高猛峰 張維誼 梅 博 童金蓉 沈斯文 王 霞 宋宇迎 豐東升

（上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心 （上海）， 上海 201708）

擬除蟲菊酯是從菊花中提取的天然除蟲菊酯的合成衍生物， 由菊花酸酯及其酸和醇的鹵化衍生物組成[1]， 具有高效、 低毒、 穩(wěn)定等特點(diǎn)， 已經(jīng)發(fā)展為繼有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑后全球應(yīng)用較廣的第3 大類殺蟲劑。 目前， 已經(jīng)開發(fā)出70 多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥， 主要包括氯氰菊酯、 溴氰菊酯、氯氟氰菊酯、 聯(lián)苯菊酯等， 適用于蔬菜、 水果等農(nóng)產(chǎn)品害蟲防治[2～3]。 相關(guān)研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有蓄積性[4]， 長期接觸會引發(fā)神經(jīng)毒性、 生殖發(fā)育毒性等疾病[5～9]， 農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)環(huán)境中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留問題日趨嚴(yán)重， 存在較大潛在危害。2021 年， 我國頒布實(shí)施的GB 2763-2021 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》 對蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留限量值進(jìn)行了嚴(yán)格限定， 限量值范圍在0.01～10 mg/kg 不等， 其中大多數(shù)葉菜類蔬菜和蕓薹屬類蔬菜中的限量值在0.5 mg/kg 以上， 少部分茄果類蔬菜和瓜類蔬菜中的限量值在0.05～0.2 mg/kg 之間， 一些根莖類和薯芋類蔬菜中的限量值則低至0.01 mg/kg。 因此， 有必要建立簡單、 快速、 高效的蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測分析方法， 以有效保障農(nóng)產(chǎn)品食用安全和人類健康。

高效薄層色譜 （High performance thin layer chromatography， HPTLC） 是一種特殊的液相色譜， 其利用物質(zhì)在同一吸附劑上吸附能力差異來進(jìn)行分離， 根據(jù)目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)品用同一方法所得色譜的斑點(diǎn)比移（Rf） 值進(jìn)行定性分析， 根據(jù)斑點(diǎn)的灰度進(jìn)行定量分析。 該方法具有前處理簡單、 可實(shí)現(xiàn)高通量分析、 成本低等優(yōu)點(diǎn)[10]。 目前HPTLC 已經(jīng)形成了標(biāo)準(zhǔn)化儀器操作平臺， 可以實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)化或全自動(dòng)化， 進(jìn)一步拓寬了應(yīng)用范圍， 被廣泛地應(yīng)用于食品中農(nóng)藥和獸藥殘留的檢測分析中[11～14]， 如陳啟飛[13]成功將HPTLC 應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品中的獸藥殘留檢測； YUE 等[14]將HPTLC 應(yīng)用在茶葉中有機(jī)磷農(nóng)藥檢測分析中， 研究結(jié)果驗(yàn)證了HPTLC 在大批量農(nóng)產(chǎn)品樣品檢測中的準(zhǔn)確性和適用性。QuEChERS 是一種簡單、 經(jīng)濟(jì)、 快速、 準(zhǔn)確、 高效的樣品前處理技術(shù)， 被廣泛應(yīng)用于蔬菜、 水果等基質(zhì)的農(nóng)藥殘留分析中[15～17]。 本研究擬采用改良的一步式QuEChERS 前處理技術(shù)結(jié)合高效薄層色譜法，建立蔬菜樣品中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的快速檢測方法。

一、 材料與方法

（一） 材料、 試劑與儀器大白菜、 番茄、 西葫蘆、 青菜、 空心菜、 結(jié)球甘藍(lán)等蔬菜樣品購于上海市農(nóng)貿(mào)市場。

10 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品： 甲氰菊酯、 氟胺氰菊酯、氰戊菊酯、 氯氟氰菊酯、 氯氰菊酯、 氟氰戊菊酯、溴氰菊酯、 氯菊酯、 聯(lián)苯菊酯、 氟氯氰菊酯（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。 乙腈、 石油醚（60～90℃）、三氯甲烷、 環(huán)己烷、 丙酮 （德國Merck 公司），QuEChERS 提取鹽包 （4 g 無水MgSO4、 1 g NaCl、1 g 檸檬酸鈉和0.5 g 檸檬酸氫二鈉） 和快速濾過型mPFC 凈化柱（北京科德諾思技術(shù)有限公司）。

高效薄層板、 毛細(xì)管、 層析缸、 BC-D1 高效農(nóng)藥殘留速測儀、 NS-D1 濃縮儀 （上海瑞鑫科技儀器有限公司）， Milli-Q 超純水機(jī) （美國Millipore 公司）， 百分之一天平 （上海梅特勒集團(tuán)有限公司）。

（二） 實(shí)驗(yàn)方法

1.樣品前處理。 稱取10 g 均質(zhì)試樣 （精確至0.01 g） 于50 mL 塑料離心管中， 加入20 mL 乙腈，振搖1 min 后用濾紙過濾， 收集濾液， 向?yàn)V液中加入QuEChERS 提取鹽包， 劇烈振蕩1 min 后靜置3 min。 吸取1.5 mL 上清液經(jīng)mPFC 凈化柱一次凈化，準(zhǔn)確吸取1.0 mL 凈化液至2.0 mL 離心管中， 后進(jìn)行濃縮至干， 加入75 μL 石油醚（60～90℃） 復(fù)溶。

2.高效薄層色譜成像分析。 在層析缸中加入適量展開劑， 用定量毛細(xì)管分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品處理溶液， 在薄層板基線處的固定位置上點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)至少間隔0.7 cm， 單塊板最多可點(diǎn)6 個(gè)點(diǎn)。點(diǎn)樣結(jié)束時(shí)用電吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹2 min， 然后將該薄層板放入層析缸中展開， 當(dāng)展開劑到達(dá)溶劑前沿線時(shí)， 將薄層板取出并晾干。 將完成展開的薄層板放入顯色儀中， 顯色10 min 后取出， 放入成像分析儀中分析。

3.定性與定量分析。 成像分析儀中內(nèi)設(shè)兩種參比標(biāo)樣物質(zhì)， 分別為20 μg/mL 氰戊菊酯和溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。 根據(jù)參比標(biāo)樣和樣品中各組分經(jīng)兩種展開劑處理后相對移動(dòng)位置各不相同的特性， 同一樣品經(jīng)展開劑1 和展開劑2 分別展開， 進(jìn)行二次分析來提高定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。 通過軟件自動(dòng)掃描， 得到樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥斑點(diǎn)的Rf值和灰度積分值。 根據(jù)目標(biāo)物與參照物用同一方法所得色譜斑點(diǎn)的Rf值進(jìn)行定性分析， 根據(jù)圖譜斑點(diǎn)的灰度積分值進(jìn)行定量分析。 一次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)檢測兩種不同的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥按表1 分成5 組， 用石油醚分別配成0.5、 0.8、 1.2、1.5、 2.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 分析軟件將薄層板分為6 通道， 用毛細(xì)管吸取標(biāo)準(zhǔn)品分別點(diǎn)板， 0～1 號通道為標(biāo)準(zhǔn)對照， 2～5 通道分別為不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 通過展開劑1 和展開劑2 展開后成像分析。

5.樣品制備。 選用6 種具有代表性的蔬菜（包括簡單基質(zhì)大白菜、 番茄、 西葫蘆， 復(fù)雜基質(zhì)青菜、 空心菜、 結(jié)球甘藍(lán)） 作為樣品空白基質(zhì)， 通過空白基質(zhì)加標(biāo)分別制備陰性樣品和陽性樣品。 （1）陰性樣品制備。 陰性樣品由36 個(gè)加標(biāo)樣品組成，每種蔬菜稱取6 個(gè)平行樣， 添加濃度為0.25 mg/kg。 （2） 陽性樣品制備。 陽性樣品由72 個(gè)加標(biāo)樣品組成， 每種蔬菜稱取12 個(gè)平行樣， 平均分為2 組， 每組6 個(gè)樣品。 分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液， 一組加標(biāo)濃度為0.5 mg/kg， 另一組加標(biāo)濃度為1.0 mg/kg。

二、 結(jié)果與分析

（一） 一步式QuEChERS 和傳統(tǒng)QuEChERS比較以西葫蘆作為簡單基質(zhì)， 青菜作為復(fù)雜基質(zhì)， 在添加水平為0.5 mg/kg 時(shí)， 比較了一步式QuEChERS 方法（簡稱本方法）和GB 23200.113-2018 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》 中的傳統(tǒng)QuEChERS 方法（簡稱傳統(tǒng)方法）對10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥回收率的影響， 結(jié)果見表2。 由表2 可知， 對于簡單基質(zhì)， 本方法的回收率范圍為84%～94%， GB 23200.113-2018 標(biāo)準(zhǔn)方法的回收率范圍為88%～98%， RSD 均≤6%；對于復(fù)雜基質(zhì)， 本方法的回收率范圍為71%～111%， GB 23200.113-2018 標(biāo)準(zhǔn)方法的回收率范圍為74%～100%， RSD 均小于10%， 滿足實(shí)際檢測要求。 兩種方法的回收率差異較小， 準(zhǔn)確度也基本一致。 但與傳統(tǒng)方法相比， 本方法不需借助其他輔助儀器， 前處理時(shí)間可控制在10 min 以內(nèi)，比標(biāo)準(zhǔn)方法更方便， 用時(shí)更短。 由此可見， 一步式QuEChERS 方法可以在較短的時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地完成蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的提取凈化前處理。

表2 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的線性方程、 相關(guān)系數(shù)、 檢出限

（二） 固定相的選擇HPTLC 采用粒度分布很窄的微粒硅劑 （5～10 μm） 制備高效薄層板， 靈敏度和分辨率大大提高。 通常分辨率與吸附劑微粒半徑的平方成反比， 涂層厚度為0.2～0.25 mm， 硅膠粉粒度為 （8±2）μm。 展開速度與吸附劑顆粒半徑成正比， 故顆粒越小， 展開速度越慢， 但在分離效率提高了之后可以大大縮短展開距離。

本研究選擇具有熒光背景的薄層板作為固定相進(jìn)行分析， 在紫外燈照射下， 目標(biāo)條帶會在薄層板上猝滅形成黑斑， 無需顯色劑顯色[18]。 實(shí)驗(yàn)分別比較了3 種不同的高效薄層板（硅膠板、 中性氧化鋁板和堿性氧化鋁板） 的分離效果， 經(jīng)展開劑上行展開后， 在254 nm 紫外燈下觀察， 不同固定相分離結(jié)果見圖1。 結(jié)果表明， 采用高效薄層硅膠板分離后斑點(diǎn)集中， 分離效果明顯， 而采用中性氧化鋁板和堿性氧化鋁板斑點(diǎn)分離不明顯。 因此， 選擇高效薄層硅膠板作為固定相開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同固定相的分離效果對比

（三） 展開劑的優(yōu)化為使得待測組分的Rf值在0.2～0.8 之間， 同時(shí)考慮擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的溶解性， 以弱極性溶劑環(huán)己烷為基礎(chǔ)體系， 加入丙酮、 乙酸乙酯、 三氯甲烷作為調(diào)節(jié)試劑來調(diào)節(jié)展開系統(tǒng)的極性。 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 甲氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯性質(zhì)相近，Rf值大小相近， 較難實(shí)現(xiàn)分離， 而其他幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥Rf值都有較大差異。 所以以分離甲氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯為主要目標(biāo)， 比較了3 種調(diào)節(jié)試劑的分離效果，基礎(chǔ)溶劑與調(diào)節(jié)劑的配比均為9∶1 （V∶V）， 結(jié)果見圖2。 結(jié)果表明， 3 種展開系統(tǒng)斑點(diǎn)都較為清晰，其中采用環(huán)己烷-乙酸乙酯作為展開系統(tǒng)時(shí)， 氯氰菊酯和氰戊菊酯斑點(diǎn)較近且混標(biāo)斑點(diǎn)中兩者重合，未有效分離； 經(jīng)環(huán)己烷-丙酮、 環(huán)己烷-三氯甲烷兩種展開系統(tǒng)展開后， 氯氰菊酯和氰戊菊酯斑點(diǎn)有一定距離， 分離效果較好。

圖2 不同展開系統(tǒng)的分離效果對比

對三氯甲烷、 環(huán)己烷、 丙酮等展開劑進(jìn)行不同配比， 經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)， 得出兩種較為理想的復(fù)合展開劑， 分別是展開劑1 （三氯甲烷-環(huán)己烷， 10∶1，V∶V） 和展開劑2 （環(huán)己烷-丙酮， 9∶1.5，V∶V），分離效果見圖3。 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)斑點(diǎn)規(guī)整且分離明顯， 表明展開劑對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測結(jié)果無明顯干擾， 分離效果佳。 實(shí)際檢測中可利用展開劑2 對展開劑1 得到的分析結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)， 避免假陽性的出現(xiàn)。 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按表1 中分組進(jìn)行配制， 得到5 組混標(biāo)， 混標(biāo)經(jīng)展開劑1 和展開劑2 的展開效果見圖4。 如圖4 表示， 1～5 組混標(biāo)可兩兩分離且在兩種展開劑下得到的展開距離各不相同， 得到兩組不同的Rf值； 同組混標(biāo)中的兩種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在展開劑1 下的展開距離差值相較于展開劑2 下的差值更小， 因而可通過在兩種不同展開劑下的差異進(jìn)行二次分析來提高定性的準(zhǔn)確度。

圖3 不同展開劑的薄層色譜圖

圖4 5 組混標(biāo)的薄層色譜圖

（四） 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限以青菜為基質(zhì)， 采用基質(zhì)配標(biāo)的方式考察了添加不同梯度濃度的10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性范圍 （0.5、0.8、 1.2、 1.5、 2.0 mg/kg） 和檢出限。 以甲氰菊酯和氟胺氰菊酯為例， 線性濃度范圍內(nèi)的甲氰菊酯和氟胺氰菊酯的展開效果見圖5。 由圖5 可知， 樣品通過前處理之后， 展開區(qū)基本不存在影響結(jié)果判定的雜質(zhì)斑點(diǎn)， 雜質(zhì)都集中在薄層板點(diǎn)樣點(diǎn)的最上部。

圖5 甲氰菊酯和氟胺氰菊酯基質(zhì)加標(biāo)溶液的薄層色譜圖

在0.5～2.0 mg/kg 線性范圍內(nèi)， 以10 種農(nóng)藥的添加濃度與對應(yīng)的積分值進(jìn)行線性回歸分析， 結(jié)果見表2。 由表2 可知， 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù)均大于0.96， 檢出限均為0.5 mg/kg。

（五） 準(zhǔn)確度和精密度以加標(biāo)回收率和RSD分別表征準(zhǔn)確度和精密度， 在1 倍檢出限和2 倍檢出限的添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)， 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見表3。 結(jié)果表明， 10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在蔬菜中的平均回收率在91.0%～123.4%之間，RSD 在7.7%～15.4%之間， 所建方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 方法的準(zhǔn)確度和精密度（n＝6）

（六） 靈敏度與特異性靈敏度以方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到實(shí)際檢出限時(shí)， 檢出陽性結(jié)果的陽性樣品數(shù)占總陽性樣品數(shù)的百分比表示； 特異性以方法在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到實(shí)際檢出限時(shí)， 檢出陰性結(jié)果的陰性樣品數(shù)占總陰性樣品數(shù)的百分比表示。 本研究所建方法對10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測靈敏度和特異性考察結(jié)果見表4。 如表4 所示， 靈敏度均大于95%， 特異性均大于94%， 假陰性率均低于5%， 假陽性率均低于6%， 符合一般快速檢測產(chǎn)品技術(shù)評價(jià)要求。

表4 方法的靈敏度和特異性（%）

三、 結(jié)論

本研究基于改良的QuEChERS 前處理技術(shù)和高效薄層色譜法， 建立了蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的快速檢測方法， 將一步式QuEChERS 方法成功應(yīng)用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥快速檢測。 方法學(xué)考察結(jié)果表明， 方法在0.5～2.0 mg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 準(zhǔn)確度、 精密度、 靈敏度和特異性等方面均能滿足分析要求， 可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品同時(shí)檢測，耗時(shí)短， 分析效率高， 45 min 內(nèi)可檢測8 個(gè)樣品。且方法在色譜展開過程中所用的有機(jī)溶劑少， 分析成本低， 環(huán)境污染小， 適合各基層推廣應(yīng)用。

本文引用格式： 高猛峰， 張維誼， 梅博， 等.QuEChERS-高效薄層色譜法測定蔬菜中10 種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2023 （5）： 55-60.

GAO Mengfeng， ZHANG Weiyi， MEI Bo，et al.Simultaneous determination of ten pyrethroid pesticides in vegetables by QuEChERS coupled with high performance thin layer chromatography［J］.Quality and Safety of Agro-products， 2023 （5）： 55-60.