗菌藥大多不能被動物完全吸收， 部分以母體或代謝物的形式排出動物體外[4]。 由于使用多西環(huán)素、 氟苯尼考藥物， 在尿液中會存在多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留， 鑒于畜禽養(yǎng)殖時限長， 這些藥物殘留會隨養(yǎng)殖廢水排泄到土壤之中， 在農田土壤和其他環(huán)境中積累， 后續(xù)通過食物鏈危害人類健康[5～6]。 因此，研究建立檢測尿液中多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留分析方法， 以及開展殘留消除研究具有很強的現實意義。

QuEChERS 是由ANASTASSIADES 教授等于2003 年開發(fā)的前處理技術， 已廣泛應用于農藥殘留測定。 Cleanert MAS-Q 凈化管是基于QuECh-ERS 開發(fā)的樣品快速處理產品， 已成功應用于尿液中的獸藥殘留檢測[7～9]。 由于目前還沒有對豬尿中多西環(huán)素和氟苯尼考同時檢測的國家和行業(yè)標準，本研究擬利用Cleanert MAS-Q 凈化管凈化， 液相色譜串聯四極桿質譜檢測， 建立同步檢測豬尿中多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺的快速檢測方法，并將建立的方法應用于豬尿中多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留消除規(guī)律的研究， 旨在為豬肉產品中多西環(huán)素、 氟苯尼考的殘留監(jiān)控提供技術支持。

一、 材料與方法

（一） 主要儀器與試劑儀器： 超高效液相色譜串聯質譜儀 （TQ-S MS/MS， 美國Waters 公司）； 電子天平 （AX105， 瑞士梅特勒-托利多集團）； 高速冷凍離心機（1-15K， 美國Sigma 公司）。

試劑耗材： 鹽酸多西環(huán)素 （含量≥98.4%）、氟苯尼考 （含量≥99.6%）、 氟苯尼考胺 （含量≥99.3%）［曼哈格 （上海） 生物科技有限公司］； 甲酸（色譜純， 上海麥克林生化科技股份有限公司）；乙腈（色譜純， 美國Supelco 公司）； 水 （一級水，Milli-Q 超純水儀）； 尼龍濾膜 （0.22 μm， 天津市津騰實驗設備有限公司）； Cleanert MAS-Q 凈化管（2 mL， 天津博納艾杰爾科技有限公司）。 獸用50%鹽酸多西環(huán)素可溶性粉（三明三藥獸藥有限公司， 批號： 220501） 和獸用20%氟苯尼考粉 （三明三藥獸藥有限公司， 批號： 220528）。

實驗用豬由福建省嘉祥現代農業(yè)發(fā)展有限公司提供并喂養(yǎng) （ 動物防疫條件合格證號：350403101150001）。 豬尿樣品采集于開展給藥實驗的獨立養(yǎng)殖場。

（二） 給藥實驗設計隨機選取一個月后可出欄的健康生豬30 頭， 分成兩組， 空白對照組10頭， 實驗動物組20 頭。 準確稱量其體重， 空白對照組體重與對照組相比差別不超過20%。 參考實際養(yǎng)殖過程中用藥方法， 實驗動物組按照2017 年版 《獸藥質量標準 （化學藥品卷）》 和2020 年版《中華人民共和國獸藥典》（一部） 規(guī)定給藥。 20%氟苯尼考粉給藥量為20 mg/kg bw， 拌飼喂服， 一日2 次； 50%鹽酸多西環(huán)素， 每1 L 飲水中加入100 mg， 混飲。 連續(xù)給藥5 d， 空白對照組不給藥。

（三） 抽樣頻次及數量從給藥前1 d 開始，每天接取空白對照組和實驗組的每頭生豬的晨尿100～200 mL， 混勻， 按每頭生豬尿樣封裝后， 貼上標簽， 冷凍保存。 停藥后， 每2 d 接取晨尿1次， 重復收集樣品至停藥后第23 d。

（四） 標準溶液的配置稱取多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺10.00 mg （精確至0.01 mg） 標準品， 分別置于10 mL 棕色容量瓶中， 用甲醇定容至刻度， 得到濃度為1 mg/mL 標準儲備液。 再將標準儲備液逐級稀釋， 配成濃度為100 μg/mL 的標準工作液。 臨用前經樣品前處理的空白提取液稀釋成多西環(huán)素濃度為1、 2、 10、 50、 200、 1 000、2500 μg/L， 氟苯尼考濃度為0.5、 1、 20、 100、 1000、2 000、 4 000 μg/L， 氟苯尼考胺濃度為0.5、 1、20、 100、 200、 500、 1 000 μg/L 的基質匹配混合標準工作溶液。

（五） 實驗方法

1.色譜和質譜條件。 色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）， 柱溫為40℃； 進樣量為2 μL。 液相和質譜參數見表1 和表2。

表1 流動相梯度條件

表2 多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物的質譜條件

質譜采用電子噴霧離子源， 正負離子切換， 多西環(huán)素和氟苯尼考胺采用正離子模式， 氟苯尼考采用負離子模式； 毛細管溫度為510℃， 噴霧電壓為1kV； 脫溶劑氣為高純氮氣， 碰撞氣為高純氬氣。

2.樣品前處理。 準確量取2.00 mL 豬尿于50 mL 離心管內， 加入80%乙腈水溶液8.0 mL， 渦旋1 min， 高速振蕩提取5 min， 以10 000 r/min 離心10 min。 取上清液1.0 mL 至Cleanert MAS-Q 凈化管中， 渦旋振蕩1 min， 以8 000 r/min 離心5 min。取上清液0.5 mL， 加入0.1%甲酸水0.5 mL， 混勻， 過0.22 μm 微孔濾膜后， 供超高效液相色譜串聯質譜儀測定。

二、 結果與分析

（一） 色譜和質譜條件的優(yōu)化采用在正、 負離子模式下連續(xù)進樣方式分別對混合標準溶液進行母離子全掃， 優(yōu)化錐孔電壓， 確定其分子離子。 以確定的離子為母離子， 并對其子離子進行全掃描，選擇豐度高、 干擾較小的兩對子離子為定性、 定量離子， 其中豐度最高的作為定量離子， 對離子源溫度、 碰撞氣、 噴霧電壓、 碰撞能量和錐孔電壓等質譜參數進行優(yōu)化。 多西環(huán)素和氟苯尼考胺在正離子模式響應最高， 因此采用正離子模式； 氟苯尼考在負離子模式響應最高， 故采用負離子模式。 3 種化合物在5 min 內能夠與干擾雜質充分分離， 即可實現快速分離檢測， 能有效降低基質效應的影響， 定量結果準確可靠（見圖1）。

圖1 多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺標準溶液特征離子質量色譜圖

（二） 樣品前處理條件的優(yōu)化按GB 31650-2019 《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》 要求， 多西環(huán)素殘留量以多西環(huán)素為主、 氟苯尼考殘留量以氟苯尼考和氟苯尼考胺之和計。 因此， 本研究沒有考慮其他代謝物情況。 尿液常用提取劑有乙腈、 三氯甲烷和乙酸乙酯等， 本研究對比了這3 種提取條件對多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺回收率的影響， 結果見圖2。 結果表明， 乙腈和三氯甲烷由于極性很強， 得到較多的基體雜質，加標回收率相對較低， 影響后續(xù)的凈化與分析； 而乙酸乙酯效果最好， 不但回收率高， 雜質干擾也較少。 同時用固相萃取法和Cleanert MAS-Q 凈化管分別對樣品進行凈化實驗， 結果發(fā)現， MAS-Q 凈化管凈化效果好， 對樣品回收率相對較高， 雖然兩種方式均能起到較好的凈化作用， 但固相萃取法操作較為繁瑣。 因此， 采用Cleanert MAS-Q 凈化管凈化提取。

圖2 不同提取凈化條件下多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺回收率對比

（三） 方法學考察

1.線性方程、 檢出限和定量限。 取空白樣品進行前處理后， 配置工作曲線溶液， 以定量離子色譜峰面積與基質混合標準溶液的濃度作標準曲線，結果見表3。 結果顯示， 多西環(huán)素在1～2 500 μg/L、 氟苯尼考在0.5～4 000 μg/L、 氟苯尼考胺在0.5～1 000 μg/L 濃度范圍內呈良好線性關系， 相關系數均大于0.995。 按GB/T 27404-2008 《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[10]， 以離子色譜峰的3 倍信噪比 （S/N） 為檢出限 （LOD）， 10 倍S/N 為定量限 （LOQ）， 得到多西環(huán)素、 氟苯尼考及氟苯尼考胺的LOD 分別為2.7、 1.3、 1.3 μg/L，LOQ 分別為8.0、 4.0、 4.0 μg/L （見表3）。

表3 多西環(huán)素、 氟苯尼考和氟苯尼考胺線性方程、檢出限和定量限

2.回收率和精密度。 稱取空白樣品， 添加適量的多西環(huán)素、 氟苯尼考及氟苯尼考胺標準溶液制備添加水平為40、 800、 8 000 μg/L 的豬尿樣品， 每個添加水平制備18 份樣品， 按本研究建立的方法，每天測定6 份， 連續(xù)測定3 d， 計算其批內和批間回收率與相對標準偏差 （RSD）， 結果見表4。 結果顯示， 本方法平均回收率在72.5%～114.0%之間， 批內和批間相對標準偏差均小于15%， 滿足尿樣中獸藥殘留分析要求。

表4 回收率和精密度實驗結果

（四） 豬尿中多西環(huán)素和氟苯尼考殘留消除規(guī)律利用本研究建立的方法， 對給藥實驗后采集的豬尿樣品進行檢測， 并開展殘留消除規(guī)律研究。 豬尿樣品自然解凍后， 進行提取、 凈化、 濃縮和測定， 將測得的峰面積代入標準曲線， 計算豬尿中多西環(huán)素和氟苯尼考及其代謝物的殘留濃度， 繪制每組藥物平均濃度-時間代謝曲線 （見圖3）。 空白對照組樣品中均未檢出多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物殘留， 說明在養(yǎng)殖和樣品處理各環(huán)節(jié)均無交叉污染和飼料污染。

圖3 多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物在豬尿中的殘留消除情況

1.多西環(huán)素在豬尿中的消除規(guī)律。 經測定得出， 按正常劑量給藥期間， 尿液中多西環(huán)素殘留量逐漸上升， 在第5d 達到峰值， 平均殘留量為20 351 μg/L。 隨后， 停止藥物使用， 豬尿中多西環(huán)素殘留量快速降低， 第10 d 后降低趨勢隨時間變緩， 在第22 d 平均殘留量為7.28 μg/L， 第24 d （停藥后第19 d） 的檢測結果低于檢出限， 殘留消除。

2.氟苯尼考在豬尿中的消除規(guī)律。 經測定得出， 按正常劑量給藥后， 氟苯尼考（以氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺之和計， 下同） 在尿液中逐漸上升， 在第6 d 達到峰值， 平均殘留量為39 622 μg/L。 隨后豬尿中氟苯尼考殘留量快速降低， 在第16 d 平均殘留量為9.49 μg/L， 第18 d （停藥后第13 d） 的檢測結果低于檢出限， 殘留消除。

三、 結論

本研究基于LC-MS/MS， 結合QuEChERS 法建立了快速檢測豬尿中多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的測定方法。 該方法準確穩(wěn)定、 檢測靈敏度高， 多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的檢出限分別為2.7、 1.3、 1.3 μg/L， 定量限分別為8.0、 4.0、 4.0 μg/L； 在40、 800、 8 000 μg/L的添加水平下， 平均回收率為72.5%～114.0%，批內和批間相對標準偏差均小于15%， 能滿足豬尿中相應獸藥殘留檢測的要求， 適用于豬尿中多西環(huán)素、 氟苯尼考及其代謝物的快速定性確證。 此外，應用本研究建立的方法， 初步研究了多西環(huán)素、 氟苯尼考在豬尿中殘留消除情況， 發(fā)現多西環(huán)素在豬尿中的消除時間為19 d； 氟苯尼考（以氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺之和計） 的消除時間為13 d。

本文引用格式： 張晶.豬尿中多西環(huán)素、 氟苯尼考和其代謝物氟苯尼考胺殘留的快速檢測方法及消除規(guī)律研究 ［J］.農產品質量與安全， 2023 （5）：61-64.

ZHANG Jing.Study on the rapid detection method and elimination of doxycycline， flufenicol and its metabolite florfenicol amine residues in pig urine ［J］.Quality and Safety of Agro-products， 2023 （5）： 61-64.