張 艷 王全勝 徐 峰 吳銀良

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 寧波市特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315040）

莫奈太爾 （Monepantel）， 是諾華動(dòng)物保健公司研發(fā)的一種新型氨基乙腈衍生物類驅(qū)蟲藥[1]， 在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)快速吸收并氧化為莫奈太爾亞砜， 莫奈太爾亞砜又進(jìn)一步被氧化為莫奈太爾砜。 2009 年9月， 該藥在歐盟批準(zhǔn)上市， 用于治療和控制羊腸道蠕蟲感染。 2020 年11 月， 該藥被我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許在動(dòng)物生產(chǎn)中使用， 并發(fā)布了試行的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[2]。 2022 年9 月發(fā)布的GB 31650.1-2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41 種獸藥最大殘留限量》 正式規(guī)定了牛肉和綿羊肉中莫奈太爾的最大殘留限量分別為300 μg/kg 和500 μg/kg[3]， 殘留標(biāo)志物為莫奈太爾砜。 為保障動(dòng)物性食品安全， 有必要開展動(dòng)物性食品中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的分析方法研究， 建立相關(guān)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)于生物樣品中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物分析，儀器方法主要為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4～8]， 涉及的樣品種類主要有羊肉、 牛羊奶及奶制品。 已建立的前處理手段主要有液液萃取凈化[6，8]、 固相萃取凈化[5，7]以及分散固相萃取凈化[4]。 其中， 液液萃取凈化不僅耗時(shí)， 且有機(jī)溶劑用量大； 固相萃取凈化過程需活化、 淋洗等步驟， 相對(duì)也較耗時(shí)； 分散固相萃取凈化雖然簡(jiǎn)單， 但凈化后凈化液仍需氮吹和溶劑置換。 Captiva EMR-Lipid 通過型固相萃取柱（簡(jiǎn)稱EMR 小柱）， 可通過體積排阻和疏水作用吸附脂類等長鏈物質(zhì)達(dá)到凈化目的， 且使用時(shí)無活化和淋洗步驟， 因此建立的固相萃取過程非常簡(jiǎn)單，同時(shí)有機(jī)溶劑用量更少， 現(xiàn)已經(jīng)成功在動(dòng)物性食品的藥物殘留分析領(lǐng)域得到應(yīng)用[9～13]。 本研究擬利用EMR 小柱建立無需活化淋洗步驟的固相萃取凈化前處理方法， 并利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的殘留量進(jìn)行分析， 旨在為動(dòng)物性食品中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物殘留量分析提供監(jiān)控手段。

一、 材料與方法

（一） 儀器Acquity UPLC-XevoTMTQ MS 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 （美國Waters 公司）；Sigma 3K15 高速離心機(jī) （美國Sigma 公司）；BS124S 分析天平（精度為0.01 mg， 北京賽多利斯儀器公司）； 電子天平 （精度為0.01 g， 瑞士梅特勒-托利多公司）； VORTEX 3 型渦旋混勻器 （德國IKA 公司）； T25 型高速勻質(zhì)器 （德國IKA 公司）； Milli-Q 純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）； 24管固相萃取裝置（美國Supelco 公司）。

（二） 材料與試劑EMR 固相萃取小柱 （300 mg/3 mL， 美國Agilent 公司）； 0.22 μm 有機(jī)相濾膜 （北京迪科馬科技有限公司）； 乙腈 （色譜純，美國Fisher 公司）； 甲酸 （色譜純， 美國Tedia 公司）； 莫奈太爾、 莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥99.0%， 德國WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH 公司）。 牛羊肉空白樣品均購于本地超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

（三） 試驗(yàn)方法

1.樣品提取凈化。 準(zhǔn)確稱取試樣2.0 g 于50 mL 離心管中， 加入10 mL 乙腈， 然后以10 000 r/min 以上的速度均質(zhì)60 s， 蓋蓋后以9 500 r/min的速度離心2 min， 移取上清液3 mL， 以1～2 mL/min 流速過EMR 小柱， 流出液收集于5 mL 試管中。 準(zhǔn)確移取流出液0.5 mL， 用0.1%甲酸溶液稀釋至1.0 mL， 渦旋混勻， 過0.22 μm 濾膜后進(jìn)行儀器分析。

2.儀器條件。 色譜條件： 采用Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm） 分離。 流動(dòng)相： 0.1%甲酸溶液 （A 相）， 乙腈 （B 相）。 柱溫35℃， 進(jìn)樣量10 μL。 梯度洗脫程序： 0～0.5 min，50%B； 0.5～2.5 min， 50%B～90%B； 2.5～3.5 min，90%B； 3.5～3.6 min， 90%B～50%B； 3.6～5.0 min，50%B。

質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源負(fù)離子模式； 多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM） 模式； 毛細(xì)管電壓2.9 kV； 離子源溫度150℃； 脫溶劑氣溫度500℃； 錐孔氣流速50 L/h； 脫溶劑氣流速1 000 L/h； 倍增器電壓650 V；二級(jí)碰撞氣為氬氣； 其他質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

二、 結(jié)果與討論

（一） 儀器條件優(yōu)化已有研究顯示， 莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜分析時(shí)母離子通常選擇[M+H]-，相關(guān)化合物易脫氫形成母離子， 因此離子源模式常采用負(fù)離子模式[4～8]。 本研究利用1 000 μg/L 的莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件參數(shù)優(yōu)化， 發(fā)現(xiàn)莫奈太爾、 莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜形成的母離子[M+H]-峰度分別約為[M+H]+峰度的2倍、 10 倍和30 倍左右， 因此在負(fù)離子模式下優(yōu)化得到表1 中的質(zhì)譜參數(shù)， 所選擇的子離子與相關(guān)研究文獻(xiàn)[4，6～8]報(bào)道的基本一致。

此外， 利用色譜柱BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 按照上文方法中的梯度條件， 考察了0.1%甲酸溶液、 5 mmol/L 乙酸銨溶液和5 mmol/L乙酸銨溶液 （含0.1%甲酸） 分別作為水相與有機(jī)相甲醇或乙腈組合時(shí)， 標(biāo)準(zhǔn)溶液中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的出峰和響應(yīng)情況， 結(jié)果見圖1。 從圖1 中可知， 6 種體系下3 種化合物出峰峰形均較好， 且當(dāng)水相中含有甲酸時(shí)， 3 種化合物的響應(yīng)均較好；當(dāng)水相為5 mmol/L 乙酸銨溶液時(shí)， 莫奈太爾和莫奈太爾亞砜響應(yīng)明顯低于水相中含有0.1%甲酸時(shí)的響應(yīng)， 但莫奈太爾砜響應(yīng)略高； 當(dāng)水相為5 mmol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸） 且有機(jī)相為乙腈時(shí)， 莫奈太爾和莫奈太爾亞砜的響應(yīng)明顯高于有機(jī)相為甲醇時(shí)兩者的響應(yīng)， 而莫奈太爾砜響應(yīng)差異較小。 總體來看， 0.1%甲酸溶液-乙腈條件下響應(yīng)最佳， 這與吳映璇等[8]的研究結(jié)果不太一致， 其實(shí)驗(yàn)顯示甲醇作為有機(jī)相時(shí)莫奈太爾及其代謝物的響應(yīng)優(yōu)于乙腈， 造成不同的原因可能是色譜柱及洗脫梯度不同。

（二） 提取凈化條件優(yōu)化目前已建立的動(dòng)物性食品中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物分析方法中提取溶劑均為乙腈[4，6～8]。 考慮此情況， 本研究對(duì)添加有1 000 μg/kg 的牛肉樣品， 比較了不同乙腈提取體積 （5、 7.5、 10、 12.5 mL） 下1 次提取的提取回收率， 結(jié)果見圖2。 從圖2 中可見， 隨著乙腈體積的增加， 莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的提取回收率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)， 且當(dāng)提取體積為10 mL 時(shí)， 3 種化合物1 次提取的回收率均達(dá)到93.0%以上， 因此本研究選擇乙腈作為提取溶劑， 用量為10 mL。

圖2 不同體積乙腈對(duì)牛肉中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物提取效果的影響

同時(shí)， 本研究嘗試?yán)肊MR 小柱建立莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的固相萃取凈化方法， 比較了不同體積（2.0、 5.0 mL 和全部提取液） 上柱對(duì)回收率及基質(zhì)效應(yīng) （Matrix effect，ME） 的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，不同體積下3 種化合物的回收率范圍均在93.4%～101.2%之間， 回收率區(qū)別均較小， 同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)均不明顯， 因此， 為節(jié)約時(shí)間， 采用2.0 mL 提取液上樣。 與已有研究建立的凈化方法相比[4，6～8]， 該凈化方法操作非常簡(jiǎn)單快速， 整個(gè)過程僅1～2 min， 不僅比傳統(tǒng)的固相萃取方法和液液萃取方法方便快速， 而且比KINSELLA 等[4]建立的QuECh-ERS 方法 （凈化后樣品離心就需要10 min） 也要方便快速。

（三） 方法學(xué)考察

1.方法的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)。 動(dòng)物產(chǎn)品本底復(fù)雜，當(dāng)采用電噴霧離子源分析時(shí)易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。 通常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)， 當(dāng)比值在0.8～1.2 之間時(shí)認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯[14]。 本研究配制0.25、 0.50、2.00、 5.00、 20.00、 50.00、 100.00 μg/L 溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液， 以及相應(yīng)濃度的牛羊肉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線以評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)， 結(jié)果見表2。 從表2 可知， 3 種化合物對(duì)應(yīng)的斜率比值在0.95～1.02 之間， 基質(zhì)效應(yīng)不明顯。 為定量方便， 本研究采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

表2 溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和牛羊肉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、 相關(guān)系數(shù)及斜率比值

2.線性范圍。 配制0.25、 0.50、 2.00、 5.00、20.00、 50.00、 100.00 μg/L 溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。 以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)， 定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到表2 中的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)， 相關(guān)系數(shù)（r2）均高于0.999。 由結(jié)果可見， 3 種化合物在0.25～100.00 μg/L 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.回收率和精密度。 取空白牛肉和羊肉樣品，每天添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制4 個(gè)添加濃度水平［5、 150、 300、 600 μg/kg （牛肉）； 5、 250、 500、1 000 μg/kg （羊肉）］ 的樣品， 每個(gè)濃度6 個(gè)樣品進(jìn)行試驗(yàn)， 連續(xù)3 d 重復(fù)測(cè)定分析， 結(jié)果見表3。從表3 中可知， 莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的平均回收率均在84.9%～93.5%之間， 批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 平均值和批間RSD 在2.6%～6.4%范圍內(nèi)。 方法平均回收率的變動(dòng)范圍僅8.6%， 明顯小于已建立方法最少17.9%的變化范圍[4，6～8]， 可見方法不僅準(zhǔn)確性好， 整體穩(wěn)定性也較好， 這應(yīng)該與方法前處理簡(jiǎn)單存在較強(qiáng)關(guān)系。 牛肉空白和添加樣品色譜圖見圖3。

圖3 牛肉空白樣品和添加樣品MRM 色譜圖

表3 牛羊肉中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的平均回收率和精密度（n＝18）

4.檢測(cè)限和定量限。 按3 倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限（LOD） 和10 倍信噪比計(jì)算定量限 （LOQ）， 莫奈太爾、 莫奈太爾亞砜、 莫奈太爾砜在牛羊肉中的LOD 依次為0.15、 0.12、 0.06 μg/kg， LOQ 依次為0.50、 0.40、 0.20 μg/kg。 方法定量限優(yōu)于吳映璇等[6～8]建立的奶及乳制品中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的定量限（2.0 μg/kg）。

5.實(shí)際樣品測(cè)定。 利用所建立的方法測(cè)定了購自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市的15 個(gè)牛肉樣品和7 個(gè)羊肉樣品， 均未發(fā)現(xiàn)有莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物的檢出。

三、 結(jié)論

通過儀器條件和前處理?xiàng)l件優(yōu)化首次建立了牛羊肉中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物殘留量分析的通過型固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。 樣品采用乙腈提取， 莫奈太爾、 莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的提取回收率均能達(dá)到93.0%以上； 所建立的EMR 固相萃取凈化步驟簡(jiǎn)單快速， 用時(shí)僅1～2 min 左右。方法準(zhǔn)確度好、 靈敏度高， 為動(dòng)物性食品中監(jiān)測(cè)莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物提供了一種有效的技術(shù)手段。

本文引用格式： 張艷， 王全勝， 徐峰， 等.通過型固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定牛羊肉中莫奈太爾及其代謝產(chǎn)物 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2023 （5）： 50-54.

ZHANG Yan， WANG Quansheng， XU Feng，et al.Rapid determination of monepantel and its metabolites in bovine and ovine muscles by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with pass-through solid phase extraction ［J］.Quality and Safety of Agroproducts， 2023 （5）： 50-54.